一次及多重腦震蕩大鼠傷后1、3、6月空間認(rèn)知變化動態(tài)觀察

王家雄 王路宋海，2 鄭永江張睿張桓楊力郭澤云于建云

1昆明醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院（昆明650500）

2昆明醫(yī)科大學(xué)附一院神經(jīng)外科

3昆明醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室4紅河州第一人民醫(yī)院

腦震蕩（cerebral concussion）一直被認(rèn)為是創(chuàng)傷性腦損傷中最輕的類型，患者表現(xiàn)為一過性意識喪失和逆行型遺忘，預(yù)后良好，絕大多數(shù)患者腦功能經(jīng)過一定時間后可恢復(fù)正常。但近些年臨床觀察與流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)遭受多次輕微創(chuàng)傷的重復(fù)性腦震蕩（multiple cerebral concussion，MCC）患者，易出現(xiàn)遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶功能與情感障礙等問題，最終發(fā)展為癡呆的慢性創(chuàng)傷性腦?。╟hronic traumatic encephalopathy，CTE）[1]。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，MCC患者常有以下病程特征，以傷后3個月為急性期，患者有頭痛、視物模糊、健忘、耳鳴和疲勞等急性期癥狀，大多在數(shù)天或幾周恢復(fù)；如果急性期癥狀持續(xù)超過3個月，并出現(xiàn)認(rèn)知與情感行為方面的問題時被稱為腦震蕩后綜合征（post concussive syndrome，PCS）；如果PCS癥狀持續(xù)超過1年以上者，則為CTE，輕型腦損傷遠(yuǎn)期并發(fā)癥主要表現(xiàn)為認(rèn)知改變、情感異常、抑郁和自殺、運(yùn)動功能受損與癡呆等[1，2]。本課題組于建云等[3-5]先前雖對多次性腦震蕩大鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知行為的早期變化進(jìn)行過研究，但對一次與多次性腦震蕩傷后遠(yuǎn)期的認(rèn)知行為動態(tài)變化比較研究至今未見有報(bào)道，故特設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料方法

1.1 動物分組及模型復(fù)制

7周齡SD雄性大鼠180只，購自斯XX達(dá)有限公司，體重280±30 g。動物編號后隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)對照組（control，C）和腦震蕩組，腦震蕩組完成第一次打擊后隨機(jī)分為單純腦震蕩（pure cerebral concussion，PCC）組和多重腦震蕩（multiple cerebral concussion，MCC）組，多重?fù)p傷組完成第2次打擊后再隨機(jī)分為二重腦震蕩組（2MCC）和三重腦震蕩組（3MCC），各組又分為3個亞組分別在傷后1月、3月、6月進(jìn)行觀察。模型復(fù)制參照于建云等[3-4，6]的方法，將每次打擊符合輕型腦損傷判斷標(biāo)準(zhǔn)的大鼠納入研究，多重腦震蕩每次打擊的間隔時間為24小時（MCC24h），排除模型復(fù)制過程中判斷為重型腦損傷、死亡以及傷后飼養(yǎng)過程中死亡的大鼠，所有老鼠在相同條件下飼養(yǎng)。

1.2 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

在觀測時間點(diǎn)前，連續(xù)7天進(jìn)行Morris水迷宮測試（MWM），以評估大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能。即1月組在傷后23天開始，3月組在傷后83天開始，6月組在傷后173天開始。水迷宮實(shí)驗(yàn)含以下3個步驟：（1）第1～5天水下隱匿平臺實(shí)驗(yàn)：隨機(jī)按4個方向?qū)⒋笫蠓湃朊詫m，記錄大鼠找到平臺所需要的時間（逃避潛伏期），超過120 s未找到則人為將大鼠放到平臺上并記為120 s，讓大鼠在平臺上停留30 s后離開迷宮休息4 min，隨后又開始另一輪實(shí)驗(yàn)，直到4個方向都測試完畢。該測試連續(xù)進(jìn)行5天。（2）第6～7天水上可見平臺實(shí)驗(yàn)：將實(shí)驗(yàn)平臺升高4 cm暴露于水面上，按水下平臺實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行，該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行2 d。（3）第7天無平臺探測實(shí)驗(yàn)：于第7天水上平臺實(shí)驗(yàn)完成并休息 4 min后立即進(jìn)行。將平臺移出迷宮，大鼠從遠(yuǎn)離平臺象限的方向放入迷宮，測試 2次；記錄大鼠在原有平臺象限的停留時間，每次實(shí)驗(yàn)時間為60 s。兩次實(shí)驗(yàn)間期休息4 min[4]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 17統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，所有結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析。當(dāng)P＜0.05時，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 傷后 1月水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表1）

