水中糞大腸菌群檢測方法的對(duì)比

何 敏，張亞娟，周艷紅，余沛芝，周 婷，董曉晨，趙賽君，鄒真妮，Yun Yunbo，劉洪波

(1.蘇州工業(yè)園區(qū)清源華衍水務(wù)有限公司水質(zhì)檢測中心，江蘇蘇州 215021； 2.上海理工大學(xué)環(huán)境與建筑學(xué)院，上海 200093；3.亞琛工業(yè)大學(xué)水和固體廢物管理研究所, 德國亞琛 52056)

飲用水安全密切關(guān)系到社會(huì)文明建設(shè)和人民群眾身體健康，越來越受到政府和人民群眾的重視[1]。中國的飲用水和水源水的衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)為(耐熱)糞大腸菌群[2]，它是評(píng)價(jià)水質(zhì)的重要指標(biāo)，具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義。水體中糞大腸菌群主要來自人畜糞便的污染，其對(duì)氯的抵抗力相似于腸道致病菌。該菌的檢測方法主要為多管發(fā)酵法和酶底物法等[3]。

多管發(fā)酵法是根據(jù)糞大腸菌群發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢菌來判定菌群，它是目前檢測糞大腸菌群的標(biāo)準(zhǔn)方法。多管發(fā)酵法有技術(shù)成本低、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，但可檢測時(shí)間長、試驗(yàn)過程操作繁瑣和最后的試驗(yàn)結(jié)果還需驗(yàn)證等劣勢，使其不能快速檢測水體中的糞大腸菌群[4]。李永[5]曾評(píng)定多管發(fā)酵法檢測污水中的糞大腸菌群的結(jié)果不確定性，檢測過程不同陽性管的使用和試驗(yàn)操作都可能為測定結(jié)果帶來很大的不確定性。古麗茹合薩熱·艾海提[6]提出，使用多管發(fā)酵法檢測糞大腸菌群時(shí)必須要保證培養(yǎng)基的質(zhì)量，注重培養(yǎng)基的pH和高壓滅菌情況，說明該方法試驗(yàn)過程要求高、操作繁瑣。

酶底物法是根據(jù)大腸菌群細(xì)菌能產(chǎn)生特異性的β-半乳糖酶，分解鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷ONPG的原底物，使培養(yǎng)液呈黃色[7]，指示水體中糞大腸菌的存在。唐慧穎[8]采用固定底物酶底物法，對(duì)瓶裝礦泉水、水廠取水口水、長江水、污水處理廠出水、城區(qū)河道水和畜禽養(yǎng)殖場出水中的糞大腸菌群，分別進(jìn)行平行雙樣測定，相對(duì)偏差為0～12%，且在測定較清潔水樣中的糞大腸菌群時(shí)，具有較高的精密度。湯琳等[9]研究發(fā)現(xiàn)酶底物法在應(yīng)急監(jiān)測中檢測糞大腸菌群有很好的適用性。它還可在普通實(shí)驗(yàn)室操作，快速檢測，無需驗(yàn)證，能夠彌補(bǔ)多管發(fā)酵法的不足，但目前還未列入《水和廢水監(jiān)測分析方法》中，需進(jìn)一步驗(yàn)證其可行性。本試驗(yàn)是選用多管發(fā)酵法和酶底物法作對(duì)比，驗(yàn)證酶底物法檢驗(yàn)水樣的準(zhǔn)確性及方便性。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

試驗(yàn)水樣分別采集于蘇州某自來水廠過程水、蘇州太湖水域水源水、蘇州某污水廠污水進(jìn)、出水。按照無菌條件[10]采集水樣500 mL于滅菌的玻璃瓶中，置于4～8 ℃的冰箱中，2 h內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測。

