低濃度乙醇激活乙醛脫氫酶2抑制糖尿病大鼠心肌中自噬相關(guān)蛋白的上調(diào)

陶敏，康品方，郭建路，孫碩，許洪銘，高琴，唐碧，張恒*

（1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管科，蚌埠，233004；2蚌埠醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，蚌埠，233030；3蚌埠醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，蚌埠，233030）

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是一種獨(dú)立的糖尿病并發(fā)癥，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可能涉及代謝紊亂、心肌纖維化、氧化應(yīng)激、線粒體障礙、微循環(huán)病變、胰島素抵抗等多種因素。主要臨床表現(xiàn)為心臟舒縮功能障礙，可誘發(fā)心力衰竭、心律失常、心源性休克及猝死等。如何預(yù)防DCM的心血管并發(fā)癥，降低DCM的致死風(fēng)險(xiǎn)成為了臨床醫(yī)生和科研工作者關(guān)注的重點(diǎn)。

線粒體乙醛脫氫酶2（aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2）是一種在心臟中高度表達(dá)的線粒體酶，已經(jīng)成為心臟保護(hù)中的關(guān)鍵酶，因?yàn)樗粌H在乙醇脫氫酶產(chǎn)生的乙醛的解毒中起主要作用，而且還可以代謝氧化應(yīng)激過(guò)程中產(chǎn)生的其他醛類(lèi)，如脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物等[1]。我們前期研究觀察到，長(zhǎng)期低濃度乙醇可激活A(yù)LDH2發(fā)揮心肌保護(hù)作用[2]，ALDH2的表達(dá)減弱可降低心肌抗氧化能力加重糖尿病心肌損傷[3]，但其具體的機(jī)制仍有待于進(jìn)一步探討。

越來(lái)越多的研究表明，自噬參與并影響著各種心血管應(yīng)激和心臟疾病的發(fā)生發(fā)展[4]。自噬是細(xì)胞消化降解溶酶體中的受損蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的過(guò)程，是維持細(xì)胞基礎(chǔ)代謝必不可少的生理過(guò)程。而自噬在糖尿病心肌損傷中的作用是具有高度爭(zhēng)議的，一些研究表明自噬在糖尿病心肌損傷中是減少的，另一部分研究則是相反的[5]。Beclin-1是哺乳動(dòng)物參與自噬的特異性基因，可用來(lái)檢測(cè)自噬發(fā)生的程度。心肌細(xì)胞中的自噬水平受到缺血再灌注損傷的影響，而上調(diào)beclin-1的表達(dá)水平可增強(qiáng)自噬，起到細(xì)胞保護(hù)作用，beclin-1表達(dá)的變化可反映細(xì)胞代謝的情況[6]。

研究可觀察到，ALDH2的表達(dá)降低可以改變細(xì)胞內(nèi)Ca2+的穩(wěn)態(tài)、上調(diào)自噬及損害線粒體功能，從而加重酒精引起的心肌損傷[7]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討高糖狀態(tài)下ALDH2對(duì)心肌細(xì)胞自噬水平的影響，及beclin-1介導(dǎo)的自噬水平的改變?cè)贏LDH2保護(hù)心肌損傷中的作用，進(jìn)一步分析其可能機(jī)制。

材料和方法

1 復(fù)制糖尿病心肌損傷模型

雄性SD大鼠20只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分成正常組（CON，n=6）和實(shí)驗(yàn)組（n=18）。實(shí)驗(yàn)組禁食12h后單次腹腔注射鏈脲佐菌素（60mg/kg），72h后尾靜脈采血測(cè)大鼠空腹血糖，以≥16.7mmol/L并持續(xù)1周為模型復(fù)制成功。將成功模型分成糖尿病組（DM）和酒精干預(yù)組（DM+EtOH）。CON組和DM組給予常規(guī)飲食飲水，DM+EtOH組在造模成功的基礎(chǔ)上先給予2.5%乙醇日常飲用1周，后改為5%乙醇繼續(xù)喂養(yǎng)至10周。

2 大鼠心體比

測(cè)禁食12h后的大鼠體重（g），實(shí)驗(yàn)結(jié)束后稱取大鼠心臟重量（mg），心臟重量與大鼠體重的比即為心體比。

3 大鼠心肌組織SOD活性、MDA含量變化

在冰上將稱取的0.1g心肌組織制成10%組織勻漿，3000r/min離心15min后取上清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)以酶標(biāo)儀分別測(cè)定心肌組織SOD活性及MDA含量。

4 免疫組織化學(xué)染色

將正常大鼠心臟及糖尿病大鼠心臟組織標(biāo)本經(jīng)過(guò)固定包埋、切片、抗原修復(fù)，加入顯色劑等一系列處理后晾干。在顯微鏡下觀察，選擇實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的陽(yáng)性和陰性組織顯微照相并進(jìn)行圖像分析。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)即IHS=A×B（A表示陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分級(jí)，B表示陽(yáng)性細(xì)胞顯色強(qiáng)度分級(jí)）。

