APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD小鼠腦內(nèi)淀粉樣斑塊與鐵沉積的磁敏感成像研究

劉浩蒂，鄭陽，王曉明

作者單位：

中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院放射科，沈陽 110004

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的主要病理改變是神經(jīng)細胞外Aβ蛋白聚集形成的淀粉樣斑塊和神經(jīng)元內(nèi)tau蛋白過度磷酸化聚集形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)。目前應(yīng)用MR技術(shù)在體顯示淀粉樣斑塊的技術(shù)主要分兩類，一類是應(yīng)用Aβ蛋白來標記對比劑，靶向結(jié)合淀粉樣斑塊對其進行顯影。有研究成功應(yīng)用Aβ1-40標記的釓噴酸葡胺顯示小鼠腦內(nèi)的淀粉樣斑塊[1]，但該技術(shù)的弊端是標記后的對比劑分子較大，必須破壞血腦屏障后才能進入腦組織，并且具有一定毒性，所以只用于動物實驗或是腦組織尸檢研究。另一類是通過探測淀粉樣斑塊內(nèi)及周圍的鐵沉積來顯示斑塊，并且通過定量分析鐵沉積來間接反映斑塊數(shù)量，這種技術(shù)可以敏感地探測到由鐵沉積造成的斑塊周圍弛豫信號改變，無需引入對比劑及破壞血腦屏障，可以直接進行活體顯像[2-3]。

目前，可用于定量檢測腦組織鐵含量的磁共振方法有探測弛豫信號變化的弛豫率增高信號(field-dependent R2 increase，F(xiàn)DRI)及探測相位信號變化的磁敏感技術(shù)等[4-8]。三維增強磁敏感成像(3D-enhanced susceptibility weighted angiography，ESWAN)是一種改良的磁敏感技術(shù)，它采用梯度回波的自由感應(yīng)衰減和回波采樣序列進行三維圖像采集，消除了水等異常信號對鐵沉積信號的影響，并且應(yīng)用了高通濾波等后處理技術(shù)，去除了由于場強不均造成的噪聲偽影，增強鐵沉積區(qū)域的相位改變，可以更敏感地探測到鐵信號[9]。本研究應(yīng)用ESWAN來探測小鼠腦內(nèi)鐵沉積，用平均相位值(mean phase value，MPV)表示，并研究其與鐵蛋白及淀粉樣斑塊分布的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 動物模型

APPswe/PSEN1de9基因突變型小鼠(購自美國Jackson Laboratory，簡稱為APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠，該轉(zhuǎn)基因小鼠由中國醫(yī)科大學(xué)實驗室購買，實驗室繁育，每一只小鼠確定攜帶基因后方進行MRI掃描及組織學(xué)檢測)及年齡匹配的非轉(zhuǎn)基因野生型小鼠(C57BL/6)各5只，均為雌性，按照6月齡、12月齡、18月齡分組。實驗動物麻醉采用腹腔內(nèi)注射異戊巴比妥鈉(2%戊巴比妥鈉40 mg/kg)，麻醉后進行MR成像及組織學(xué)檢測。

1.2 MR掃描

1.2.1 圖像采集

采用GE Signa HDxt 3.0 T 超導(dǎo)MR掃描儀，四通道相陣控小動物線圈，行常規(guī)T2WI、T1WI進行圖像定位及ESWAN序列掃描。設(shè)備參數(shù)：冠狀位T2WI，采用快速自旋回波序列(fast spin echo，F(xiàn)SE)序列，TR=4680 ms，TE=85 ms，矩陣=288×256，NEX=4，層厚=1.5 mm，間距=0.3 mm；冠狀位T1WI，采用FSE序列，TR=480 ms，TE=min full，矩陣=256×192，NEX=8.0，層厚=1.5 mm，間距=0.3 mm；ESWAN采用高分辨率的三維擾相梯度回波(3D-spoiled gradient recalled echo，3D-SPGR)序列，自動TR=7.1 mm，回波鏈長度=14，層厚=1.5 mm，矩陣=288×256，激勵次數(shù)4次，接受帶寬=31.25 Hz。

