極端嗜熱酸性α-淀粉酶PFA在枯草芽孢桿菌中的高效分泌表達(dá)

袁 林，曾 靜*，郭建軍，郭 浩，楊 罡，陳 俊

（江西省科學(xué)院微生物研究所，江西 南昌 330096）

來(lái)源于極端嗜熱微生物的極端嗜熱酶具有優(yōu)良的熱穩(wěn)定性和高溫催化活性，對(duì)有機(jī)溶劑、去污劑、變性劑等具有很強(qiáng)的耐受性[1-3]。極端嗜熱酶作為生物催化劑參與高溫反應(yīng)具有提高反應(yīng)速率和產(chǎn)率、防止常溫微生物的污染、減少能耗等優(yōu)點(diǎn)，因此極端嗜熱酶廣泛應(yīng)用于工業(yè)領(lǐng)域和生物技術(shù)領(lǐng)域[4-5]。極端嗜熱酸性α-淀粉酶具有反應(yīng)溫度高、熱穩(wěn)定性好、酸性條件下酶活力高等優(yōu)點(diǎn)，能夠克服淀粉液化工藝的主要缺點(diǎn)，如pH值的反復(fù)調(diào)節(jié)、高溫條件下淀粉酶活力的喪失以及隨之而產(chǎn)生的溫度調(diào)節(jié)等工藝，從而簡(jiǎn)化淀粉液化工藝流程、避免pH值的反復(fù)調(diào)節(jié)、降低能耗[6-12]。因此極端嗜熱酸性α-淀粉酶在淀粉液化工藝中具有巨大的應(yīng)用潛力。

極端嗜熱微生物是極端嗜熱酸性α-淀粉酶的直接來(lái)源。但是極端嗜熱微生物的培養(yǎng)條件嚴(yán)格，如其最適生長(zhǎng)溫度在80 ℃以上，大多數(shù)極端嗜熱微生物是嚴(yán)格厭氧的，并且極端嗜熱微生物的產(chǎn)酶量低，因此直接從極端嗜熱微生物中分離獲得大量極端嗜熱酸性α-淀粉酶是較為困難的[3-4]。這限制了極端嗜熱酸性α-淀粉酶在淀粉液化工藝中的應(yīng)用。因此采用基因工程和蛋白質(zhì)工程方法將極端嗜熱酸性α-淀粉酶的基因進(jìn)行克隆并將其在常溫宿主中進(jìn)行表達(dá)，從而獲得適用于淀粉液化工藝的極端嗜熱酸性α-淀粉酶具有重要的應(yīng)用價(jià)值?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis）作為傳統(tǒng)的工業(yè)生產(chǎn)菌株，具有分泌能力強(qiáng)、培養(yǎng)條件和基因操作簡(jiǎn)單、發(fā)酵工藝成熟等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是理想的外源蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)宿主菌[13-14]。外源蛋白質(zhì)在枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的分泌表達(dá)依賴(lài)于枯草芽孢桿菌信號(hào)肽的引導(dǎo)，并且信號(hào)肽與外源蛋白質(zhì)之間存在適配性[15]。因此針對(duì)特定的蛋白質(zhì)需要選擇合適的信號(hào)肽來(lái)實(shí)現(xiàn)有效的分泌表達(dá)。