5 Masson染色

石蠟切片脫蠟復(fù)水，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行染色，沖洗，待晾干后封片，顯微鏡下觀察讀片。

6 Western blot檢測(cè)

取0.1g心肌組織進(jìn)行裂解獲取組織勻漿，4℃離心（12000r/min，15min），取上清，蛋白定量后，經(jīng)15% SDS-PAGE分離，隨后，電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，先后加入抗beclin-1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 B亞基（B subunit of microtubule-associated protein1 light chain 3, LC3B）、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因/腺病毒E1B19KD相互作用蛋白3（Bcl-2/ adenovirus E1B19KD interacting protein 3，BNIP3）或β-actin一抗，4℃過(guò)夜。次日洗滌并加入HRP標(biāo)記的二抗孵育，ECL試劑盒進(jìn)行曝光成像。凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行條帶的光密度測(cè)量，計(jì)算目的蛋白與β-actin蛋白表達(dá)的相對(duì)量。

結(jié) 果

1 乙醇干預(yù)抑制糖尿病大鼠的心重與體重的降低

與CON組相比，DM組、DM+EtOH組大鼠心重（heart weight, HW）、體重（body weight, BW）明顯減輕，而心體比（H/B）顯著增加；對(duì)糖尿病大鼠進(jìn)行乙醇干預(yù)后，心重和體重的降低與心體比的增加被明顯抑制（表1）。

2 乙醇干預(yù)減輕糖尿病大鼠心肌組織SOD活性降低和MDA含量增加

與CON組相比，DM組SOD活性明顯降低，MDA含量明顯增高，提示心肌氧化應(yīng)激損傷加重；與DM組相比，DM+EtOH組的SOD活性降低和MDA含量增加顯著減輕，提示氧化應(yīng)激損傷減輕（圖1）。

表1 大鼠心重、體重和心體比比較Tab. 1 Comparison of heart weight, body weight, and heart-to-body weight ratio of the rats

圖1大鼠心肌組織SOD活性和MDA含量變化檢測(cè). A，SOD的活性；B，MDA的含量；與正常組比較：**P＜0.01；與糖尿病組比較：##P＜0.01；n=6Fig. 1 Analysis of SOD activity and MDA content in the rat myocardial tissues. A, SOD activity; B, MDA content. Compared with CON group,**P＜0.01; compared with DM group ,##P＜0.01; n=6

3 乙醇干預(yù)抑制糖尿病大鼠心肌組織中beclin-1、LC3B和BNIP3免疫反應(yīng)性的增強(qiáng)

與CON組相比，DM組大鼠心肌組織中beclin-1、LC3B和BNIP3免疫反應(yīng)性明顯增加，乙醇干預(yù)顯著抑制糖尿病大鼠心肌組織中beclin-1、LC3B和BNIP3免疫反應(yīng)性明顯的增加（圖2）。

4 乙醇干預(yù)減輕糖尿病大鼠心肌組織纖維化

Masson染色顯示，心肌細(xì)胞呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)綠色。CON組心肌排列整齊且分布均勻，膠原纖維散在分布或呈條索狀；DM組膠原纖維粗大，交織成網(wǎng)狀或堆積成片狀，排列分布不均勻，沉積增多，提示心肌纖維化程度增加；DM+EtOH組膠原纖維較前有所改善，沉積減少，提示心肌纖維化程度有所減輕（圖3）。

5 乙醇干預(yù)抑制糖尿病大鼠心肌組織中ALDH2的減少和beclin-1、LC3B與BNIP3水平的增加

Western blot檢測(cè)顯示，與CON組相比，DM組ALDH2水平明顯減少，而beclin-1、LC3B和BNIP3明顯增加，乙醇干預(yù)的糖尿病大鼠（DM+EtOH組）中，ALDH2水平的減少和beclin-1、LC3B與BNIP3水平的增加明顯少于單純糖尿病大鼠（圖4）。

討 論

圖2大鼠心肌組織中beclin-1、LC3B和BNIP3水平的免疫組織化學(xué)檢測(cè)。A，代表性免疫組織化學(xué)染色（比例尺，100μm）；B，免疫反應(yīng)性變化的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（與正常組比較：**P＜0.01；與糖尿病組比較：##P＜0.01；n=6）Fig. 2 Immunohistochemical examination of beclin-1, LC3B and BNIP3 levels in rat myocardial tissues. A, representative immunohistochemical staining (scale bar, 100μm); B, statistical analysis of the immunoreactivities; compared with CON group(**P＜0.01; compared with DM group, ##P＜0.01;n=6)

圖3 大鼠心肌組織膠原纖維變化的Masson染色檢測(cè)。比例尺，100μmFig. 3 Masson staining of collagenous fi bers in the rat myocardial tissue. Scale bar, 100μm