1.2.2 圖像后處理

ESWAN原始掃描數(shù)據(jù)傳至Advantage Workstation 4.4(Sun Microsystems，Santa Clara，Calif)，應(yīng)用研究軟件Functool 9.4.05a(GE Healthcare)進行去噪及濾波處理(64×64)后，同時得到強度圖和相位圖，應(yīng)用T2加權(quán)圖像進行定位，勾畫皮質(zhì)區(qū)、海馬區(qū)及丘腦區(qū)作為感興趣區(qū)(region of interest，ROI)(如圖1所示)，將ROI鏡像復(fù)制至ESWAN相位圖和強度圖，讀取MPV。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

MR檢查后小鼠開胸從左心室插管至升主動脈，先灌注0.9%生理鹽水30 ml，隨后灌注含4%多聚甲醛的磷酸緩沖液30 ml，取腦后將其置于上述固定液中12 h。然后將腦組織置于70%、80%、95%及100%的酒精梯度脫水，浸蠟，組織塊包埋后行石蠟切片，片厚約為50μm。

切片脫蠟后用磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffered saline，PBS)沖洗，山羊血清封閉室溫下30 min后甩掉，淀粉樣斑塊顯色滴加Aβ蛋白(1～40)抗體作為一抗，鐵蛋白顯色滴加鐵蛋白抗體作為一抗，4℃孵育過夜；第2天用0.01 ml PBS 3次清洗后滴加二抗，37℃孵育30 min；滴加鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(strept avidin-biotin complex，SABC)，37℃孵育30 min；二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色15～20 min，鏡下控制反應(yīng)時間，充分水洗；蘇木素復(fù)染，流水沖洗。常規(guī)脫水，透明和封片。用PBS代替一抗，排除二抗的非特異性染色，結(jié)果為陰性。

表1 模型組不同年齡組APP/PS1小鼠皮質(zhì)、海馬、丘腦區(qū)MPV及方差分析結(jié)果Tab.1 Results of MPV and variance analysis of cortex,hippocampus and thalamus in APP/PS1 mice of different age groups

在NIKON光學(xué)顯微鏡下對動物左側(cè)丘腦區(qū)、海馬區(qū)及皮質(zhì)區(qū)進行觀察并采集圖片。每只小鼠檢測3張相同部位切片，應(yīng)用NIS-Elements軟件對圖像進行觀察分析，每張切片檢測3個視野(10×objective)。計數(shù)每個視野所有的Aβ、鐵蛋白染色斑塊個數(shù)，及陽性染色斑塊所占總面積百分比。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用IBM SPSS 19.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示。每個感興趣區(qū)內(nèi)轉(zhuǎn)基因小鼠與對照組小鼠的MPV采用獨立樣本t檢驗；采用ANOVA方差分析檢驗每個感興趣區(qū)內(nèi)各月齡組小鼠的MPV及組織學(xué)斑塊統(tǒng)計結(jié)果的差異性；相同感興趣區(qū)MPV與斑塊數(shù)量、斑塊面積百分比相關(guān)性分別應(yīng)用Pearson相關(guān)分析檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果

轉(zhuǎn)基因小鼠中，Aβ蛋白陽性斑塊與鐵蛋白陽性斑塊均呈深褐色(見圖2)，Aβ蛋白斑塊染色較深，并且部分較大斑塊在中心可觀察到深染的類圓形核心；鐵蛋白斑塊染色較淺，斑塊內(nèi)染色均勻。在轉(zhuǎn)基因小鼠組中，同一ROI內(nèi)小鼠的Aβ蛋白斑塊與鐵蛋白斑塊數(shù)量和范圍差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(見表1)。

表2 模型組感興趣區(qū)平均相位值與組織學(xué)參數(shù)的相關(guān)性Tab.2 The correlation coefficient between the average value of the area of interest and the histological parameters

圖1 APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦MPV測量ROI示意圖。A、B為對照組磁矩圖及相位圖，C、D為AD組磁矩圖及相位圖。P為皮質(zhì)區(qū)，H為海馬區(qū)，T為丘腦區(qū)Fig. 1 The ROI selection of MPV measurement of APP/PS1 transgenic AD rat brain MR scan image. A, B are the magnetic moment diagram and phase diagram of the control group, C, D are the magnetic moment diagram and phase diagram of the AD group. Region P: Cortical area, H: Hippocampal area, T:Thalamic area.