1.2 儀器設(shè)備與試劑

1.2.1 儀器設(shè)備

培養(yǎng)箱(上海一恒)、立式壓力蒸汽滅菌器(Yamato)、程控定量封口機(jī)(Biostron)等儀器。

1.2.2 試劑材料

試劑：乳糖蛋白胨、EC肉湯、伊紅美藍(lán)瓊脂(北京陸橋)、科立得Colilert-18等試劑。

材料：試管、試管架、90 mm培養(yǎng)皿、接種環(huán)、無菌采樣瓶、科立得97孔定量盤等用具。

1.3 試驗(yàn)方法

多管發(fā)酵法。參考《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法》(GB/T 5750.12—2006)和《水和廢水監(jiān)測分析方法》第四版增補(bǔ)版。將水樣分別接種到盛有乳糖膽鹽培養(yǎng)基的發(fā)酵管中。在37±0.5 ℃下培養(yǎng)24±2 h。產(chǎn)酸和產(chǎn)氣的發(fā)酵管說明試驗(yàn)呈陽性，輕微震蕩后，用3 mm接種環(huán)將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到EC肉湯培養(yǎng)液中，在44.5±0.5 ℃下培養(yǎng)24±2 h。

酶底物法。先在100 mL的水樣中加入科立得Colilert-18試劑，搖勻完全溶解后倒入科立得97孔定量盤中，在定量封口機(jī)過塑封裝。然后置于44.5±0.5 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h進(jìn)行結(jié)果判讀，如果產(chǎn)生可疑陽性，可延長時(shí)間至28 h，超過28 h后出現(xiàn)的顏色不作為陽性結(jié)果。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。數(shù)據(jù)整理統(tǒng)計(jì)方法使用excel和SPSS10.0軟件中的t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)控標(biāo)樣

本次試驗(yàn)將認(rèn)證的商售IDEXX-QC大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)和綠膿假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)分別作為陽性和陰性控制菌株，多管發(fā)酵法和酶底物法分別對(duì)其進(jìn)行檢測分析，檢測結(jié)果如表1所示。由表1可知，兩種方法對(duì)陽性大腸埃希氏菌的測定數(shù)值均在置信范圍內(nèi)，且均未檢測出陰性綠膿假單胞菌，可用于后面的試驗(yàn)分析。

表1 質(zhì)控標(biāo)樣測定結(jié)果比較Tab.1 Comparison of Determination Results of Quality Control Standard Samples

2.2 較清潔水樣兩種方法結(jié)果比對(duì)

對(duì)60份水樣進(jìn)行檢測，其中第1～20份是自來水廠過程水、21～40份是蘇州太湖水域水源水、41～60份是蘇州某污水廠加次氯酸鈉和紫外消毒處理后的出水，分別用多管發(fā)酵法和酶底物法進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖1、表2及表3所示。

圖1 較清潔水樣兩種方法結(jié)果比對(duì)Fig.1 Comparison Results between Two Methods for the Cleaner Water Samples

表2 較清潔水樣多管發(fā)酵法和酶底物法相關(guān)系數(shù)Tab.2 Correlation Coefficients of Multi-Tube Fermentation Method and Enzyme Substrate Method for the Cleaner Water Samples

結(jié)果顯示，兩種方法的檢測數(shù)據(jù)變化大致相同。相關(guān)系數(shù)r=0.947，可看出兩組數(shù)據(jù)的相關(guān)性很好，P=0.000，說明兩組數(shù)據(jù)的相關(guān)性趨于一致[11]。對(duì)兩種方法的結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，t=0.231，P=0.818(>0.05)，即差異沒有顯著意義?？烧J(rèn)為酶底物法與多管發(fā)酵法沒有區(qū)別, 效果是相同的。腸桿菌屬要延遲發(fā)酵[12]，蘇州太湖水源水用多管發(fā)酵法時(shí)注意初發(fā)酵要延遲，文獻(xiàn)[13]是通過陽性管進(jìn)行平板分離提取菌株總DNA作為模板，使用16S rRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增證實(shí)太湖源水腸桿菌屬中的陰溝腸桿菌延遲發(fā)酵，建議將多管發(fā)酵法測定總大腸菌群的乳糖發(fā)酵時(shí)間延長48 h，保證檢測結(jié)果會(huì)更準(zhǔn)確。