水下平臺逃避潛伏期：實(shí)驗(yàn)組與對照組比較以及各實(shí)驗(yàn)組之間比較，1～5天均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

水上平臺逃避潛伏期：與對照組比較，PCC組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），2MCC組于第7天、3MCC組于第6、7天有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05或P＜0.01）；與PCC組比較，2MCC組于第7天、3MCC組于第6、7天有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05或P＜0.01）；2MCC組與3MCC組比較于第7天有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

無平臺探測實(shí)驗(yàn)：各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 不同腦損傷后1月水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果（s）

2.2 傷后 3月水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2）

水下平臺逃避潛伏期：與對照組比較，PCC組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），2MCC組于第5天，3MCC組于第4、5天延遲有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。各實(shí)驗(yàn)組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

水上平臺逃避潛伏期：與對照組比較，PCC組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），2MCC組和3MCC組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05或P＜0.01）；與PCC組比較，僅3MCC組第 6、7天有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；2MCC組與3MCC組比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

無平臺探測實(shí)驗(yàn)：與對照組比較，PCC組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），2MCC組和3MCC組停留時間縮短具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與PCC組比較僅3MCC組具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。2MCC組與3MCC組比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

表2 不同腦損傷后3月水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果（s）

2.3 傷后 6月水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表3）

水下平臺逃避潛伏期：與對照組比較，PCC組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），2MCC組于第5天，3MCC組于第2、3、4、5天延遲有統(tǒng)計(jì)學(xué)或顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；與PCC組比較，2MCC組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），3MCC組于第4、5天延遲具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義或顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。2MCC組與3MCC組比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

水上平臺逃避潛伏期：與對照組比較，PCC組、2MCC和3MCC組于第6、7天有統(tǒng)計(jì)學(xué)或顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05或P＜0.01）；與 PCC組比較，2MCC組和3MCC組于第6、7天有統(tǒng)計(jì)學(xué)或顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05或P＜0.01）；2MCC組與3MCC組比較于第7天有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。

無平臺探測實(shí)驗(yàn)：與對照組比較，PCC組、2MCC組和3MCC組在原平臺象限停留時間縮短均有統(tǒng)計(jì)學(xué)或顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05或P＜0.01）。與PCC組比較，2MCC和3MCC組均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。2MCC組與3MCC組比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

表3 不同腦損傷后6月水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果（s）

2.4 各損傷組傷后 1、 3、 6月動態(tài)變化

PCC組：與對照組比較，傷后1、3月均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），傷后6月水上平臺實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期延遲和在原平臺象限停留時間縮短有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

2MCC組：與對照組比較，水下平臺實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期延遲，傷后3、6月的第5天有統(tǒng)計(jì)學(xué)或顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；水上平臺實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期延遲，傷后1、3、6月的第6、7天均有統(tǒng)計(jì)學(xué)或顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；無平臺探測在原平臺象限停留時間縮短，傷后3、6月均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與PCC組比較，傷后6月的水上平臺實(shí)驗(yàn)和無平臺探測實(shí)驗(yàn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)或顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。

3MCC組：與對照組比較，水下平臺實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期延遲，傷后3月的4、5天以及6月的2、3、4、5天有統(tǒng)計(jì)學(xué)或顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；水上平臺實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期延遲，傷后1、3、6月均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；無平臺探測在原平臺象限停留時間縮短，傷后第3、6月均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與PCC組比較，傷后第1、3、6月水上平臺，6月水下平臺以及3、6月無平臺探測實(shí)驗(yàn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)或顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。與2MCC比較，傷后1、6月水上平臺潛伏期延遲有統(tǒng)計(jì)學(xué)或顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。見表1～3。

