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      硝酸鑭示蹤大鼠腸上皮細(xì)胞糖萼的透射電鏡觀察

      2018-09-27 08:19:42劉文波高貝貝楊春燕張瑾錦
      關(guān)鍵詞:微絨毛透射電鏡粘膜

      劉文波,高貝貝,楊春燕,張瑾錦

      (濱州醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心,煙臺(tái) 264003)

      腸道是機(jī)體消化系統(tǒng)主要組成部分,具有免疫調(diào)節(jié)、黏膜屏障等功能,腸粘膜屏障在維護(hù)腸道功能中發(fā)揮重要作用。腸上皮細(xì)胞糖萼是覆蓋于上皮細(xì)胞表面的一層富含多糖的結(jié)構(gòu),也是腸粘膜屏障的組成部分,其在腸粘膜損傷中會(huì)發(fā)生改變。1966年Luft等[1]首次利用透射電子顯微鏡觀察到糖萼的存在。以往研究多見于血管內(nèi)皮糖萼,迄今為止,利用特殊方法顯示腸粘膜糖萼的報(bào)道尚不多見。本實(shí)驗(yàn)擬以大鼠為研究對(duì)象,以脂多糖(LPS)制造腸粘膜損傷模型[2],利用硝酸鑭作為腸上皮細(xì)胞糖萼示蹤劑,取小腸組織制備超薄切片,利用透射電子顯微鏡觀察腸上皮糖萼,以探討硝酸鑭作為示蹤劑顯示腸上皮細(xì)胞表面糖萼的效果。

      材料和方法

      1 主要試劑和儀器

      脂多糖(LPS,美國Sigma公司),二甲胂酸鈉(山東西亞化工有限公司,進(jìn)口分裝,批號(hào):N6347),硝酸鑭(天津福晨化學(xué)試劑廠,批號(hào):20080317),戊二醛(美國Alfa Aesar公司),鋨酸(美國Ted Pella公司),Epon812環(huán)氧樹脂(美國SPI公司 )。

      透射電子顯微鏡(日本JEOL公司,JEM-1400型,配美國Gatan公司792型CCD),超薄切片機(jī)(德國Leica公司,UC7型)。

      2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

      雄性SD大鼠(體質(zhì)量220±20g)6只,購自山東省濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證 No∶0024545,許可證號(hào):SCXK(魯)20140007,隨機(jī)分成2組,每組3只,分別為對(duì)照組( A組)和模型組( B組);各組動(dòng)物在相同條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)7d,自由飲食、飲水。造模前1d禁食不禁水,造模當(dāng)天行腹腔注射,A組腹腔注射生理鹽水,B組腹腔注射LPS 0.5mg/kg(生理鹽水配制),注射6h后各組動(dòng)物進(jìn)行取材。

      3 動(dòng)物處理及取材

      各組動(dòng)物經(jīng)4%水合氯醛麻醉后,打開腹腔,取空腸組織3塊,標(biāo)本經(jīng)生理鹽水漂洗后置于含2.5%戊二醛、2%硝酸鑭的0.1mol/L二甲胂酸鈉溶液(pH 7.4)中,標(biāo)本均于4℃低溫下固定24h。

      4 透射電鏡樣品制備

      將經(jīng)過固定的標(biāo)本用0.1mol/L二甲胂酸鈉緩沖液漂洗,再經(jīng)1%鋨酸(由二甲砷酸緩沖液配制,4℃條件下)后固定1.5h,緩沖液漂洗后經(jīng)梯度乙醇脫水至無水,再經(jīng)丙酮置換,Epon812浸透、包埋,升溫聚合后進(jìn)行半薄切片定位到腸粘膜游離面縱切方向,切70nm厚度超薄切片撈于200目銅網(wǎng)上,兩組切片不經(jīng)染色直接在透射電鏡下觀察、拍照。

      結(jié) 果

      糖萼廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜的表面,尤以上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞糖萼更為豐富。上皮細(xì)胞表面的糖萼富含多糖,常與細(xì)胞膜上脂類和蛋白質(zhì)結(jié)合形成糖脂和糖蛋白。糖萼帶有負(fù)電荷,三價(jià)陽離子鑭與之結(jié)合后在透射電鏡下原位顯示為覆蓋于細(xì)胞表面的高電子密度致密物。正常腸粘膜表面富含糖萼,硝酸鑭與其結(jié)合使其保存下來,在后期制樣中也不容易流失,透射電鏡下可見到小腸黏膜上皮細(xì)胞微絨毛頂端及側(cè)面均有鑭鹽附著,多呈高電子密度的團(tuán)簇狀,微絨毛頂端更為豐富(圖1A),腸粘膜損傷后糖萼明顯減少乃至消失,故高密度的鑭鹽數(shù)量和分布均明顯減少(圖1B)。