視野內(nèi)斑塊數(shù)量的計數(shù)結(jié)果顯示，18月齡的APP/PS1小鼠腦內(nèi)感興趣區(qū)內(nèi)Aβ蛋白斑塊與鐵蛋白斑塊數(shù)量都明顯高于前兩組，并且斑塊范圍也較其他組增大(見圖3、4)。在6月齡組，所有的ROI內(nèi)沒有觀察到鐵蛋白的沉積，在部分小鼠海馬區(qū)和皮質(zhì)區(qū)觀察到少量淀粉樣斑塊沉積。在相同的ROI內(nèi)，淀粉樣斑塊與鐵蛋白斑塊在數(shù)量與范圍上都分別具有相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)見表2)。

圖2 海馬區(qū)淀粉樣斑塊(A)與鐵蛋白斑塊(B)免疫組化染色(× 400) 圖3 APP/PS1小鼠Aβ40免疫組化染色圖像(× 100)。A～C為4 m小鼠腦皮質(zhì)區(qū)、海馬區(qū)及丘腦區(qū)圖像；D～F為10 m小鼠上述3個部位圖像；G～I為16 m上述3個部位圖像。深棕色為陽性染色斑塊，即老年斑圖4 APP/PS1小鼠鐵蛋白免疫組化染色圖像(× 100)。A～C為4 m小鼠腦皮質(zhì)區(qū)、海馬區(qū)及丘腦區(qū)圖像；D～F為10 m小鼠上述3個部位圖像；G～I為16 m上述3個部位圖像。淺棕色為陽性染色斑塊，即鐵蛋白集中局域Fig.2 Amyloid plaques (A) and ferritin plaques (B) immunohistochemical staining (× 400) in the hippocampus. Fig.3 APP/PS1 mouse Aβ40 immunohistochemical staining (× 100). A—C show 4 m mice brain cortex, hippocampus and thalamus area image; D—F show 10 m mice the three parts of the image; G—I show 16 m the above three parts. Dark brown is a positive staining for plaques (senile plaques). Fig.4 APP/PS1 mouse ferritin immunohistochemistry staining (× 100). A—C show the 4 m mouse brain cortex, hippocampus and thalamus area image; D—F show 10 m mice the three parts of the image; G—I show 16 m the above three parts. Light brown is a positive stain (the concentration of ferritin).

圖5 不同月齡模型鼠腦內(nèi)皮質(zhì)、海馬、丘腦內(nèi)MPV、鐵蛋白及Aβ斑塊分布Fig. 5 Distribution of MPV, ferritin and Aβ protein patch in the cortex, hippocampus and basal ganglia in transgenic mice.

對照組中，僅在18月齡組內(nèi)觀察到少量Aβ蛋白斑塊與鐵蛋白斑塊，6月齡及12月齡組小鼠腦內(nèi)未觀察到上述斑塊的沉積。

2.2 ESWAN結(jié)果

轉(zhuǎn)基因組小鼠腦內(nèi)皮質(zhì)區(qū)(t=-2.201，P=0.045)與海馬區(qū)(t=-2.524，P=0.024)的MPV差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，而丘腦區(qū)的MPV差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-2.094，P=0.055)。對照組小鼠各區(qū)域內(nèi)MPV組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。18月齡的轉(zhuǎn)基因小鼠皮質(zhì)區(qū)及海馬區(qū)的MPV要明顯低于對照組，而丘腦區(qū)兩組的MPV未見明顯差異(見圖5)。轉(zhuǎn)基因組小鼠相同感興趣區(qū)不同年齡組的MPV值差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，并且平均相位值由低年齡組向高年齡組遞減，比較轉(zhuǎn)基因小鼠組不同感興趣區(qū)的MPV的均值可見，皮質(zhì)區(qū)的MPV在各月齡組均最低(見表1)。轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)相同的感興趣區(qū)MPV與組織學(xué)分析所得鐵蛋白的數(shù)量和范圍分別具有顯著相關(guān)性(見表2及圖6)。模型鼠中，腦內(nèi)MPV值與鐵沉積、Aβ斑塊的數(shù)量及其所占面積百分比呈正相關(guān)。

圖6 腦內(nèi)MPV值與鐵蛋白、Aβ斑塊相關(guān)性分析Fig. 6 The correlation of MPV, ferritin and Aβ protein patch in brain.