3 討論

3.1 不同類型腦震蕩鼠空間認(rèn)知功能損害隨時間而加劇

學(xué)習(xí)記憶過程分為獲取、鞏固、存貯與提取四階段。水迷宮是目前國際通用的嚙齒類動物空間學(xué)習(xí)記憶功能的有效評估方法。其逃避潛伏期反映空間學(xué)習(xí)記憶信息的學(xué)習(xí)獲取、鞏固與保存功能，無平臺實(shí)驗(yàn)則主要評估記憶信息的保存與提取功能。本課題組先前對不同腦震蕩大鼠傷后早期（24天）的認(rèn)知學(xué)習(xí)行為變化進(jìn)行了水迷宮實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：不同損傷類型大鼠傷后早期的空間認(rèn)知功能恢復(fù)時間不同[3-5]。而本次實(shí)驗(yàn)首次對傷后長達(dá)6個月的空間認(rèn)知行為變化實(shí)施動態(tài)觀測，結(jié)果顯示：一次腦震蕩（PCC）大鼠在傷后第1月、3月的學(xué)習(xí)記憶功能與對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但至傷后第6月時開始出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶的獲取、鞏固與保存功能減退，記憶保存與提取功能出現(xiàn)下降，損害程度達(dá)對照組的83.88%。三重腦震蕩（3MCC）大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶獲取、鞏固與保存功能損害（即潛伏期延遲）在傷后第1個月末就出現(xiàn)，且隨著時間推移越來越嚴(yán)重，至傷后6個月?lián)p害最重的已達(dá)到對照組的2.26倍；而信息的保存和提取功能在傷后第3月出現(xiàn)明顯損害，損害程度達(dá)對照組的73.1%，至傷后第6月這種損害程度達(dá)對照組的59.43%。二重腦震蕩（2MCC）大鼠的損害變化特征類似3MCC，只是程度稍輕，即記憶的獲取、鞏固與保存功能損害（即潛伏期延遲）自傷后第1月末偶爾出現(xiàn)，至傷后第6個月?lián)p害最重的已達(dá)到對照組的1.79倍；而信息的保存和提取功能在傷后第3月出現(xiàn)明顯損害，程度達(dá)對照組的82.12%，至傷后第6月這種損害程度達(dá)對照組的67.15%。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果還提示，隨著打擊次數(shù)的增加，空間認(rèn)知障礙就會較早出現(xiàn)而且越嚴(yán)重，本實(shí)驗(yàn)較好再現(xiàn)了大鼠MCC后，發(fā)展為慢性創(chuàng)傷性腦?。–TE）出現(xiàn)空間認(rèn)知功能障礙的動態(tài)變化過程，是一個良好的MCC大鼠CTE空間認(rèn)知研究模型。

3.2 隨打擊次數(shù)增加，空間認(rèn)知功能異常出現(xiàn)明顯累加效應(yīng)

輕型腦損傷的打擊損傷次數(shù)是否會出現(xiàn)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)中的“量-效關(guān)系”一直是腦損傷研究中的一個熱點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示：與實(shí)驗(yàn)對照組相比，不論在傷后第1、3或第6月，各損傷實(shí)驗(yàn)組大鼠的記憶獲取、鞏固與保存功能不同程度受到損害，表現(xiàn)出完成同一學(xué)習(xí)任務(wù)的速率隨腦震蕩次數(shù)的增加而下降（即潛伏期延遲）。在傷后第1月末，PCC大鼠無差異，2MCC大鼠出現(xiàn)1天明顯差異且最嚴(yán)重值是對照組的1.71倍，3MCC大鼠出現(xiàn)2天高度差異且最嚴(yán)重值是對照組的2.36倍、PCC組的2.34倍、2MCC組的1.39倍。在傷后第3月末，PCC大鼠雖然潛伏期存在延遲、但仍無差異，2MCC大鼠出現(xiàn)3天明顯差異且最嚴(yán)重值是對照組的1.51倍、PCC組的1.16倍,3MCC大鼠出現(xiàn)4天高度差異且最嚴(yán)重值是對照組的1.87倍、PCC組的1.43倍、2MCC組的1.24倍。在傷后第6月末，PCC大鼠開始出現(xiàn)2天差異且最嚴(yán)重值是對照組的1.37倍，2MCC大鼠出現(xiàn)3天高度明顯差異且最嚴(yán)重值是對照組的1.79倍、PCC組的1.30倍，3MCC大鼠出現(xiàn)5天明顯差異且最嚴(yán)重值是對照組的2.26倍、PCC組的1.65倍、2MCC組的1.27倍。與此同時，記憶信息的保存和提取功能也表現(xiàn)出類似特征，隨腦震蕩次數(shù)的增加而減弱（在原平臺象限的時間減少）。在傷后第1月末，各損傷組均無異常，但2MCC組已輕微下降到對照組的88.23%、3MCC組輕微降到對照組的83.67%。在傷后第3月末，PCC組雖有下降但仍無異常，但2MCC組已顯著下降到對照組的82.12%、3MCC顯著下降到對照組的73.1%。在傷后第6月末，PCC組明顯下降到對照組的83.88%，2MCC和3MCC組已分別顯著下降到對照組的67.15%和59.43%。

