不同生長(zhǎng)年限北五味子植株黑斑病發(fā)病規(guī)律及生理指標(biāo)的變化

李嘉豐，許 嘉，任躍英*，常思佳，楊錄軍，成宜濃

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118； 2.吉林紫鑫紅石種養(yǎng)殖有限公司，吉林 通化 135300)

北五味子為多年生木蘭科植物五味子[Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.]的干燥成熟果實(shí)。在我國(guó)東北地區(qū)，北五味子是重要的藥用植物，同時(shí)也是重要的經(jīng)濟(jì)作物，在長(zhǎng)達(dá)10～20 a的種植過(guò)程中，極易發(fā)生黑斑病。艾軍等[1]已證實(shí)，北五味子黑斑病病原菌為交鏈孢屬(Alternaria)真菌，通?？汕秩疚逦蹲又仓耆~片、莖、果實(shí)等部位，嚴(yán)重時(shí)造成植株枯死，影響植株的生長(zhǎng)以及果實(shí)的產(chǎn)量，同時(shí)在一定程度上也會(huì)降低五味子果實(shí)的品質(zhì)。

當(dāng)植物受到病菌侵染時(shí)，體內(nèi)一系列防御酶活性發(fā)生變化，通過(guò)對(duì)防御酶活性進(jìn)行測(cè)定，可以衡量植株的抗病能力[2-4]。超氧化物歧化酶(SOD)能清除機(jī)體新陳代謝中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基，維持機(jī)體活性氧代謝的平衡。過(guò)氧化物酶(POD)可以影響植物體內(nèi)多種代謝途徑，從而在抗病性中起著間接作用[5-7]。多酚氧化酶(PPO)參與酚類化合物的氧化，在植物中能夠參與酮類和木質(zhì)素的合成，抑制病原菌的繁殖和擴(kuò)張[8]。苯丙氨酸解氨酶(PAL)主要參與植物中植保素和木質(zhì)素的合成，前者能直接抑制病原物的生長(zhǎng)發(fā)育和侵染，后者可以增強(qiáng)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，形成病原菌入侵的機(jī)械屏障。本試驗(yàn)選取SOD、POD、PPO、PAL活性和葉綠素含量作為評(píng)價(jià)抗病性的主要指標(biāo)，以同一生長(zhǎng)環(huán)境下不同生長(zhǎng)年限北五味子植株為材料，通過(guò)對(duì)其黑斑病發(fā)病率和感染程度進(jìn)行田間調(diào)查，同時(shí)對(duì)植株葉片進(jìn)行生理生化指標(biāo)檢測(cè)，分析黑斑病的感染規(guī)律，為北五味子植株的差異化管理提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

以吉林紫鑫紅石種養(yǎng)殖有限公司北五味子種植基地的不同生長(zhǎng)年限北五味子植株為研究對(duì)象。基地位于吉林省通化市柳河縣紅石鎮(zhèn)，擁有北五味子種植園10余處，每個(gè)北五味子種植園占地約0.2 hm2，種植密度約為15 000株/hm2。

1.2 田間調(diào)查方法

于2017年6—8月在種植基地進(jìn)行調(diào)查，將每個(gè)果園劃分為4塊，每塊按照5點(diǎn)法進(jìn)行取樣，每個(gè)年限選取100株樣本，記錄感染黑斑病的植株數(shù)量，同時(shí)每個(gè)生長(zhǎng)年限選取10株按下面的葉片分級(jí)方法進(jìn)行調(diào)查，按不同的感染級(jí)別記錄發(fā)病情況，結(jié)果表示為每100片葉中各病級(jí)葉片數(shù)量。

葉片分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，葉片沒(méi)有病斑；1級(jí)，葉片病斑占葉面積比例為25%以下；2級(jí)，葉片病斑占葉面積比例為25%～50%；3級(jí)，葉片病斑占葉面積比例為50%～75%；4級(jí)，葉片病斑占葉面積比例為75%以上。

按照以下公式計(jì)算病情指數(shù)：

1.3 生理生化指標(biāo)的測(cè)定

每個(gè)感病級(jí)別選取葉面積與生長(zhǎng)位置基本一致的葉子5片，設(shè)3次重復(fù)，帶回實(shí)驗(yàn)室后進(jìn)行處理，SOD活性測(cè)定選擇連苯三酚自氧法[9]計(jì)算自由基清除率，POD活性測(cè)定選擇愈創(chuàng)木酚法[10]，PAL活性測(cè)定選擇L-苯丙氨酸法[11]，PPO活性測(cè)定選擇兒茶酚氧化法[12]，葉綠素含量測(cè)定時(shí)去除病斑，選剩余部位進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 19.0和Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 北五味子黑斑病田間調(diào)查結(jié)果