來(lái)源于極端嗜熱古生菌（Pyrococcus furiosus）的極端嗜熱酸性α-淀粉酶PFA是目前已知的熱穩(wěn)定性最好的α-淀粉酶。PFA的最適反應(yīng)溫度高達(dá)100 ℃，最適反應(yīng)pH值為5.0，在未補(bǔ)加Ca2＋的條件下于98 ℃的半衰期長(zhǎng)達(dá)13 h，并且其熱穩(wěn)定性和高溫活性均不依賴(lài)于Ca2＋[16-17]。鑒于PFA的優(yōu)良酶學(xué)性質(zhì)，其在淀粉液化工藝中具有巨大的應(yīng)用潛力，大量獲得PFA是其應(yīng)用于淀粉液化工藝的前提條件。為探索極端嗜熱酸性α-淀粉酶PFA在枯草芽孢桿菌WB600中的高效分泌表達(dá)條件，本研究根據(jù)來(lái)源于枯草芽孢桿菌的9 種結(jié)構(gòu)特征不同的Sec分泌途徑信號(hào)肽進(jìn)行篩選，以獲得引導(dǎo)PFA高效分泌表達(dá)的信號(hào)肽。在此基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步優(yōu)化PFA的分泌表達(dá)，對(duì)篩選得到的信號(hào)肽進(jìn)行突變，通過(guò)比較不同信號(hào)肽突變體的引導(dǎo)分泌效率，獲得引導(dǎo)分泌效率最優(yōu)的信號(hào)肽突變體，從而實(shí)現(xiàn)PFA在枯草芽孢桿菌中高效分泌表達(dá)的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌JM109、枯草芽孢桿菌WB600、枯草芽孢桿菌表達(dá)載體pSTOP1622均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

大腸桿菌JM109和枯草芽孢桿菌WB600的培養(yǎng)均采用LB培養(yǎng)基。

1.1.3 試劑

KOD DNA聚合酶及KOD-Plus-neo DNA聚合酶日本Toyobo公司；DNA限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker 美國(guó)Fermentase公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒E.Z.N.A. 美國(guó)Omega Bio-Tek公司；Chelating SepharoseTMFast Flow 美國(guó)GE Healthcare公司；Gibson Assembly Master Mix 美國(guó)NEB公司；Bradford法蛋白濃度測(cè)定試劑盒 上海生工生物工程股份有限公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純；基因合成由上海博益生物科技有限公司完成；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction）引物合成和測(cè)序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 儀器與設(shè)備

Mastercycler gradient PCR儀 美國(guó)Eppendorf公司；TY04S-3C凝膠成像系統(tǒng) 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；SP-752PC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；SCIENTZ-IID超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；MicroPulser電穿孔儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 分子克隆技術(shù)和表達(dá)產(chǎn)物的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析

分子克隆技術(shù)和表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析參照文獻(xiàn)[18]進(jìn)行。

1.3.2 重組質(zhì)粒pSTOP1622-pfa的構(gòu)建及鑒定

α-淀粉酶PFA基因pfa由上海博益生物科技有限公司合成。設(shè)計(jì)引物P1和P2對(duì)基因pfa進(jìn)行PCR擴(kuò)增（表1）。PCR擴(kuò)增條件為：98 ℃ 5 min；98 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，74 ℃ 2 min，30 個(gè)循環(huán)；74 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)BglII和KpnI雙酶切，連接至載體pSTOP1622，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSTOP1622-pfa。采用BglII和KpnI雙酶切質(zhì)粒鑒定是否有外源基因的插入。

表1 構(gòu)建重組質(zhì)粒所用引物Table 1 Primer sequences for the construction of recombinant plasmids

1.3.3 信號(hào)肽篩選載體的構(gòu)建與鑒定

根據(jù)PFA的基因序列設(shè)計(jì)PCR引物P3（表1），以合成基因pfa為模板，以P3、P2為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得不含信號(hào)肽的結(jié)構(gòu)基因pfads。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)BglII和KpnI雙酶切，連接至載體pSTOP1622，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSTOP1622-pfads。并采用BglII和KpnI雙酶切質(zhì)粒鑒定是否有外源基因的插入。

采用NEB公司的Gibson Assembly Master Mix構(gòu)建包含枯草芽孢桿菌信號(hào)肽（表2）和重組載體pSTOP1622-pfads的信號(hào)肽篩選載體。所需引物（表1中P4和P5）按照該產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行設(shè)計(jì)，PCR等相關(guān)操作按照該產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。具體操作如下：以pSTOP1622-pfads為模板，采用引物P4、P5（表1），進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到載體片段；PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 20 s，68 ℃ 4 min，35 個(gè)循環(huán)；68 ℃ 10 min。在NCBI網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）查詢(xún)表2中信號(hào)肽的核苷酸序列，采用化學(xué)全合成方法分別合成包含同源臂和信號(hào)肽核苷酸序列的DNA片段（5’-CAAACTAGTTCGAAGATCT-信號(hào)肽核苷酸序列-AAGCTCCAAGTATTTTGC-3’）。PCR擴(kuò)增得到的載體片段分別與不同的DNA片段混合，采用Gibson Assembly Master Mix進(jìn)行無(wú)縫克隆，獲得包含不同信號(hào)肽的信號(hào)肽篩選載體。以信號(hào)肽篩選載體為模板，采用引物P6、P7（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得包含信號(hào)肽核苷酸序列的約500 bp的DNA片段。將DNA片段送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，并與對(duì)應(yīng)信號(hào)肽基因序列進(jìn)行比對(duì)確認(rèn)。