      圖1 大鼠小腸上皮細(xì)胞微絨毛糖萼透射電鏡觀察(超薄切片未經(jīng)染色)。A,對(duì)照組,糖萼經(jīng)硝酸鑭染色,呈高電子密度團(tuán)簇狀(箭頭)附著于微絨毛(MV)表面及側(cè)面;B,模型組,微絨毛表面及側(cè)面的糖萼數(shù)量明顯減少;比例尺,0.5μmFig. 1 Transmission electron microscopic observation of glycalyx on the microvilli of rat intestinal epithelial cells ( not stained by uranium acetate and lead citrate). A, control group, glycalyx stained with lanthanum nitrate, a large number of clusters of lanthanum salt (arrow) were deposited on the surface and side of microvilli; B, model group, the deposition of lanthanum salt on the surface and side of microvilli obviously decreased. MV, microvilli;scale bar, 0.5μm

      討 論

      腸上皮細(xì)胞糖萼是上皮細(xì)胞產(chǎn)生的糖蛋白,其糖鏈含半乳糖、葡萄糖、巖藻糖、甘露糖和唾液酸等糖基。帶正電荷的硝酸鑭可與帶負(fù)電荷的糖基結(jié)合,在透射電鏡下呈現(xiàn)高電子密度,從而原位顯示出糖萼的位置和數(shù)量。上皮細(xì)胞糖萼對(duì)上皮細(xì)胞有保護(hù)作用,在細(xì)胞識(shí)別中起重要作用,細(xì)胞表面的糖鏈能吸收胰蛋白酶和胰淀粉酶等消化酶,微絨毛表面有雙糖酶和多肽酶,故腸上皮細(xì)胞的微絨毛與表面的糖萼是消化的關(guān)鍵場(chǎng)所,又是物質(zhì)吸收的門戶。

      在常規(guī)透射電鏡制樣中標(biāo)本需經(jīng)過多次緩沖液漂洗和乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑脫水,造成糖萼在制樣中不斷流失,最終在透射電鏡下很難直接觀察到糖萼的存在,故鮮有采用常規(guī)透射電鏡方法研究細(xì)胞表面糖萼的報(bào)道。1966年Luft等[1]應(yīng)用釕紅染色首次在電子顯微鏡下觀察到內(nèi)皮細(xì)胞表面約20nm厚呈毛絨狀的糖萼的存在。Haldenby等[3]以阿利新藍(lán)(alcian blue)代替釕紅觀察到了兔動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞表面厚度約45-80nm的糖萼。吳雙等[4]利用阿利新藍(lán)和硝酸鑭染色觀察了小鼠空腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞表面糖萼的形態(tài)及厚度,劉增波等[5]利用硝酸鑭示蹤顯示腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞糖萼的結(jié)構(gòu),也獲得良好的效果。Hegermann J 等[6]利用膠體態(tài)的氧化釷作示蹤劑觀察了大鼠腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞表面糖萼,觀察到的厚度50~300nm。由于各種糖萼染料的性質(zhì)差異及樣品固定方法的不同,導(dǎo)致細(xì)胞表面糖萼形態(tài)和厚度的觀察結(jié)果有很大差異[7]。冷凍蝕刻透射電鏡技術(shù)是觀察細(xì)胞表面糖萼的有效技術(shù),Ghadially 等[8]應(yīng)用冷凍蝕刻復(fù)型技術(shù)原位觀察到腸上皮細(xì)胞微絨毛表面保存完好地糖萼結(jié)構(gòu)。Ebong等[9]通過高壓冷凍-冷凍替代的方法也較好地保存了糖萼結(jié)構(gòu),測(cè)得其厚度達(dá)1μm以上,但受到儀器設(shè)備制約,這兩種技術(shù)應(yīng)用受到很大限制。

      本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用硝酸鑭示蹤來顯示小腸上皮細(xì)胞微絨毛表面的糖萼,超薄切片不需染色即可直接觀察,由于沒有鉛、鈾等染料的干擾,實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀且明確。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示正常大鼠小腸上皮細(xì)胞微絨毛表面有大量糖萼存在,微絨毛頂端和側(cè)面均有,在微絨毛頂端糖萼最為豐富;而受損傷的模型組的小腸上皮細(xì)胞微絨毛表面糖萼明顯減少,很多部位甚至消失,與預(yù)期結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明應(yīng)用硝酸鑭示蹤腸上皮細(xì)胞糖萼是一種簡(jiǎn)單有效的方法,可以應(yīng)用于各種腸粘膜損傷導(dǎo)致的糖萼數(shù)量改變的研究中。

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