豌豆種質(zhì)資源嫩梢中槲皮素和山奈酚含量的多樣性分析

曹曉華，程先驕，林兆娜，程祖鋅，許 明，鄭金貴*

(1.福建省特種作物育種與利用工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué) 作物科學(xué)學(xué)院/作物遺傳育種與綜合利用教育部重點實驗室，福建 福州 350002)

豌豆(PisumsativumL.)是豆科(Leguminosae)蝶形花亞科(Papilionoideae)野豌豆族(Viceae)豌豆屬(Pisum)的一個種，一年生(春播)或越年生(秋播)草本植物，是世界第四大食用豆類作物[1]。中國是世界第二大豌豆主產(chǎn)國，南北各地均有栽培，約有2 000多年的栽培歷史[2]。豌豆利用率高，不僅干籽粒、嫩莢、青?？墒秤?，枝蔓尖端的嫩梢或嫩莖尖(俗稱豌豆尖)亦可食用。豌豆嫩梢口感鮮嫩、美味清爽，高鉀低鈉低脂(0.3%)，富含多種膳食營養(yǎng)素[3]，每100 g鮮樣中含有類黃酮329 mg、類胡蘿卜素31.3 mg、維生素C 153.94 mg、葉黃素12.1 mg、膳食纖維2.0 g、鉀315.97 mg、鈉5.08 mg[4]，是一種優(yōu)質(zhì)且具有消腫利水、清肝明目、預(yù)防心血管疾病等食療功效的綠葉類蔬菜，非常適合水腫患者和高血壓患者食用[5-6]。豌豆嫩梢的類黃酮含量在蔬菜中較高[4,7]，主要為槲皮素和山奈酚[4,8]。槲皮素和山奈酚具有多種生物活性，如抗氧化、抗炎、降低心血管疾病和某些腫瘤的發(fā)病風(fēng)險等[9-15]，日常膳食中增加其攝入量對人體健康非常有益。

目前，國內(nèi)外對豌豆嫩梢的研究主要集中在栽培技術(shù)方面[16-17]，部分研究人員對豌豆嫩梢的常規(guī)營養(yǎng)成分[3,18]和保健功能成分[4,8,18-20]進行了檢測分析，但未見豌豆種質(zhì)資源嫩梢中槲皮素和山奈酚含量的多樣性研究報道。因此，對84份豌豆種質(zhì)資源嫩梢中槲皮素和山奈酚的含量進行測定，并對其進行多樣性分析和聚類分析，以期篩選出嫩梢中槲皮素和山奈酚含量高的優(yōu)異豌豆種質(zhì)資源，為今后開發(fā)保健蔬菜制品奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

參試豌豆種質(zhì)資源84份(表1)，從臺灣亞蔬中心及國內(nèi)市場引進。試驗在福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)研究所試驗田進行。試驗田地勢平坦，排灌方便，土壤肥力中等，畦長4 m、寬1 m，溝寬0.4 m，一畦種植3個品種，相鄰的2個品種間行距50 cm，同一品種間行距35 cm，每個品種種植3行，每行3穴，即每個品種9穴，每穴播種3～4粒。84份豌豆種子于2016年11月18日播種，播種后覆土1～2 cm，并對每一個品種進行掛牌區(qū)分。試驗中田間管理措施一致，適時澆水追肥、中耕除草以及引蔓。2017年2月6日采摘豌豆枝蔓尖端的嫩梢，84份試驗材料被迅速運回實驗室，80 ℃烘干，粉碎，過網(wǎng)篩孔徑為0.425 mm的篩子以備測定槲皮素和山奈酚含量。

表1 豌豆種質(zhì)資源的編號、來源地及其花色

續(xù)表1 豌豆種質(zhì)資源的編號、來源地及其花色

1.2 豌豆嫩梢中槲皮素和山奈酚含量的測定

采用UPLC法測定豌豆嫩梢中槲皮素和山奈酚的含量[19]：采用Waters ACQUITY UPLC BEH Shield RP18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流動相為乙腈-0.1%冰醋酸水溶液(60∶40)，流速為0.4 mL/min，槲皮素檢測波長為371 nm，山奈酚檢測波長為366 nm，柱溫30 ℃，進樣量2 μL，時間為3.5 min。