3 討論

3.1 APP/PS1基因突變型小鼠

本研究應(yīng)用的模型組小鼠為APP/PS1基因突變型小鼠，它可以同時表達人鼠嵌合型APP基因與人類早老素1基因，這兩種基因都出現(xiàn)在家族性AD患者中[10]。研究表明，PS1基因的轉(zhuǎn)入可以使鼠腦內(nèi)形成老年斑的時間縮短，以往研究報道APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型在5～7個月就出現(xiàn)老年斑，并且表現(xiàn)出空間學(xué)習(xí)能力降低和記憶力的減退[11]，而本研究動物模型6 m組部分小鼠腦內(nèi)可觀察到淀粉樣斑塊，這與以往研究是相符合的。并且隨著年齡的增長模型組小鼠腦內(nèi)Aβ斑塊的數(shù)量逐漸增加，尤其是在皮質(zhì)區(qū)及海馬區(qū)域內(nèi)，這也與Izco等[12]和Ferguson等[13]的研究符合。

3.2 ESWAN技術(shù)的優(yōu)勢

以往應(yīng)用MR在體定量研究小鼠腦內(nèi)鐵含量的技術(shù)多為計算組織的FDRI，大量研究證明FDRI與鐵含量成線性相關(guān)，可以定量分析組織內(nèi)鐵含量[14-16]。但是這種技術(shù)要收集同一受試體至少兩個場強的弛豫率，然后計算獲得FDRI，因此在變換場強的操作中不可避免地會產(chǎn)生系統(tǒng)偏倚，影響信號的準確性。并且應(yīng)用弛豫率信號反映鐵含量時，不可避免地會受到水等影響弛豫率物質(zhì)的影響，這就降低了FDRI的特異性[17]。本研究應(yīng)用的ESWAN技術(shù)，主要分析的是順磁性物質(zhì)鐵存在造成的周圍磁場相位信號的改變，根據(jù)公式Δψ(phase)=-rΔBTE(r為磁旋比，ΔB為組織間的場強變化，TE為回波時間)和ΔB=cVΔxB0(c為鐵含量，V為體素體積，并且Δx是鐵存在導(dǎo)致的分子間磁敏感差異性)，可以推出在相同的TE條件下，相位信號與鐵含量呈負相關(guān)，獲取感興趣區(qū)的相位信息只需要一次掃描就可完成，并且由上述公式可以看出，相位信號受其他物質(zhì)影響較小，因此在反映組織內(nèi)鐵含量時有較好的特異性。然而磁敏感加權(quán)成像圖像常伴有磁敏感偽影，這種偽影主要生成于原始圖像中的相位圖像，磁敏感偽影出現(xiàn)在不同磁化率組織的交界面上，主要是由于磁化率的不同導(dǎo)致局部磁場變化，造成質(zhì)子自旋失相位，產(chǎn)生相位差異，經(jīng)傅里葉重建之后圖像變形，部分信號丟失[18]。本研究結(jié)果顯示ESWAN技術(shù)測量得到鼠腦感興趣區(qū)平均相位值與鐵蛋白的數(shù)量與斑塊范圍均呈現(xiàn)相關(guān)具有統(tǒng)計學(xué)意義，進一步驗證了上述理論，說明相位值的變化與鐵沉積具有相關(guān)性。