表3 較清潔水樣多管發(fā)酵法和酶底物法配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Paired t Test Results of Multiple Tube Fermentation Method and Enzyme Substrate Method for the Cleaner Water Samples

2.3 污水進(jìn)水結(jié)果兩種方法比對(duì)

對(duì)30份污水進(jìn)水水樣進(jìn)行檢測，為了使結(jié)果影響因素少，多管發(fā)酵法和酶底物法選用200 000倍的稀釋倍數(shù)來稀釋水樣，結(jié)果如圖2、表4及表5所示。

結(jié)果顯示，r=0.602，表明兩種方法相關(guān)性較強(qiáng)，P=0.000，兩組數(shù)據(jù)的相關(guān)性趨于一致。對(duì)兩種方法的結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，t=0.373，P=0.712(>0.05)，即兩種方法測定結(jié)果的差異沒有顯著意義，可認(rèn)為兩種方法是等效的。但文獻(xiàn)表明[14]，酶底物法檢測水樣時(shí)，污水稀釋度越高，測定結(jié)果就越偏低。本試驗(yàn)在檢測污水和清潔水樣的糞大腸菌對(duì)比中得出，污水水樣的結(jié)果偏低，所以在日常檢測糞大腸菌時(shí)，應(yīng)準(zhǔn)確掌握污水可稀釋的最小倍數(shù)，保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確。

圖2 污水進(jìn)水水樣兩種方法結(jié)果比對(duì)Fig.2 Comparison Results of Two Methods for Wastewater Influent Water Samples

表4 污水進(jìn)水多管發(fā)酵法和酶底物法相關(guān)系數(shù)Tab.4 Correlation Coefficient of Multi-Tube Fermentation Method and Enzyme Substrate Method for Wastewater Influent

表5 污水進(jìn)水多管發(fā)酵法和酶底物法配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Paired t Test Results of Multi-Tube Fermentation Method and Enzyme Substrate Method for Wastewater Influent

3 討論

通過配對(duì)t檢驗(yàn)比較兩種方法檢測較清潔的水樣和污水廠進(jìn)水中含不同糞大腸菌的濃度，從結(jié)果一致性的角度來看，多管發(fā)酵法和酶底物法無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著性差異。

表6為這兩種方法優(yōu)缺點(diǎn)的比較。多管發(fā)酵法是一直沿用的方法，積累了很多年的經(jīng)驗(yàn)，對(duì)污水進(jìn)水檢測還是很靈敏的，且數(shù)據(jù)可靠，但反應(yīng)時(shí)間長、試驗(yàn)過程繁瑣，若是不應(yīng)急的水樣使用多管發(fā)酵法則可以獲得更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。

酶底物法用于檢測水樣中的糞大腸菌群是可靠的，相比于多管發(fā)酵法，它具有較多的優(yōu)勢特點(diǎn)。美國、歐洲等國家選用酶底物法檢測自來水廠的糞大腸菌群，除此之外，應(yīng)急水樣檢測也使用了該方法。

表6 多管發(fā)酵法和酶底物法的優(yōu)缺點(diǎn)比較 Tab.6 Comparison of Advantages and Disadvantages of Multi-Tube Fermentation Method and Enzyme Substrate Method

4 結(jié)論

酶底物法特別適用于較清潔的水樣，它能夠快速、穩(wěn)定地檢測出結(jié)果，尤其是應(yīng)急水樣。本試驗(yàn)中酶底物法置信度95%的差異說明檢測結(jié)果的一致性，但檢測污水水樣稀釋倍數(shù)越高，測定結(jié)果會(huì)有所降低，若污水稀釋倍數(shù)低，誤差不大時(shí)可被應(yīng)用。酶底物法應(yīng)當(dāng)不斷改進(jìn)優(yōu)化，日后可作為評(píng)價(jià)水質(zhì)微生物重要的檢測方法得以推廣。