配制一系列含槲皮素質(zhì)量濃度為0、30、60、90、120、150、180 μg/mL和含山奈酚質(zhì)量濃度為0、15、30、45、60、90、150 μg/mL的混合對照品溶液，依次進樣，以對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，測得的峰面積為縱坐標(biāo)，得槲皮素和山奈酚標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為y=18 924x-2 830.5(R2=1.000 0)和y=19 122x-8 018.7(R2=0.999 4)。

精密稱取約250 mg試樣粉末于50 mL CRYSTALGEN離心管中，加甲醇-10%鹽酸(4∶1，V/V)混合液25 mL，用漩渦混勻器混勻，于70 ℃時超聲提取90 min，立即用冷水冷卻，用甲醇補足減失的質(zhì)量，混勻。過0.45 μm的濾膜，即得樣品溶液，進樣，所有試樣平行測定3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 19.0和Microsoft Excel 2010軟件對84份豌豆種質(zhì)資源嫩梢中槲皮素和山奈酚含量的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、極小值、極大值等進行描述統(tǒng)計，并計算其變異系數(shù)和多樣性指數(shù)[20]，繪制分布直方圖；對不同來源地和不同花色的豌豆嫩梢中槲皮素和山奈酚的含量進行方差分析；同時采用組間連接、歐式平方距離法,以嫩梢中槲皮素和山奈酚的含量對84份豌豆種質(zhì)資源進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 豌豆種質(zhì)資源嫩梢中槲皮素和山奈酚含量的描述統(tǒng)計分析及其分布特征

84份豌豆種質(zhì)資源嫩梢中槲皮素和山奈酚含量的均值、標(biāo)準(zhǔn)差、極小值、極大值、極差、變異系數(shù)和多樣性指數(shù)見表2。由表2可知，豌豆種質(zhì)資源嫩梢中槲皮素和山奈酚含量的多樣性指數(shù)均較高，其中，槲皮素含量的多樣性指數(shù)為2.740，山奈酚含量的多樣性指數(shù)為1.877，說明豌豆種質(zhì)資源嫩梢中槲皮素和山奈酚的含量存在豐富的多樣性。不同豌豆種質(zhì)資源嫩梢中槲皮素、山奈酚含量的變異系數(shù)和極差也較大，表明不同豌豆種質(zhì)資源嫩梢中槲皮素和山奈酚的含量存在明顯的基因型差異。84份豌豆嫩梢的槲皮素含量平均為7.08 mg/g，山奈酚含量平均為2.36 mg/g，說明豌豆嫩梢中槲皮素和山奈酚含量較高，且明顯高于金錢草[21]、白花蛇舌草[22]和瓦松[23]等植物。

表2 豌豆種質(zhì)資源嫩梢中槲皮素和山奈酚含量的描述性統(tǒng)計分析

84份豌豆種質(zhì)資源嫩梢中槲皮素和山奈酚含量的分布直方圖如圖1所示，可以看出，槲皮素和山奈酚的含量均符合正態(tài)分布，其中，89.3%的豌豆種質(zhì)資源嫩梢中的槲皮素含量為3.44～10.04 mg/g，83.3%的豌豆種質(zhì)資源嫩梢中的山奈酚含量為1.00～4.00 mg/g。

2.2 不同來源地豌豆種質(zhì)資源嫩梢中槲皮素和山奈酚的含量

84份豌豆種質(zhì)資源按照來源國家和地區(qū)被分成13個組群，方差分析和S-N-K多重比較結(jié)果見表3。從表3可知，不同來源地豌豆種質(zhì)資源嫩梢中槲皮素、山奈酚的含量差異均達到極顯著水平，其中，槲皮素平均含量最高的為荷蘭品種(8.54 mg/g)，與中國、馬來西亞、敘利亞的品種差異不顯著，但顯著高于泰國、中國臺灣等9個國家和地區(qū)的品種(P<0.05)，并極顯著高于泰國、中國臺灣等8個國家和地區(qū)的品種(P<0.01)；泰國品種的槲皮素平均含量最低(2.73 mg/g)，荷蘭品種是泰國品種的3.13倍。山奈酚平均含量最高的是泰國品種(5.86 mg/g)，極顯著高于其他12個國家和地區(qū)的品種(P<0.01)，其后依次為越南、中國臺灣的品種，而丹麥品種的山奈酚平均含量最低(0.46 mg/g)，泰國品種是丹麥品種的12.74倍。