表2 篩選信號(hào)肽的特征說(shuō)明Table 2 Characteristics of different signal peptides

1.3.4 信號(hào)肽YfkN的突變

根據(jù)點(diǎn)突變?cè)噭┖械恼f(shuō)明，結(jié)合信號(hào)肽YfkN的核苷酸序列和擬突變的氨基酸位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，如表3所示。以信號(hào)肽篩選載體pSTOP1622-YfkN-pfads為模板，采用表3中引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到包含載體序列和基因序列的線性片段。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 20 s，68 ℃ 5 min，35 個(gè)循環(huán)；68 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DpnI酶處理后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，氨芐青霉素抗性平板篩選轉(zhuǎn)化子，測(cè)序鑒定是否為突變基因。

表3 信號(hào)肽YfkN突變所用引物Table 3 Primer sequences used for the mutagenesis of signal peptide YfkN

續(xù)表3

1.3.5 枯草芽孢桿菌WB600感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化

枯草芽孢桿菌WB600感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化采用改進(jìn)的Spizizen法[19]進(jìn)行。

1.3.6 重組α-淀粉酶的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

接種重組枯草芽孢桿菌單克隆到LB液體培養(yǎng)基中，用250 mL三角瓶進(jìn)行培養(yǎng)，其中培養(yǎng)基的裝液量為20 mL，培養(yǎng)溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min，培養(yǎng)時(shí)間為10 h。然后轉(zhuǎn)接該培養(yǎng)物于新鮮LB液體培養(yǎng)基中，用250 mL三角瓶進(jìn)行培養(yǎng)，其中培養(yǎng)基的裝液量為25 mL，接種量為3%，培養(yǎng)溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min。當(dāng)培養(yǎng)至菌體OD600nm達(dá)到1時(shí)，添加終質(zhì)量濃度為0.5 g/100 mL的木糖，誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)重組蛋白質(zhì)，誘導(dǎo)時(shí)間為30 h。待發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定發(fā)酵上清液和重組枯草芽孢桿菌胞內(nèi)的α-淀粉酶活力，分析表達(dá)情況。

采用Ni2＋親和層析柱對(duì)發(fā)酵上清液中目的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，用200 mmol/L咪唑洗脫緩沖液洗脫，即得到純化后的重組α-淀粉酶。利用SDS-PAGE檢測(cè)重組α-淀粉酶的純度，并采用Bradford法[20]測(cè)定重組α-淀粉酶含量。

1.3.7 α-淀粉酶活力測(cè)定

將10 μL酶液與490 μL含1 g/100 mL可溶性淀粉的50 mmol/L MES，pH 5.0緩沖液混合，于95 ℃反應(yīng)30 min后，迅速放入冰水浴中終止反應(yīng)，然后采用3,5-二硝基水楊酸法[21]測(cè)定反應(yīng)體系中還原糖量。酶活力單位定義：在一定反應(yīng)條件下，每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol還原糖的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.8 α-淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

按照上述反應(yīng)體系混合酶液和底物，分別于40～130 ℃反應(yīng)30 min，測(cè)定不同溫度下絕對(duì)酶活力，并以絕對(duì)酶活力對(duì)時(shí)間作圖，確定其最適反應(yīng)溫度。

將酶液與不同pH值的1 g/100 mL可溶性淀粉溶液混合，于95 ℃進(jìn)行酶活力測(cè)定。采用不同緩沖液配制不同pH值的1 g/100 mL可溶性淀粉溶液：50 mmol/L MES（pH 4.0～7.0）、50 mmol/L MOPS（pH 7.0～9.0）。

