高效液相色譜法測(cè)定腸寧胃舒片中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量*

崔明筠，付開聰，張雪梅，羅 ?。ㄆ斩忻褡鍌鹘y(tǒng)醫(yī)藥研究所，云南676200）

腸寧胃舒片是云南省普洱市民族醫(yī)院的臨床使用方劑，為了更好地服務(wù)患者，該院經(jīng)與北京師范大學(xué)藥物研究工程中心聯(lián)合研究開發(fā)，研制出具有健脾和胃之功效的院內(nèi)制劑，該制劑用于治療脾胃氣虛、倦怠乏力、噯氣、胸悶、脘腹脹痛或疼痛、大便不實(shí)等。處方由黃芪、黨參、白術(shù)、茯苓、木香、砂仁、茵陳、白及、海螵蛸等組成，屬純中藥制劑。黃芪具有補(bǔ)氣升陽、生津養(yǎng)血等功效，在方中為君藥，固選擇黃芪作為腸寧胃舒片質(zhì)量控制的研究對(duì)象。本研究建立的高效液相色譜法，為腸寧胃舒片的質(zhì)量控制提供了有效的分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 儀器為高效液相色譜儀（Waters 1525）、超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司KQ250）、電子分析天平（瑞士 Mettler Toledo公司AG135）等。試藥為毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111920～201304）、腸寧胃舒片（云南省普洱市民族醫(yī)院制備，批號(hào)：20171101、20171102、20171103）等。甲醇為色譜純，甲酸為分析純，水為純凈水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件[1-4]色譜柱為Waters XTerra@RP18 C18柱（3.9 mm×150.0 mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-0.20%甲酸水溶液（27∶73）梯度洗脫，設(shè)定檢測(cè)波長為260 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10μL。腸寧胃舒片梯度洗脫條件見表1。

表1 腸寧胃舒片梯度洗脫條件

1.2.2 樣品的制備[5-8]

1.2.2.1 對(duì)照品溶液 取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品適量，加入溶劑甲醇，超聲處理，定重法制成每毫升含0.739 2μg對(duì)照品的溶液，即可。

1.2.2.2 供試品溶液的制備 取腸寧胃舒片適量，研磨成細(xì)粉，取腸寧胃舒片細(xì)粉4 g，精密稱定樣品重量，置于具塞三角瓶中，加入甲醇50 mL，超聲提取30 min，精密稱定超聲處理前后樣品重量，用甲醇補(bǔ)足溶劑損失的部分重量，搖勻，過濾裝置除渣，取濾液，制得腸寧胃舒片供試品溶液。

1.2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按處方配比除去黃芪，依照腸寧胃舒片制備工藝制得陰性樣品，再依據(jù)腸寧胃舒片供試品溶液制備方法配制，備用。

1.2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 吸取缺黃芪陰性對(duì)照溶液、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液和腸寧胃舒片供試品溶液各10μL，在“1.2.1”項(xiàng)下的色譜條件下，分別記錄樣品出指標(biāo)峰的保留時(shí)間。

1.2.4 線性關(guān)系考察 設(shè)定高效液相色譜儀的運(yùn)行程序，分別自動(dòng)精密吸取對(duì)照品溶液 3、5、8、10、13、15 μL，記錄不同進(jìn)樣量對(duì)照品峰面積，以不同進(jìn)樣體積為橫坐標(biāo)，待測(cè)指標(biāo)峰（毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰）面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液，進(jìn)樣10μL，連續(xù)測(cè)定6次，記錄毛蕊異黃酮葡萄糖苷的峰面積。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一批號(hào)腸寧胃舒片（20171101）供試品溶液，在“1.2.1”項(xiàng)下的色譜條件下，分別于 0、2、4、6、8、12 h 測(cè)定其含量。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取6份同一批號(hào)腸寧胃舒片（20171101），按腸寧胃舒片供試品溶液制備方法制得供試品溶液，依次記錄腸寧胃舒片出指標(biāo)峰的峰面積大小。

1.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取6份同一批號(hào)腸寧胃舒片（20171101）樣品2 g，置50 mL容量瓶中，于容量瓶中加入已知濃度的對(duì)照品溶液2.8 mL，按“1.2.2.2”項(xiàng)下的方法制備加樣回收供試品溶液，進(jìn)樣10μL，測(cè)定毛蕊異黃酮葡萄糖苷的峰面積，計(jì)算加樣回收率。

