昆蟲桿狀病毒基因組學(xué)研究進展

梁振普，劉雅靜，張小霞，李鵬娟，王 亮，張俊慶

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

桿狀病毒屬于桿狀病毒科(Baculoviridae)，是一類寄生于節(jié)肢動物(Arthropoda)的專一性病原微生物，其宿主主要是鱗翅目(Lepidoptera)、膜翅目(Hymenoptera)和雙翅目(Diptera)的昆蟲。已經(jīng)完成測序的基因組大小為80～180 kb不等，編碼89～181個開放閱讀框(ORF)[1]，被包裹在長度為230～385 nm、直徑為40～60 nm的桿狀核衣殼中[2-3]。目前已從800多種昆蟲中分離鑒定出600多種桿狀病毒[4]。桿狀病毒在其復(fù)雜的復(fù)制周期中產(chǎn)生2種不同類型的病毒粒子：出芽型病毒(Budded virus，BV)和包涵體型病毒(Occlusion-derived virus，ODV)[5]。2種病毒粒子在病毒感染過程中的作用存在明顯差異，BV是桿狀病毒在昆蟲體內(nèi)傳播或在培養(yǎng)細胞中傳播所必需的，而ODV在桿狀病毒經(jīng)口感染宿主過程中發(fā)揮重要作用[6]。桿狀病毒可根據(jù)包涵體的形態(tài)特征分為2類：多角體病毒(Nucleopolyhedrovirus，NPV)和顆粒體病毒(Granulovirus，GV)[7]。NPV和GV形態(tài)存在明顯差異，NPV包涵體包埋多個病毒粒子，呈不規(guī)則多角體形狀，而 GV僅僅包埋1個病毒粒子，呈圓形或卵圓形。其中，NPV根據(jù)病毒粒子囊膜內(nèi)核衣殼的數(shù)目又劃分為單粒包埋型核型多角體病毒(SNPV)和多粒包埋型核型多角體病毒(MNPV)。感染鱗翅目昆蟲的NPV又根據(jù)BV中是否含有GP64蛋白分為2類：Group Ⅰ和Group Ⅱ[8]。Group Ⅰ的NPV利用GP64作為BV的融合蛋白， 而Group Ⅱ的NPV由于缺少gp64基因，由F蛋白代替作為BV的融合蛋白。2006年Jehle等[9]基于基因組特征將桿狀病毒分為4個屬：α桿狀病毒屬(Alphabaculovirus，感染鱗翅目昆蟲的NPV)、β桿狀病毒屬(Betabaculovirus，感染鱗翅目昆蟲的GV)、γ桿狀病毒屬(Gammabaculovirus，感染膜翅目昆蟲的NPV)、δ桿狀病毒屬(Deltabaculovirus，感染雙翅目昆蟲的NPV)。

桿狀病毒殺蟲劑與傳統(tǒng)農(nóng)藥相比，有著宿主專一性強、環(huán)境兼容性好、對人畜無害、同時在環(huán)境中存活時間長等優(yōu)勢，是未來農(nóng)藥理想的發(fā)展方向[10]。除了在生物農(nóng)藥中的應(yīng)用，昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于外源基因的表達，相對于原核表達系統(tǒng)和真核表達系統(tǒng)具有產(chǎn)物后加工好、成本低廉等優(yōu)點，因而廣泛應(yīng)用于商業(yè)領(lǐng)域如生物醫(yī)藥、疫苗研發(fā)等方面。桿狀病毒除了以上2個方面的應(yīng)用，還可以應(yīng)用于哺乳動物基因轉(zhuǎn)移載體、表面展示系統(tǒng)以及病毒樣顆粒疫苗制備。鑒于此，綜述了桿狀病毒基因組學(xué)研究進展，以促進對桿狀病毒結(jié)構(gòu)和功能的了解，為更好地開發(fā)和利用桿狀病毒提供借鑒。