將酶液于100 ℃保溫，分時(shí)間梯度取出部分樣品，根據(jù)如上反應(yīng)體系測(cè)定酶活力。將未處理酶液的酶活力定義為100%，并以相對(duì)酶活力對(duì)時(shí)間作圖，評(píng)價(jià)酶的熱穩(wěn)定性。

以上α-淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)研究中均設(shè)置α-淀粉酶和補(bǔ)加5 mmol/L Ca2＋的α-淀粉酶作為實(shí)驗(yàn)組。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

α-淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)研究實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3 個(gè)平行。運(yùn)用軟件SigmaPlot 11.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖，數(shù)據(jù)均以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

采用化學(xué)合成法合成了極端嗜熱α-淀粉酶PFA的基因pfa，將基因pfa連接至載體pSTOP1622，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSTOP1622-pfa。以基因pfa為模板，采用PCR方法擴(kuò)增基因pfa中除去編碼信號(hào)肽的基因序列的基因片段pfads，并連接至載體pSTOP1622，構(gòu)建質(zhì)粒pSTOP1622-pfads。采用限制性?xún)?nèi)切酶BglII和KpnI酶切質(zhì)粒pSTOP1622-pfads和pSTOP1622-pfa，得到大小分別約為6 000 bp和1 300 bp的兩個(gè)片段（圖1）。

圖1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig. 1 Identification of recombinant vectors by restriction enzyme digestion

2.2 信號(hào)肽篩選載體的PCR鑒定

采用Gibson Assembly Master Mix進(jìn)行無(wú)縫克隆，構(gòu)建包含不同枯草芽孢桿菌信號(hào)肽和重組載體pSTOP1622-pfads的信號(hào)肽篩選載體。以不同的信號(hào)肽篩選載體和陰性對(duì)照pSTOP1622為模板，采用表1中引物P6、P7進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擬獲得包含信號(hào)肽核苷酸序列和PFA部分編碼序列的約500 bp的DNA片段。如圖2所示，以陰性對(duì)照pSTOP1622為模板的反應(yīng)無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)，以信號(hào)肽篩選載體（pSTOP1622-pfa、pSTOP1622-BglC-pfads、pSTOP1622-YhfM-pfads、pSTOP1622-OppA-pfads、pSTOP1622-AprE-pfads、pSTOP1622-AmyE-pfads、pSTOP1622-Mpr-pfads、pSTOP1622-YfkN-pfads、pSTOP1622-Bpr-pfads、pSTOP1622-AbnA-pfads）為模板的反應(yīng)均有約500 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)。將擴(kuò)增得到的DNA片段送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果與對(duì)應(yīng)信號(hào)肽基因序列進(jìn)行了比對(duì)確認(rèn)（結(jié)果未顯示），證實(shí)各信號(hào)肽篩選載體均構(gòu)建成功。

圖2 信號(hào)肽篩選載體的PCR鑒定Fig. 2 PCR identification of signal peptide screening vectors

2.3 重組α-淀粉酶的誘導(dǎo)表達(dá)