1.2.9 樣品測(cè)定 取3個(gè)不同批號(hào)的腸寧胃舒片（20171101、20171102、20171103），每個(gè)批次樣品取 3 份，按“1.2.2.2”項(xiàng)下的方法制得待測(cè)樣品溶液。分別記錄3個(gè)批次腸寧胃舒片的指標(biāo)峰面積，計(jì)算3批樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量。

2 結(jié) 果

2.1 色譜條件和系統(tǒng)適用性 毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液的保留時(shí)間為22.649 min，腸寧胃舒片指標(biāo)峰的保留時(shí)間為22.575 min，二者保留時(shí)間基本一致，而陰性對(duì)照品溶液在此保留時(shí)間內(nèi)未出現(xiàn)相應(yīng)的峰，表明采用該色譜條件，在腸寧胃舒片指標(biāo)峰測(cè)定過程中，沒有其余成分對(duì)其產(chǎn)生干擾，見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 線性關(guān)系的確定 回歸方程為Y=78368X-3485。毛蕊異黃酮葡萄糖苷線性范圍為0.022～0.111μg（R2=0.997）。

2.3 精密度試驗(yàn) 毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.40%，精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 供試品溶液中毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD為0.31%，表明腸寧胃舒片供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 腸寧胃舒片樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的RSD為0.39%，重復(fù)性好。

2.6 加樣回收率試驗(yàn) 該方法加樣回收率符合要求，見表2。

2.7 樣品測(cè)定 3個(gè)批次的腸寧胃舒片樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量見表3。腸寧胃舒片中毛蕊異黃酮葡萄糖苷平均值為每片0.051 mg。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表3 腸寧胃舒片中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測(cè)定結(jié)果（毫克/片）

3 討 論

本研究采用紫外可見分光光度計(jì)180～400 nm掃描，得出毛蕊異黃酮葡萄糖苷的最大吸收波長在260 nm處，因此，選擇260 nm為檢測(cè)波長。處方含黃芪、黨參、白術(shù)和茯苓等中藥，試驗(yàn)開展過程中，作者首先參照文獻(xiàn)[9-12]及2015年版《中華人民共和國藥典》黃芪項(xiàng)下毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的測(cè)定方法，分別采用Waters C18、Agilent HC-C18和 Diamonsil C18色譜柱未得到分離度良好的指標(biāo)峰，表明運(yùn)用此方法，處方中藥材含有的其余物質(zhì)對(duì)毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰產(chǎn)生了干擾，經(jīng)多次試驗(yàn)探索，結(jié)果顯示，采用Waters C18色譜柱，按照“1.2.1”項(xiàng)下的色譜條件試驗(yàn)得到的指標(biāo)峰，分離度好，方法穩(wěn)定，經(jīng)耐用性實(shí)驗(yàn)考察，結(jié)果良好。

在樣品制備條件探索過程中，本研究對(duì)超聲提取法的提取時(shí)間進(jìn)行了考察，設(shè)置樣品超聲提取時(shí)間為15、30、45、60 min，結(jié)果顯示，超聲提取 30 min 與超聲提取45、60 min測(cè)得樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量不存在顯著性差異，固超聲提取時(shí)間設(shè)置為30 min。

腸寧胃舒片的主要作用是健脾和胃，理氣止痛，用于脾胃虛弱、胃氣郁滯、胃失和而致胃脘隱痛、綿綿不休、納呆便溏等。方中以黃芪補(bǔ)氣健脾為君藥；臣藥為黨參、白術(shù)、茯苓，具有益氣、健脾、濕加、強(qiáng)補(bǔ)氣助運(yùn)之功。腸寧胃舒片中黃芪為君藥，定量測(cè)定黃芪中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量，采用先進(jìn)的分析技術(shù)方法，可為腸寧胃舒片的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)，以便更好地為患者服務(wù)，實(shí)現(xiàn)醫(yī)院中藥制劑的現(xiàn)代化研究，推進(jìn)中藥制劑安全、有效、可控的良性發(fā)展[13-14]。本研究所得色譜圖的分離度好，方法簡單易行，重現(xiàn)性好，保留時(shí)間較合適，具有良好的適用性，適用于腸寧胃舒片的質(zhì)量控制。