1 桿狀病毒基因組

1.1 基因組特征

自從1994年Ayres等[11]報道苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographacalifornicamultiple nucleopolyhedrovirus, AcMNPV)C6株的全基因組序列以來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)手段的飛速發(fā)展，已有73種桿狀病毒全基因組被測定，包括45種α桿狀病毒、22種β桿狀病毒、1種δ桿狀病毒、3種γ桿狀病毒和2種未分類病毒(表1)。通過對不同桿狀病毒基因組比較發(fā)現(xiàn)，其基因組大小介于80～180 kb，G+C含量在29%～58%，全長大于50個氨基酸的ORF有89～181個。這些ORF幾乎均勻地分布在基因組DNA的2條鏈上，轉(zhuǎn)錄方向沒有偏好性，基因之間的基因間序列非常短，甚至基因之間有重疊。非編碼區(qū)占10%左右，主要由基因啟動子序列、基因上游或下游非編碼區(qū)和同源重復(fù)區(qū)(Homologous regions，hrs)組成。

表1 GenBank數(shù)據(jù)庫中已注冊的桿狀病毒基因組信息

續(xù)表1 GenBank數(shù)據(jù)庫中已注冊的桿狀病毒基因組信息

注：所有數(shù)據(jù)均來自https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/GenomesGroup.cgi? taxid =10442。

1.2 核心基因

盡管不同種桿狀病毒基因組存在基因組成的多樣性，但研究發(fā)現(xiàn)，有1套相對保守的基因存在于目前已測序的桿狀病毒基因組中。2012年Garavaglia等[12]研究發(fā)現(xiàn)37個桿狀病毒核心基因。2017年Javed等[13]報道了第38個核心基因pif7 (ac110)。目前，桿狀病毒的核心基因數(shù)目為38個，具體分類和名稱見表2。按照核心基因的功能可以分為五大類：復(fù)制，轉(zhuǎn)錄，包裝、裝配和釋放，口服感染，與宿主細胞相互作用。在核心基因編碼產(chǎn)物中，大約1/2是參與衣殼和ODV囊膜組成以及感染幼蟲所必須的蛋白質(zhì)。其他大部分參與DNA的復(fù)制或加工，或者與晚期或極晚期轉(zhuǎn)錄有關(guān)。這些核心基因因其重要性在長期進化中得以保留，并成為桿狀病毒的重要標(biāo)志[14]。隨著研究的深入也許會發(fā)現(xiàn)更多的核心基因，因為病毒許多共有的基因在進化過程中發(fā)生了突變而沒有被分析出來。

表2 桿狀病毒核心基因及分類

2 桿狀病毒功能基因組學(xué)

2.1 RNA轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因

桿狀病毒基因組的轉(zhuǎn)錄表達是按時序進行的。根據(jù)桿狀病毒基因在病毒復(fù)制過程中的表達時間可分為極早期、早期、晚期和極晚期[15]。早期基因的合成依賴宿主RNA聚合酶Ⅱ識別和轉(zhuǎn)錄，而晚期基因則是病毒編碼的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄[16]。

轉(zhuǎn)錄活化因子IE-1與桿狀病毒基因組中的hrs相互作用形成二聚體，該二聚體可與宿主的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)相互作用從而促進早期基因的轉(zhuǎn)錄。桿狀病毒晚期基因利用的RNA聚合酶，由4個轉(zhuǎn)錄晚期和極晚期基因的亞基構(gòu)成(LEF-4、LEF-8、LEF-9和P47)[16]。LEF-4是一種參與RNA加帽的酶。在LEF-8的C端發(fā)現(xiàn)很多物種RNA聚合酶的保守基序，它編碼RNA聚合酶的催化位點[17]。LEF-9存在與RNA聚合酶β亞基同源的基序，編碼酶活化中心Mg2+結(jié)合位點[18]。P47是RNA聚合酶中較小的亞基，與其他RNA聚合酶沒有同源性[19]。LEF-5和VLF-1也和晚期基因的轉(zhuǎn)錄相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，LEF-5可與自身相互作用且C端含有一段與RNA聚合酶Ⅱ延長因子TFIIS類似的結(jié)構(gòu)域。通過對LEF-5進行純化分析表明，LEF-5的功能是起始轉(zhuǎn)錄，而非延伸因子[20]。VLF-1與多角體蛋白和P10的轉(zhuǎn)錄相關(guān)。VLF-1與多角體和P10基因啟動子下游的“爆發(fā)序列”結(jié)合引發(fā)它們的大量表達[21]。其他與晚期基因表達有關(guān)的基因為lef-6、lef-10、lef-12和39k。此外，甲基轉(zhuǎn)移酶(Ac69)、ADP-核糖焦磷酸水解酶、LEF-2和PK1也可能參與了晚期基因的表達。