2.1.1 植株發(fā)病率 隨著種植年限的增加，北五味子植株黑斑病發(fā)病率前期急劇增加，后期增加速率放緩(表1)。從2年生的13%到4年生的27%，感病植株數(shù)量增加107.7%；6年生植株發(fā)病率為32%，比4年生植株多出18.5%，比2年生植株多出146.2%。4年生北五味子感病植株對(duì)比2年生植株的增加數(shù)量>6年生植株對(duì)比4年生植株的增加數(shù)量。因此，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，黑斑病的發(fā)病率會(huì)增加，但是增加速度減緩。

2.1.2 葉片感病程度 隨著北五味子植株種植年限的增加，健康葉片數(shù)量逐漸減少，輕微感病葉片數(shù)量明顯增加(表1)。2年生北五味子植株葉片中占比最高的是健康葉片，為49.3片，4年生和6年生北五味子植株葉片中占比最高的是輕度染病葉片(1級(jí))，分別為44.6片和46.1片。不同年生北五味子植株健康葉片的數(shù)量表現(xiàn)出顯著差異， 2年生植株健康葉片數(shù)量最多，4年生植株為36.4片，較2年生植株降低26.6%，6年生植株為32.8片，較4年生植株降低9.9%，較2年生植株降低33.5%。2年生北五味子植株的輕度感染葉片數(shù)量顯著低于4年生植株和6年生植株，后者相比前者分別提升27.06%和31.34%。6年生北五味子植株的重度感染葉片(3級(jí)和4級(jí))數(shù)量最多，相比4年生植株增加27.5%，相比2年生植株增加58.5%。

隨著生長(zhǎng)年限的增加，植株葉片病情指數(shù)也明顯升高(表1)。2年生北五味子植株的葉片病情指數(shù)為18.4，顯著低于4年生植株和6年生植株,后者相對(duì)于前者分別升高22.82%和34.78%，4年生北五味子植株相比2年生植株的病情指數(shù)增加量高于6年生植株相比4年生植株的增加量。

綜上所述，在北五味子植株多年的生長(zhǎng)過(guò)程中，黑斑病的發(fā)病率和感染程度都呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，生長(zhǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，增加的速度越緩慢。植株的生長(zhǎng)年限越長(zhǎng)，嚴(yán)重感病葉片所占的比例也越高，嚴(yán)重制約了北五味子植株的健康生長(zhǎng)。

表1 不同生長(zhǎng)年限北五味子植株黑斑病發(fā)病率和葉片感染程度調(diào)查結(jié)果

注：同一生長(zhǎng)年限的葉片總數(shù)為100片；同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 北五味子葉片生理生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

2.2.1 SOD活性 從圖1可以看出，SOD活性隨著黑斑病侵染面積的增加發(fā)生了明顯變化，2年生北五味子植株葉片的SOD活性逐漸降低，而4年生植株和6年生植株先增加后降低再增加。2年生植株的最大酶活性出現(xiàn)在未感病葉片，而4年生植株和6年生植株均出現(xiàn)在感染面積25%以下葉片。4年生和6年生植株在相同的感病程度時(shí)酶活性之間差異不顯著。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同圖1 不同生長(zhǎng)年限北五味子葉片SOD活性

2.2.2 POD活性 從圖2可以看出，隨著感染程度的增加，2年生北五味子植株葉片的POD活性先降低后增加再降低，4年生植株葉片酶活性先升高后降低再升高，6年生植株葉片酶活性為先升高后降低。2年生植株的最大酶活性出現(xiàn)在感染面積占25%～50%的中度感染葉片，而另外兩者出現(xiàn)在感染面積25%以下的輕度染病葉片，4年生植株在感染面積75%以上時(shí)出現(xiàn)第2個(gè)酶活性峰值。3種生長(zhǎng)年限植株的健康葉片中，2年生植株葉片的POD活性最高，與其他兩者存在顯著差異。

圖2 不同生長(zhǎng)年限北五味子葉片POD活性

2.2.3 PPO活性 從圖3可以看出，隨著感染程度的增加，2年生植株葉片的PPO活性先降低后增加，最大酶活性出現(xiàn)在未感病葉片，而4年生植株和6年生植株的PPO活性先增加后降低，最大酶活性出現(xiàn)在感染面積25%以下的輕度染病葉片，在感染面積達(dá)到50%以上時(shí)，酶活性降低到與未感病葉片相似的水平。3種生長(zhǎng)年限植株的健康葉片中，2年生植株的PPO活性最高，與其他兩者存在顯著差異。

圖3 不同生長(zhǎng)年限北五味子葉片PPO活性

2.2.4 PAL活性 從圖4可以看出，隨著感染程度的增加，2、4、6年生植株葉片的PAL活性均表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢(shì)，在感染面積達(dá)到25%以上時(shí)酶活性衰減到與未感病葉片相近的水平；三者的PAL活性峰值均出現(xiàn)在感染面積為25%以下時(shí)；三者之中，4年生植株葉片酶活性的變化值最大，2年生植株葉片酶活性變化值最小。