3.3 APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)鐵沉積與相位值

本研究發(fā)現(xiàn)AD模型組小鼠的皮質(zhì)區(qū)與海馬區(qū)的MPV值隨月齡增長而降低，這說明鐵沉積隨月齡增大持續(xù)增多，而在對照組小鼠的MPV值組間差異并沒有統(tǒng)計學(xué)意義，Gao等[9]應(yīng)用MR弛豫時間技術(shù)研究相同模型小鼠腦內(nèi)鐵沉積時，只在丘腦區(qū)域得到了類似結(jié)論，而在皮質(zhì)區(qū)及海馬區(qū)模型組與對照組都沒有發(fā)現(xiàn)明顯的隨年齡變化的鐵沉積規(guī)律，這有可能與該研究應(yīng)用的MR技術(shù)對組織水造成的弛豫時間改變敏感，而皮質(zhì)和海馬周圍都存在大量腦脊液(結(jié)構(gòu)比鄰蛛網(wǎng)膜下間隙與側(cè)腦室)，造成這兩個區(qū)域鐵沉積分析特異性差所致。而在健康人腦鐵隨年齡變化的研究[19]與AD患者腦鐵沉積研究中都有與本研究相似的規(guī)律報道[18]。在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，18 m組各感興趣區(qū)的相位值明顯低于6 m與12 m組，提示在老齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)鐵沉積可能是持續(xù)進行的。人類腦鐵沉積在正常情況下，某些特定部位(基底節(jié)區(qū)、海馬等)也有與正常鼠腦相似的規(guī)律，即在正常人30歲左右處于停滯狀態(tài)[19-21]，但是在AD病理狀態(tài)下，鐵沉積表現(xiàn)出與疾病發(fā)展明顯程度相關(guān)[17]。

本研究還顯示不同部位的相位值存在差異，轉(zhuǎn)基因小鼠皮質(zhì)區(qū)MPV最低，說明該區(qū)域腦鐵含量明顯低于海馬區(qū)與丘腦區(qū)。皮質(zhì)區(qū)與海馬區(qū)被公認為老年斑沉積范圍及數(shù)量較多的區(qū)域，以往研究已證實隨著年齡和病程的進展其斑塊分布與鐵沉積具有相關(guān)性，但是對于丘腦區(qū)的研究仍存在爭議。Westland等[3]認為在丘腦區(qū)的鐵沉積可能與微出血等病理狀態(tài)相關(guān)，在該區(qū)域內(nèi)并沒有表現(xiàn)出明顯的AD淀粉樣斑塊相關(guān)的鐵沉積，Dhenain研究除了在丘腦區(qū)發(fā)現(xiàn)大量低信號斑塊外并沒有在皮質(zhì)和海馬區(qū)發(fā)現(xiàn)鐵沉積相關(guān)的低信號斑塊。但是在本研究中卻得到了與其相反的結(jié)論，結(jié)合鐵蛋白免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在皮質(zhì)區(qū)與海馬區(qū)，發(fā)現(xiàn)隨年齡增長出現(xiàn)大量與淀粉樣斑塊相關(guān)的鐵蛋白沉積，并且測量到MPV值明顯降低，更支持了鐵沉積的存在。在丘腦區(qū)，尤其是月齡較高的轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織內(nèi)，本研究同樣發(fā)現(xiàn)了與淀粉樣斑塊相關(guān)的鐵蛋白陽性斑塊，證明丘腦區(qū)的淀粉樣斑塊與鐵沉積是具有相關(guān)性的。筆者認為與前人研究產(chǎn)生這一矛盾結(jié)論的主要原因可能是Dhenain研究所應(yīng)用的MR技術(shù)無法有效鑒別丘腦區(qū)低信號斑塊的成分組成，如鈣等其他會影響弛豫時間改變及信號改變的物質(zhì)，而ESWAN技術(shù)可以針對性地對鐵進行顯示，并且進行相應(yīng)的定量測量。

4 結(jié)論

本研究顯示APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)皮質(zhì)區(qū)、海馬區(qū)及丘腦區(qū)的鐵沉積持續(xù)進行，并且與淀粉樣斑塊的形成具有相關(guān)性，ESWAN技術(shù)平均相位值的改變與鐵沉積具有明顯相關(guān)性，為在體定量研究腦組織鐵沉積提供了新的方法。