圖1 84份豌豆種質(zhì)資源嫩梢中槲皮素和山奈酚含量分布

表3 不同來源地豌豆種質(zhì)資源嫩梢中槲皮素和山奈酚的含量

注：同列不同小寫字母和大寫字母分別表示在5%和1%水平上差異顯著，下同。

2.3 不同花色豌豆種質(zhì)資源嫩梢中槲皮素和山奈酚的含量

84份豌豆種質(zhì)資源按花色分為白色、紫紅色和粉紅色3種類型，方差分析和S-N-K多重比較結(jié)果見表4。由表4可知，不同花色豌豆種質(zhì)資源嫩梢中槲皮素、山奈酚含量的差異均達到極顯著水平；84份豌豆種質(zhì)資源的花色主要為白色(37份)和紫紅色(43份)，這2種類型的豌豆嫩梢中槲皮素和山奈酚的平均含量較為接近，未表現(xiàn)出顯著差異，但其槲皮素平均含量均極顯著高于粉紅色類型(P<0.01)，而山奈酚平均含量卻均極顯著低于粉紅色類型(P<0.01)。

表4 不同花色豌豆種質(zhì)資源嫩梢中槲皮素和山奈酚的含量

2.4 豌豆種質(zhì)資源嫩梢中槲皮素和山奈酚含量的聚類分析

通過SPSS 19.0采用組間連接的聚類方法及歐式平方距離的度量標(biāo)準(zhǔn)對84份豌豆種質(zhì)資源嫩梢中槲皮素和山奈酚的含量進行Q型聚類分析，結(jié)果見圖2。在歐式平方距離為5處，可將84份豌豆種質(zhì)資源分為五大類群，其中，A1、A6、A55等56個品種聚為第Ⅰ類群，占66.67%； A38、A39、A41等16個品種聚為第Ⅱ類群，占19.05%；A58單獨1個品種聚為第Ⅲ類群，占1.19%；A67、A68、A73、A83、A10、A47這6個品種聚為第Ⅳ類群，占7.14%；A43、A44、A12、A64、A71這5個品種聚為第Ⅴ類群，占5.95%。進一步研究發(fā)現(xiàn)，豌豆種質(zhì)資源嫩梢中槲皮素和山奈酚的含量聚類結(jié)果與來源地?zé)o關(guān)，山奈酚含量聚類結(jié)果與花色有一定關(guān)系。

各類群豌豆種質(zhì)資源槲皮素和山奈酚的平均含量及變異系數(shù)見表5。從表5可以看出，類群Ⅳ種質(zhì)的槲皮素平均含量最高(11.79 mg/g)，且變異系數(shù)較小(8.74%)，其后依次為類群Ⅲ、類群Ⅰ、類群Ⅱ的種質(zhì)，類群Ⅴ種質(zhì)的槲皮素平均含量(3.16 mg/g)最低且變異系數(shù)最大(27.53%)；類群Ⅴ種質(zhì)的山奈酚平均含量最高(5.33 mg/g)，變異系數(shù)相對較小(12.95%)，其后依次為類群Ⅲ、類群Ⅱ、類群Ⅳ的種質(zhì)，類群Ⅰ的山奈酚含量最低(1.80 mg/g)，且變異系數(shù)最大(33.89%)。綜合分析可以看出，類群Ⅳ為高槲皮素含量的豌豆種質(zhì)資源，類群Ⅴ為高山奈酚含量的豌豆種質(zhì)資源，類群Ⅲ為槲皮素和山奈酚含量都較高的豌豆種質(zhì)資源。