圖4 不同生長(zhǎng)年限北五味子葉片PAL活性

2.2.5 葉綠素含量 通過(guò)圖5和圖6可以看出，隨著感染程度的增加，北五味子植株葉片的葉綠素含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但相鄰2個(gè)感染級(jí)別之間沒(méi)有顯著差異；不同生長(zhǎng)年限植株的葉片葉綠素含量進(jìn)行對(duì)比，在感染程度較低時(shí)2年生植株的葉綠素含量高于4年生植株，在感染程度較高時(shí)，其他二者的葉綠素含量高于2年生植株。葉綠素a/b值隨感染程度的增加呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，總體上2年生植株的a/b值低于其他兩者。三者在相同感染級(jí)別之間不存在顯著差異。

圖5 不同生長(zhǎng)年限北五味子葉片葉綠素含量

圖6 不同生長(zhǎng)年限北五味子葉片葉綠素a/b值

綜上所述，北五味子植株未感病葉片的4種酶活性測(cè)定結(jié)果中，2年生植株的各種酶活性顯著高于其他2種生長(zhǎng)年限的植株，更能抵抗病原菌的初期感染；4年生和6年生植株在葉片的感病面積為25%以下時(shí)，各種防御酶活性達(dá)到峰值，抵抗病原菌的能力最強(qiáng)；POD和PPO活性在感染面積從25%增加到50%的過(guò)程中變化不大，其余2種酶活性表現(xiàn)出較大幅度的降低，當(dāng)感染面積繼續(xù)增加時(shí)，植株體內(nèi)防御酶活性不足以抵抗病菌侵染所造成的傷害，各種酶活性表現(xiàn)出降低趨勢(shì)。葉綠素含量的測(cè)定結(jié)果差異不顯著。

3 結(jié)論與討論

植物體內(nèi)存在的抗氧化酶系統(tǒng)，是植物在逆境脅迫下的重要防御體系之一[13]。SOD和POD能有效清除逆境脅迫下產(chǎn)生的過(guò)多活性氧，避免自由基對(duì)植物的細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)產(chǎn)生破壞作用，從而減輕對(duì)植物體的傷害[14]。PPO能使一元酚和二元酚氧化產(chǎn)生醌，對(duì)病原菌有抑制和毒殺作用[15]。PAL是植物苯丙烷代謝途徑的重要反應(yīng)酶，而苯丙烷代謝途徑產(chǎn)生的多種次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)植物的生長(zhǎng)有著重要作用，同時(shí)在植物抗逆和抗病方面也表現(xiàn)出重要作用，因此也可以作為植物抗逆和抗病的一項(xiàng)重要生理指標(biāo)[16]。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)北五味子植株正常葉片與感病葉片進(jìn)行SOD、POD、PPO、PAL活性和葉綠素含量的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，黑斑病的侵染會(huì)造成相關(guān)酶活性的顯著升高，但葉綠素含量之間的差異并不顯著，說(shuō)明SOD、POD、PPO、PAL的活性可以作為北五味子植株黑斑病抗性研究的參考指標(biāo)。

當(dāng)植物受到病原菌侵染后，體內(nèi)保護(hù)酶活性產(chǎn)生變化，當(dāng)其不足以抵抗病原菌的侵害時(shí)，體內(nèi)酶活性開始降低。通過(guò)對(duì)不同生長(zhǎng)年限北五味子植株健康葉片進(jìn)行防御酶活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，2年生植株健康葉片的各種酶活性顯著高于4年生和6年生植株，說(shuō)明2年生北五味子植株在病原菌侵染的初期階段，能有效抵抗病原菌的侵染。4年生和6年生北五味子植株葉片酶活性峰值出現(xiàn)在感染面積25%以下的葉片，此階段是防御酶起作用的主要階段。因此，隨著種植年限的逐漸增加，植株防御酶對(duì)于黑斑病的主要抗性作用階段由感染初期轉(zhuǎn)移到感染中期。

對(duì)比北五味子植株黑斑病的發(fā)病率和感染程度調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著生長(zhǎng)年限的增加，北五味子植株黑斑病發(fā)病率和感染程度都顯著增加，單個(gè)植株中各級(jí)葉片數(shù)量表現(xiàn)為由健康葉片占主體轉(zhuǎn)變?yōu)橛奢p度感染葉片占主體。結(jié)合葉片的生理活性變化發(fā)現(xiàn)，2年生北五味子植株健康葉片表現(xiàn)出較高的防御酶活性，有助于抵抗黑斑病病原菌的初期感染，因此發(fā)病率和感染程度較4年生和6年生植株低。