2.2 DNA復(fù)制相關(guān)基因

病毒DNA復(fù)制相關(guān)基因在病毒生命周期中起著關(guān)鍵的作用。桿狀病毒DNA的復(fù)制是由順式作用元件、反式作用因子及其宿主細胞提供的復(fù)制因子共同作用而完成的。順式作用元件是指病毒DNA復(fù)制起點，它包括同源重復(fù)序列和非同源重復(fù)序列2類。反式作用因子是病毒表達產(chǎn)物，該產(chǎn)物是病毒DNA復(fù)制所必需的。瞬時復(fù)制試驗證明，dna-pol、helicase(p143)、ie-1、lef-1、lef-2和lef-3是DNA復(fù)制的必需基因。IE-1是一種多功能調(diào)節(jié)蛋白，它能夠反式激活多個早期基因和晚期基因的啟動子，且其酸性激活區(qū)是病毒DNA復(fù)制所必需的[22]。LEF-1具有DNA引物酶活性，可與LEF-2相互作用[23]。LEF-2是一種DNA引物酶協(xié)助因子，也是DNA復(fù)制所必需的[24]。LEF-3是一種單鏈結(jié)合蛋白(SSB)，也可運送病毒DNA解旋酶進入宿主細胞核中[25]。P143是病毒編碼的DNA解旋酶，具有ATP酶和解旋酶的活性。dna-pol編碼了病毒的DNA聚合酶，具有3′—5′外切核酸酶活性。P35、IE-2、PE38、LEF-7、VLF-1作為激活因子刺激病毒DNA的復(fù)制。AN具有5′—3′核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶的活性，參與DNA的重組[26]。

2.3 主要結(jié)構(gòu)蛋白基因

將桿狀病毒DNA轉(zhuǎn)染至相應(yīng)細胞可以正常產(chǎn)生有感染性的子代病毒，病毒的復(fù)制和增殖并不受影響。因此，推測病毒結(jié)構(gòu)蛋白對早期基因轉(zhuǎn)錄和病毒DNA復(fù)制并不是必需的[27]。桿狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白組成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)相當(dāng)于一個將病毒基因組轉(zhuǎn)入宿主細胞中的運載系統(tǒng)，是通過對宿主昆蟲的長期適應(yīng)進化演變而成的。有些結(jié)構(gòu)蛋白還具有其他酶活性，能夠促進和幫助病毒在細胞內(nèi)的復(fù)制。桿狀病毒產(chǎn)生的2種不同類型的病毒粒子BV和ODV，具有相同的核衣殼結(jié)構(gòu)但囊膜組分不同(圖1)。表3詳細列出了桿狀病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白基因，其主要編碼包涵體蛋白、BV和ODV的囊膜蛋白及核衣殼相關(guān)蛋白組分，其中后者大部分是BV和ODV共有的。