以上分析可得出輕微腦損傷隨著打擊次數(shù)的增加，其空間學(xué)習(xí)認(rèn)知能力的損害具有明顯累加效應(yīng)。

3.3 重復(fù)腦震蕩誘發(fā)空間認(rèn)知損傷漸進(jìn)累加的可能機(jī)制

在各型腦損傷中近90%的損傷表現(xiàn)為腦震蕩（CC）或輕微腦損傷[1]。重復(fù)腦震蕩可增加再次遭受腦震蕩的風(fēng)險(xiǎn)，并延長腦震蕩癥狀的持續(xù)時間，重復(fù)腦損傷不僅使功能受損的風(fēng)險(xiǎn)增加，同時增加了腦微觀解剖結(jié)構(gòu)破壞的風(fēng)險(xiǎn)，腦損傷的累積即可能導(dǎo)致CTE[7]。CTE癥狀通常在腦損傷后進(jìn)展多年甚至超過10年，最初的癥狀包括情感異常（抑郁、冷漠、易激惹、自殺意念和自殺行為）、行為異常（易怒、情緒失控、暴力）、認(rèn)知異常（學(xué)習(xí)障礙、記憶障礙）以及其他高級腦功能紊亂，隨時間進(jìn)展平衡障礙、椎體外系癥狀等運(yùn)動癥狀開始出現(xiàn)[8]。

本次通過Morris水迷宮測試（MWM）對不同損傷大鼠的遠(yuǎn)期空間認(rèn)知行為評估發(fā)現(xiàn)，隨著打擊次數(shù)的增加，不但可以較早地引出大鼠空間認(rèn)知功能行為的異常，而且還出現(xiàn)了損傷大鼠空間認(rèn)知功能損害程度的累積效應(yīng)。本課題組先前對腦震蕩大鼠研究發(fā)現(xiàn)，該大鼠模型在一次或多次腦震蕩后，大鼠中樞神經(jīng)較廣泛區(qū)域，如前額葉與頂葉皮質(zhì)，海馬的CA1、CA3和齒狀回，基底節(jié)，中隔區(qū)，丘腦與下丘腦，杏仁核，梨狀皮質(zhì)存在不同程度的部分神經(jīng)元變性壞死；胼胝體、腦干椎體束部分軸索纖維變性等神經(jīng)病理學(xué)改變，而且這些病理學(xué)變化隨著打擊次數(shù)的增加而加重。以上不同腦震蕩大鼠的神經(jīng)病理學(xué)改變，很可能就是本次實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的病理學(xué)基礎(chǔ)。

流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)外傷性腦損害（TBI）與發(fā)展為多種類型的癡呆相關(guān)，包括阿爾茨海默?。ˋD）、Parkinson?。≒D），尸檢病理檢查顯示多重輕微腦損傷可表現(xiàn)出淀粉樣變、tau蛋白、路易士小體等多重病理改變，臨床前研究證實(shí)，TBI后多種與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的蛋白累積在大腦，重復(fù)性輕微腦損傷的慢性后遺癥和典型的神經(jīng)退行性病變都有共同的神經(jīng)病理學(xué)特征和臨床癥狀[9]。據(jù)此我們推測TBI誘發(fā)的CTE神經(jīng)退變可能與AD、PD和多發(fā)性硬化癥（MS）等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制相似或存在交叉，其具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

隨著腦震蕩次數(shù)的增加，大鼠出現(xiàn)空間認(rèn)知行為較早和較嚴(yán)重的損壞，并有明顯的損傷累積效應(yīng)，該模型可用于慢性創(chuàng)傷性腦病病理改變的研究。