將陰性對(duì)照pSTOP1622以及不同的信號(hào)肽篩選載體分別轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌WB600，獲得重組枯草芽孢桿菌并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。待表達(dá)完成后，分別收集發(fā)酵上清液和發(fā)酵菌體，測(cè)定發(fā)酵上清液和發(fā)酵菌體中α-淀粉酶活力，同時(shí)采用SDS-PAGE分析發(fā)酵上清液和發(fā)酵菌體中重組α-淀粉酶的表達(dá)情況。酶活力測(cè)定結(jié)果如圖3所示，α-淀粉酶PFA的信號(hào)肽PFA以及來(lái)源于枯草芽孢桿菌的信號(hào)肽BglC、YhfM、OppA、AprE、AmyE、Mpr、YfkN、Bpr、AbnA均能引導(dǎo)α-淀粉酶PFA分泌到發(fā)酵上清液中，其中信號(hào)肽YfkN優(yōu)于其他信號(hào)肽。相對(duì)于α-淀粉酶PFA的自身信號(hào)肽，使用信號(hào)肽YfkN后分泌表達(dá)量提高了約10 倍。此外，SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果（圖4）顯示，轉(zhuǎn)化了不同信號(hào)肽篩選載體的重組枯草芽孢桿菌的發(fā)酵上清液中有一條約45 kDa的蛋白質(zhì)條帶，且使用信號(hào)肽YfkN后發(fā)酵上清液中重組α-淀粉酶的表達(dá)量顯著提高；以上重組枯草芽孢桿菌的發(fā)酵菌體中能觀察到約48 kDa的蛋白質(zhì)條帶，這可能是未經(jīng)信號(hào)肽引導(dǎo)分泌至胞外而滯留在胞內(nèi)的蛋白質(zhì)前體物質(zhì)。轉(zhuǎn)化了陰性對(duì)照pSTOP1622的重組枯草芽孢桿菌的發(fā)酵上清液和發(fā)酵菌體中均未能檢測(cè)到對(duì)應(yīng)大小的蛋白質(zhì)條帶。SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果與酶活力檢測(cè)結(jié)果是相對(duì)應(yīng)的。

圖3 不同信號(hào)肽對(duì)酶活力的影響Fig. 3 Signal peptide dependence of α-amylase activity

圖4 重組α-淀粉酶的SDS-PAGE檢測(cè)圖Fig. 4 SDS-PAGE analysis of recombinant α-amylases

2.4 YfkN信號(hào)肽優(yōu)化對(duì)α-淀粉酶PFA分泌表達(dá)的影響

研究表明，枯草芽孢桿菌信號(hào)肽的組成結(jié)構(gòu)會(huì)影響其對(duì)蛋白質(zhì)的引導(dǎo)分泌效率，其中增加信號(hào)肽N端帶正電荷氨基酸數(shù)量可能提高蛋白質(zhì)的分泌效率[15]。本研究通過(guò)對(duì)信號(hào)肽YfkN的N端中不帶電荷氨基酸殘基Ile3和Gln4進(jìn)行飽和突變，并比較信號(hào)肽YfkN與其突變體對(duì)α-淀粉酶PFA的引導(dǎo)分泌效率確定YfkN信號(hào)肽優(yōu)化對(duì)α-淀粉酶PFA分泌表達(dá)的影響。

2.4.1 YfkN信號(hào)肽中Ile3的飽和突變對(duì)PFA分泌表達(dá)的影響

對(duì)信號(hào)肽YfkN的Ile3進(jìn)行飽和突變，獲得包含不同信號(hào)肽突變體的表達(dá)載體。將陰性對(duì)照pSTOP1622以及不同的表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌WB600，獲得重組枯草芽孢桿菌并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。待表達(dá)完成后，分別收集發(fā)酵上清液和發(fā)酵菌體，測(cè)定發(fā)酵上清液和發(fā)酵菌體中α-淀粉酶活力。酶活力測(cè)定結(jié)果如圖5所示，信號(hào)肽YfkN以及其Ile3的飽和突變體均能引導(dǎo)α-淀粉酶PFA分泌到發(fā)酵上清液中，并且信號(hào)肽突變體I3G優(yōu)于其他信號(hào)肽。使用信號(hào)肽突變體I3G后重組枯草芽孢桿菌的胞外α-淀粉酶活力由539.5 U/mL提高至578.5 U/mL。此外，酶活力測(cè)定結(jié)果也顯示信號(hào)肽突變體I3P、I3F、I3W、I3D、I3E、I3T、I3N、I3S、I3Q、I3Y、I3C、I3M的引導(dǎo)分泌效率明顯低于信號(hào)肽YfkN，這說(shuō)明以上氨基酸殘基的替換不利于信號(hào)肽引導(dǎo)α-淀粉酶PFA分泌至胞外。