圖1 BV和ODV的結(jié)構(gòu)與主要蛋白質(zhì)構(gòu)成

蛋白質(zhì)分類基因名稱敲除后的影響包涵體蛋白polyhedrin可穩(wěn)定存在pe可穩(wěn)定存在enhancin可穩(wěn)定存在P10可穩(wěn)定存在alkaline proteasesBV囊膜蛋白gp64無法穩(wěn)定存在F-Protein可穩(wěn)定存在,但殺死幼蟲的時間延長V-ubiquitin可穩(wěn)定存在,但BV產(chǎn)量減少e26可穩(wěn)定存在ODV囊膜蛋白e26可穩(wěn)定存在e25無法穩(wěn)定存在ec43無法穩(wěn)定存在e18無法穩(wěn)定存在e66可穩(wěn)定存在vp91可穩(wěn)定存在ac145可穩(wěn)定存在,但經(jīng)口感染能力降低p74可穩(wěn)定存在,沒有經(jīng)口感染能力pif-1可穩(wěn)定存在,沒有經(jīng)口感染能力pif-2可穩(wěn)定存在,沒有經(jīng)口感染能力pif-3可穩(wěn)定存在,沒有經(jīng)口感染能力pif-4可穩(wěn)定存在,沒有經(jīng)口感染能力pif-5可穩(wěn)定存在,沒有經(jīng)口感染能力pif-6可穩(wěn)定存在,沒有經(jīng)口感染能力核衣殼相關(guān)蛋白p6.9無法穩(wěn)定存在vp39無法穩(wěn)定存在gp41無法穩(wěn)定存在38k無法穩(wěn)定存在p49無法穩(wěn)定存在ec27無法穩(wěn)定存在ac66受到嚴(yán)重影響 p33無法穩(wěn)定存在vp1054無法穩(wěn)定存在vlf-1無法穩(wěn)定存在vp80無法穩(wěn)定存在pp78/83無法穩(wěn)定存在p24可穩(wěn)定存在

3 桿狀病毒的應(yīng)用

桿狀病毒的分子生物學(xué)研究促進了對病毒組裝及感染周期的認識，具有重要的理論意義，同時也具有重要的實踐意義。目前，桿狀病毒已廣泛用作生物殺蟲劑和外源蛋白表達載體。此外，桿狀病毒作為基因治療載體也越來越受到重視。

3.1 殺蟲劑

昆蟲桿狀病毒殺蟲劑的研究始于19世紀(jì)。目前，已在20多個國家登記、生產(chǎn)和應(yīng)用了近40種病毒殺蟲劑[28]。野生型桿狀病毒殺蟲劑具有對人畜和天敵無害、宿主特異性高、無化學(xué)殘留、對環(huán)境安全、可自然傳播等優(yōu)點。然而，桿狀病毒的殺蟲速度慢、殺蟲譜窄等缺點限制了其推廣。為了克服桿狀病毒的缺點，科學(xué)家開始嘗試用各種分子生物學(xué)手段進行改造以獲得重組桿狀病毒。近年來，該方面的研究主要集中在以下幾個方面：(1)缺失內(nèi)源基因增加殺蟲效果。如將AcMNPV中的egt基因缺失，重組病毒會減少昆蟲的攝食，從而提高感染昆蟲的死亡率[29]。(2)插入外源基因提高殺蟲速度、降低害蟲對病毒的抗性。如插入昆蟲專性神經(jīng)毒素基因、昆蟲保幼激素酯酶基因、增效蛋白基因、蛋白酶基因、利尿激素基因等構(gòu)建的重組病毒，大大縮短了害蟲的發(fā)病時間。(3)內(nèi)源基因過量表達。如過量表達vfgf基因的重組AcMNPV明顯加速了寄主死亡[30]。(4)對宿主范圍基因操作來拓寬桿狀病毒宿主域。如將源自舞毒蛾核型多角體病毒(Lymantriadisparmultiple nucleopolyhedrovirus, LdMNPV)的hrf-1基因插入AcMNPV中，重組AcMNPV病毒可以在舞毒蛾細胞中復(fù)制[31]。隨著對重組病毒的深入研究，克服了桿狀病毒的缺點，也為增強病毒的殺蟲功能提供了可能。