圖2 84份豌豆種質(zhì)資源嫩梢中槲皮素和山奈酚含量的聚類分析

類群種質(zhì)數(shù)/份指標(biāo)含量均值/(mg/g)變異系數(shù)/%Ⅰ56槲皮素7.37±1.0514.25山奈酚1.80±0.6133.89Ⅱ16槲皮素5.40±0.6111.30山奈酚3.23±0.8325.70Ⅲ1槲皮素8.99±0.434.78山奈酚4.82±0.265.39Ⅳ6槲皮素11.79±1.038.74山奈酚2.28±0.7332.02Ⅴ5槲皮素3.16±0.8727.53山奈酚5.33±0.6912.95

3 結(jié)論與討論

豌豆種質(zhì)資源嫩梢中槲皮素和山奈酚的含量存在豐富的多樣性，說明不同豌豆種質(zhì)資源嫩梢中槲皮素和山奈酚含量存在明顯的基因型差異，這與Koh等[24]對西蘭花的研究結(jié)果相一致。豌豆嫩梢中槲皮素和山奈酚的含量與一些傳統(tǒng)中藥材相當(dāng)，甚至更高。類群Ⅳ豌豆種質(zhì)資源嫩梢中的槲皮素含量與荷葉[25]、銀杏落葉[26]相當(dāng)；84份豌豆種質(zhì)資源嫩梢槲皮素平均含量(7.08 mg/g)是瓦松的25倍[23]、金錢草的15倍[21]、白花蛇舌草的14倍[22]；山奈酚平均含量(2.36 mg/g)是瓦松的3倍[23]、金錢草的2倍[21]、白花蛇舌草的15倍[22]。豌豆嫩梢中的槲皮素含量普遍高于山奈酚含量，其含量在蔬菜中名列前茅[27]。郭長江[27]研究發(fā)現(xiàn)，所檢測的大部分蔬菜中茴香、洋蔥、豌豆嫩梢的槲皮素含量最高。本研究發(fā)現(xiàn)，豌豆嫩梢的槲皮素含量比茴香[28]高，其中，A67和A68與日本黃皮洋蔥相當(dāng)，但比紫皮洋蔥低[29]。

同時，本研究發(fā)現(xiàn)，豌豆嫩梢中槲皮素和山奈酚的含量與來源地和花色均有關(guān)。傅建敏等[30]研究不同地域來源柿種質(zhì)資源葉片中槲皮素、山奈酚、粗黃酮和多酚的含量發(fā)現(xiàn)，槲皮素含量與地域來源未表現(xiàn)出顯著的相關(guān)性，來源地對山奈酚、粗黃酮和多酚含量均有顯著影響。本研究卻發(fā)現(xiàn)，來源地、花色對槲皮素和山奈酚含量均有極顯著或顯著影響，其中花色為白色和紫紅色的豌豆種質(zhì)間槲皮素和山奈酚含量差異不顯著，但花色為白色、紫紅色的碗豆種質(zhì)與花色為粉紅色的豌豆種質(zhì)間槲皮素、山奈酚含量差異均達到極顯著水平。

本研究對84份豌豆種質(zhì)資源嫩梢中槲皮素和山奈酚的含量進行了系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果顯示，豌豆資源嫩梢中槲皮素和山奈酚含量的聚類結(jié)果與來源地?zé)o關(guān)，但山奈酚含量的聚類結(jié)果與花色有一定關(guān)系，山奈酚平均含量最高的類群為類群Ⅴ，包含5份豌豆種質(zhì)資源，前4名均為粉紅花色，推測粉紅花色的豌豆品種嫩梢中的山奈酚含量高。系統(tǒng)聚類法將84份豌豆種質(zhì)資源劃分為5大類群，其中，類群Ⅳ種質(zhì)的槲皮素含量高，類群Ⅴ種質(zhì)的山奈酚含量高，類群Ⅲ種質(zhì)的槲皮素和山奈酚含量均較高，這3個類群的豌豆種質(zhì)資源可發(fā)展為功能型豌豆葉用資源，為高槲皮素或高山奈酚豌豆品種的選育提供了良好的試驗材料。