圖5 不同信號(hào)肽對(duì)酶活力的影響Fig. 5 Signal peptide dependence of α-amylase activity

2.4.2 YfkN信號(hào)肽中Gln4的飽和突變對(duì)PFA分泌表達(dá)的影響

對(duì)信號(hào)肽YfkN的Gln4進(jìn)行飽和突變，獲得包含不同信號(hào)肽突變體的表達(dá)載體。將陰性對(duì)照pSTOP1622以及不同的表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌WB600，獲得重組枯草芽孢桿菌并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。待表達(dá)完成后，分別收集發(fā)酵上清液和發(fā)酵菌體，測(cè)定發(fā)酵上清液和發(fā)酵菌體中α-淀粉酶的活力。如圖6所示，信號(hào)肽YfkN以及其Gln4的飽和突變體均能引導(dǎo)α-淀粉酶PFA分泌到發(fā)酵上清液中，并且信號(hào)肽突變體Q4R優(yōu)于其他信號(hào)肽。使用信號(hào)肽突變體Q4R后重組枯草芽孢桿菌的胞外α-淀粉酶活力由539.5 U/mL提高至617.5 U/mL。此外，酶活力測(cè)定結(jié)果也顯示對(duì)于Gln4位點(diǎn)，采用氨基酸殘基Pro、Phe、Trp、Asp、Glu、Thr、Asn、Ser、Tyr進(jìn)行替換不利于信號(hào)肽引導(dǎo)α-淀粉酶PFA分泌至胞外。

圖6 不同信號(hào)肽對(duì)酶活力的影響Fig. 6 Signal peptide dependence of α-amylase activity

2.4.3 YfkN信號(hào)肽突變體對(duì)PFA分泌表達(dá)的影響

圖7 不同信號(hào)肽對(duì)酶活力的影響Fig. 7 Signal peptide dependence of α-amylase activity

圖8 重組α-淀粉酶的SDS-PAGE圖Fig. 8 SDS-PAGE analysis of recombinant α-amylases

將陰性對(duì)照pSTOP1622、質(zhì)粒pSTOP1622-YfkN-pfads、pSTOP1622-I3G-pfads、pSTOP1622-Q4R-pfads、pSTOP1622-I3G/Q4R-pfads分別轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌WB600，獲得重組枯草芽孢桿菌并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。待表達(dá)完成后，分別收集發(fā)酵上清液和發(fā)酵菌體，測(cè)定發(fā)酵上清液和發(fā)酵菌體中α-淀粉酶活力，同時(shí)采用SDSPAGE分析發(fā)酵上清液和發(fā)酵菌體中重組α-淀粉酶的表達(dá)情況。酶活力測(cè)定結(jié)果（圖7）表明，與信號(hào)肽YfkN相比，信號(hào)肽突變體I3G、Q4R和I3G/Q4R對(duì)α-淀粉酶PFA的引導(dǎo)分泌效率逐步提高。其中使用信號(hào)肽突變體I3G/Q4R后，重組枯草芽孢桿菌的胞外α-淀粉酶活力由539.5 U/mL提高至715 U/mL。此外，SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果（圖8）與酶活力檢測(cè)結(jié)果相一致，使用信號(hào)肽突變體I3G/Q4R后，α-淀粉酶PFA的胞外表達(dá)量更高。以上結(jié)果表明，采用氨基酸殘基Gly替換第3位Ile，并采用氨基酸殘基Arg替換第4位Gln，有利于信號(hào)肽引導(dǎo)α-淀粉酶PFA分泌到發(fā)酵上清液中。

2.5 重組α-淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.5.1 pH值對(duì)重組α-淀粉酶活力的影響

圖9 pH值對(duì)酶活力的影響Fig. 9 pH dependence of α-amylase activity

如圖9所示，對(duì)于不含Ca2＋和含有5 mmol/L Ca2＋的重組α-淀粉酶PFA，最適反應(yīng)pH值均約為5.0，于pH 4.0～6.0之間可保持60%以上的相對(duì)酶活力。即額外添加的Ca2＋不影響重組α-淀粉酶PFA的最適反應(yīng)pH值。

2.5.2 溫度對(duì)重組α-淀粉酶活力的影響

圖10 溫度對(duì)酶活力的影響Fig. 10 Temperature dependence of α-amylase activity

如圖10所示，PFA的最適反應(yīng)溫度為100 ℃，在此溫度下的絕對(duì)酶活力為3 820.64 U/mg；在額外補(bǔ)加5 mmol/L Ca2＋的情況下，PFA的最適反應(yīng)溫度為100 ℃，在此溫度下的絕對(duì)酶活力為3 860.18 U/mg。此外，在40～130 ℃之間，額外補(bǔ)加的Ca2＋幾乎不影響PFA的絕對(duì)酶活力。