3.2 表達載體

昆蟲桿狀病毒表達載體系統(tǒng)(Baculovirus expression system，BEVS)是基因工程四大表達系統(tǒng)之一，目前市場上商業(yè)化的桿狀病毒載體有Ac-Bacmid(來源于苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒基因組)和Bm-Bacmid(來源于家蠶核型多角體病毒基因組)[32-33]。它們在實際應(yīng)用過程中具有產(chǎn)物表達水平高，表達產(chǎn)物可進行翻譯后加工，外源蛋白的免疫原性、抗原性和功能等生物活性與天然蛋白質(zhì)相似，大規(guī)模生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品成本低等優(yōu)點。自1983年人們利用該表達系統(tǒng)首次成功表達人干擾素-β后，相繼成功表達了人生長因子、人2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶、人粒-巨噬細胞集落刺激因子和人抗白蛋白免疫蛋白G1等蛋白[34-37]。目前，美國FDA(食品和藥物管理局)已經(jīng)授權(quán)上市9種BEVS來源的產(chǎn)品，其中Cervarix?、Provenge?、Glybera?和Flublok?疫苗分別用于預(yù)防和治療子宮頸癌、前列腺癌、脂蛋白酶缺乏遺傳病和流感；Porcilis?Pesti、BAYOVAC CSF E2?、Circumvent?PCV、Ingelvac CircoFLEX?和Porcilis?PVC主要用于預(yù)防豬疫病[38]。昆蟲桿狀病毒表達載體系統(tǒng)可廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)等不同領(lǐng)域表達蛋白質(zhì)，為人類服務(wù)。

3.3 基因治療

基因治療是一種通過基因轉(zhuǎn)移載體將外源正常基因?qū)氚屑毎约m正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用，從而達到治療疾病目的的生物醫(yī)學(xué)技術(shù)。桿狀病毒相比于其他病毒轉(zhuǎn)移載體具以下優(yōu)點：(1)基因容量大，可容納1個或多個外源基因。(2)安全性高。由于桿狀病毒的天然宿主昆蟲是節(jié)肢動物，與人及其他哺乳動物的親緣關(guān)系較遠，即使它進入哺乳動物細胞，其基因組也不能在細胞中復(fù)制。(3)表達蛋白質(zhì)效率高。桿狀病毒表達載體可同時攜帶多個啟動子，這些啟動子能各自驅(qū)動下游基因的高水平表達。(4)翻譯后修飾能力與哺乳動物細胞相似。因此，桿狀病毒在基因治療中具有廣闊的應(yīng)用前景，開辟了桿狀病毒應(yīng)用的新領(lǐng)域。目前桿狀病毒可用于治療多種疾病，包括癌癥、感染性疾病、遺傳性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病等，其中癌癥治療是該技術(shù)的主要研究和應(yīng)用領(lǐng)域[39]。

4 小結(jié)

隨著生態(tài)環(huán)保概念深入人心，昆蟲桿狀病毒將具有更大的發(fā)展前景，不僅為農(nóng)林生產(chǎn)提供新的生物農(nóng)藥，而且為研究宿主功能基因提供重要的基因工程載體[40]。桿狀病毒作為殺蟲劑，殺蟲速度慢和宿主域窄是其缺點，同時也是其優(yōu)點。殺蟲速度慢是因為病毒是一種簡單生命，要在蟲體內(nèi)完成其復(fù)制周期，害蟲難以對其產(chǎn)生抗性；正是因為宿主域窄，所以它們對非靶標(biāo)生物是安全的。在應(yīng)用基礎(chǔ)研究上，可以針對具體情況構(gòu)建重組型病毒或者添加殺蟲增效劑[41]。作為表達系統(tǒng)，其外源蛋白表達量低和蛋白質(zhì)表達后修飾存在差異，也可以通過優(yōu)化表達系統(tǒng)進行完善。越來越多桿狀病毒基因組測序和功能基因研究的完成，為病毒殺蟲劑的開發(fā)提供了理論支持，也為深入了解桿狀病毒的侵染機制、分子進化和病毒與宿主的特異性互作關(guān)系提供重要的理論依據(jù)。