圖4大鼠心肌組織中ALDH2、beclin-1、LC3B和BNIP3水平的Western blot 檢測(cè)。A，代表性Western blot；B，Western blot 的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（與正常組比較：**P＜0.01；與糖尿病組比較：##P＜0.01；n=6）Fig. 4 Western blot detected the expression of ALDH2, beclin-1, LC3B and BNIP3 in myocardial tissue of rats. A, representative Western blot; B,statistical analysis of Western blot results; compared with CON group, **P＜0.01; compared with DM group ,##P＜0.01; n=6

糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy, DCM）是一種獨(dú)立的疾病，心肌肥厚和心肌纖維化是其主要的病理表現(xiàn)。長(zhǎng)期高糖狀態(tài)可導(dǎo)致心肌細(xì)胞代謝異常，心肌纖維化加重及心臟收縮舒張功能障礙。ALDH2作為一種代謝乙醛和毒性醛的酶，與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如冠狀動(dòng)脈疾病、缺血再灌注損傷、糖尿病性心肌病和心功能不全[8,9]。當(dāng)長(zhǎng)期處于高血糖狀態(tài)時(shí)，ALDH2的活性下降，糖尿病心臟中4-HNE化合物的形成增加[10]。

糖尿病心肌損傷過(guò)程中伴隨著氧化應(yīng)激的發(fā)生，氧化應(yīng)激狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體等細(xì)胞器損傷、脂質(zhì)過(guò)氧化，細(xì)胞內(nèi)自噬水平過(guò)度增加[11]，引起線粒體水腫、線粒體嵴斷裂等損傷，細(xì)胞內(nèi)能量供應(yīng)不足，進(jìn)一步加重細(xì)胞損傷[12]。細(xì)胞中的能量主要來(lái)源于線粒體，當(dāng)線粒體受到損傷，能量供應(yīng)發(fā)生障礙時(shí)，一定程度上的自噬激活有助于維持細(xì)胞的正?；顒?dòng)。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)自噬激活與ROS等氧化產(chǎn)物的增加密切相關(guān)[13]。在糖尿病心肌病時(shí)氧化應(yīng)激會(huì)更加顯著[14]。本實(shí)驗(yàn)中，DM組H/B、MDA含量增加明顯，SOD活性下降，心肌纖維化程度加重，而當(dāng)給予ALDH2激動(dòng)劑乙醇干預(yù)后，大鼠H/B、MDA含量、心肌纖維化程度均降低，SOD活性下降明顯減輕，提示糖尿病心肌損傷時(shí)心肌氧化應(yīng)激增加，心肌纖維化加重，激活A(yù)LDH2表達(dá)后氧化應(yīng)激和心肌纖維化程度均降低。

自噬與糖尿病心肌病的關(guān)系近年來(lái)受到越來(lái)越多的關(guān)注。研究表明，自噬不僅發(fā)生在基礎(chǔ)條件下健康的心臟中，也發(fā)生于病理?xiàng)l件下，包括心力衰竭、心臟肥大、缺血性心肌病、急性心肌梗死、心室重構(gòu)等疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，這表明自噬在維持心臟功能的過(guò)程中起著重要作用[15,16]。大量研究證實(shí)在心室重塑早期，自噬對(duì)心肌細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用[17]。Beclin-1在調(diào)節(jié)自噬和自噬與凋亡的各個(gè)步驟的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18]。研究發(fā)現(xiàn)，在OVE26誘導(dǎo)的1型糖尿病心肌病小鼠中，beclin或者自噬相關(guān)基因At96過(guò)表達(dá)時(shí)，自噬上調(diào)，伴有心功能的更大損傷。當(dāng)beclin-1或At96缺失時(shí)，自噬減少，心功能改善。同時(shí)有研究證實(shí)激活A(yù)MPK和增強(qiáng)beclin-1的表達(dá)在心肌細(xì)胞缺血缺氧時(shí)可誘導(dǎo)自噬增強(qiáng)起到心肌保護(hù)作用[19,20]。研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病可通過(guò)beclin-1的激活增加心臟心肌細(xì)胞自噬[21]。有趣的是，在我們的實(shí)驗(yàn)中觀察到，DM組大鼠心肌組織中ALDH2表達(dá)減少，自噬標(biāo)志物beclin-1、LC3B、BNIP3表達(dá)增加，而乙醇干預(yù)可顯著抑制這些變化，提示糖尿病心肌損傷過(guò)程中有自噬的激活現(xiàn)象發(fā)生，且這一現(xiàn)象的發(fā)生與beclin-1蛋白表達(dá)的增強(qiáng)密切相關(guān)。

綜上所述，ALDH2可通過(guò)減輕心肌氧化應(yīng)激、抑制心肌纖維化、減少自噬發(fā)揮糖尿病心肌損傷保護(hù)作用，這一現(xiàn)象可能與ALDH2抑制beclin-1表達(dá)有關(guān)。自噬在糖尿病心肌損傷中發(fā)揮作用的機(jī)制比較復(fù)雜，具體機(jī)制有待于更進(jìn)一步明確，從而為臨床治療糖尿病心肌損傷提供新的治療思路。