2.5.3 重組α-淀粉酶的熱穩(wěn)定性

如圖11所示，在100 ℃條件下，重組α-淀粉酶PFA和含有5 mmol/L Ca2＋的重組α-淀粉酶PFA均具有較好的熱穩(wěn)定性，并且兩者于100 ℃的熱穩(wěn)定性基本一致。PFA和含有5 mmol/L Ca2＋的PFA于100 ℃的半衰期均約為13 h。

圖11 100 ℃重組α-淀粉酶的熱穩(wěn)定性Fig. 11 Thermal stability of α-amylases at 100 ℃

3 討 論

枯草芽孢桿菌是傳統(tǒng)的工業(yè)生產(chǎn)菌株，具有極強(qiáng)的蛋白質(zhì)表達(dá)和分泌能力[13-14]。將枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)如培養(yǎng)條件和基因操作簡(jiǎn)單、發(fā)酵工藝成熟等與其自身信號(hào)肽相結(jié)合，構(gòu)建外源蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)外源蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)，從而提高外源蛋白質(zhì)的可溶性，避免因形成包涵體以及隨之而來(lái)的復(fù)性和產(chǎn)物純化等困難[13-14]?，F(xiàn)有的研究表明來(lái)源于枯草芽孢桿菌的信號(hào)肽與外源蛋白質(zhì)之間存在適配性問(wèn)題[15]。對(duì)于同一種外源蛋白質(zhì)，不同信號(hào)肽的引導(dǎo)分泌效率相差較大。因此針對(duì)特定的外源蛋白質(zhì)需要選擇合適的信號(hào)肽來(lái)實(shí)現(xiàn)其有效的分泌表達(dá)。目前尚無(wú)法預(yù)測(cè)哪種信號(hào)肽能夠高效引導(dǎo)目的蛋白質(zhì)分泌到胞外，只能通過(guò)實(shí)驗(yàn)手段從大量信號(hào)肽中篩選得到高效引導(dǎo)目的蛋白質(zhì)分泌到胞外的信號(hào)肽[15]。Guan Chengran等[22]為提高氨基肽酶在枯草芽孢桿菌中的分泌效率，從含有19 種Sec分泌途徑的信號(hào)肽庫(kù)中篩選得到信號(hào)肽YncM。相對(duì)于氨基肽酶自身信號(hào)肽，信號(hào)肽YncM對(duì)氨基肽酶的引導(dǎo)分泌效率提高了1.2 倍。Zhang Weiwei等[23]通過(guò)篩選114 種來(lái)源于枯草芽孢桿菌的Sec途徑信號(hào)肽，獲得高效引導(dǎo)木聚糖酶分泌至胞外的信號(hào)肽PhoB。本研究為探索極端嗜熱酸性α-淀粉酶PFA在枯草芽孢桿菌WB600中的高效分泌表達(dá)條件，對(duì)來(lái)源于枯草芽孢桿菌的9 種結(jié)構(gòu)特征不同的Sec分泌途徑信號(hào)肽進(jìn)行篩選，并獲得引導(dǎo)PFA高效分泌表達(dá)的信號(hào)肽YfkN。與α-淀粉酶PFA的自身信號(hào)肽相比，使用信號(hào)肽YfkN后PFA的分泌表達(dá)量提高了約10 倍。

信號(hào)肽的結(jié)構(gòu)由N端、H段、C端構(gòu)成，其中N端由1～5 個(gè)帶正電荷的氨基酸組成、H段由7～15 個(gè)疏水性氨基酸組成、C端由3～7 個(gè)能被信號(hào)肽酶識(shí)別并切割的親水性氨基酸組成[24-25]。研究表明，信號(hào)肽的結(jié)構(gòu)如N端帶正電荷氨基酸數(shù)量、H段疏水性強(qiáng)弱、C端的氨基酸序列均影響信號(hào)肽的分泌效率，但并不能完全決定信號(hào)肽的分泌效率[24-25]。此外，外源蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)效率與多種因素相關(guān)，例如連接有不同信號(hào)肽的mRNA的穩(wěn)定性差異、蛋白質(zhì)前體與細(xì)胞膜的結(jié)合、蛋白質(zhì)跨膜過(guò)程中所涉及的分子伴侶以及異位復(fù)合物的有效性等[24-25]。Caspers等[26]通過(guò)研究枯草芽孢桿菌信號(hào)肽對(duì)來(lái)源于Fusarium solanipisi的角質(zhì)酶在枯草芽孢桿菌中分泌表達(dá)的影響發(fā)現(xiàn)，信號(hào)肽AmyE的N端帶正電荷氨基酸數(shù)量與其分泌表達(dá)效率并無(wú)正相關(guān)性，角質(zhì)酶在胞內(nèi)的合成效率與其分泌至胞外的分泌效率之間的動(dòng)態(tài)平衡是其高效分泌表達(dá)的關(guān)鍵。本研究通過(guò)對(duì)信號(hào)肽YfkN的N端中非正電荷氨基酸Ile3和Gln4進(jìn)行飽和突變，獲得了引導(dǎo)分泌效率更優(yōu)的突變體I3G/Q4R。本研究結(jié)果也表明信號(hào)肽YfkN的N端帶正電荷數(shù)量與其引導(dǎo)PFA的分泌效率并無(wú)正相關(guān)性。

本研究對(duì)信號(hào)肽YfkN進(jìn)行突變優(yōu)化，獲得了引導(dǎo)分泌效率更優(yōu)的信號(hào)肽突變體I3G/Q4R。使用了信號(hào)肽I3G/Q4R后，重組枯草芽孢桿菌的胞外α-淀粉酶活力高達(dá)715 U/mL。相對(duì)于α-淀粉酶PFA的自身信號(hào)肽，其分泌效率提高了約13 倍。根據(jù)前人研究結(jié)果，α-淀粉酶PFA已在不同的中溫原核表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)。其中，PFA在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行胞內(nèi)表達(dá)，胞內(nèi)α-淀粉酶活力約為195 U/mL[27-28]；PFA在枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中使用其自身的表達(dá)元件進(jìn)行胞外表達(dá)，胞外α-淀粉酶活力約為0.7 U/mL[17]；PFA在酵母表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行胞外表達(dá)，胞外α-淀粉酶活力約為220 U/mL[29]；PFA在經(jīng)遺傳修飾的解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens中進(jìn)行胞外表達(dá)，胞外α-淀粉酶活力約為2 000 U/mL[30]。本研究在傳統(tǒng)工業(yè)生產(chǎn)菌株枯草芽孢桿菌中，通過(guò)信號(hào)肽的篩選和信號(hào)肽優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)極端嗜熱酸性α-淀粉酶PFA的高效分泌表達(dá)。本研究所獲得的重組枯草芽孢桿菌的胞外α-淀粉酶活力與前人研究結(jié)果尚存在一定的差距，接下來(lái)工作可以通過(guò)優(yōu)化本研究所獲得的重組枯草芽孢桿菌的發(fā)酵條件進(jìn)一步提高胞外α-淀粉酶活力。此外，本研究于枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中所獲得的重組α-淀粉酶PFA的酶學(xué)性質(zhì)與原始菌Pyrococcus furiosus中獲得的α-淀粉酶PFA的酶學(xué)性質(zhì)基本一致：最適反應(yīng)pH值為5.0，最適反應(yīng)溫度為100 ℃，于100 ℃的半衰期長(zhǎng)達(dá)13 h，并且不依賴(lài)于Ca2＋。α-淀粉酶PFA的高溫活性、熱穩(wěn)定性以及酸性條件下酶活等酶學(xué)性質(zhì)能夠滿足淀粉液化工藝對(duì)α-淀粉酶的要求，在淀粉液化工藝中具有巨大的應(yīng)用潛力，本研究所獲得研究成果為其在淀粉液化工藝中的應(yīng)用提供了理論支持。