慢性哮喘小鼠肺組織中組蛋白去乙酰化酶8表達和活性增加

任媛，蘇新明，陸常玲，李朋，李孟露，康健

(中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院呼吸疾病研究所，沈陽，110001)

支氣管哮喘是由多種細胞和細胞組分參與的氣道異質性疾病，在其整個疾病進程中大量基因被異常激活，基因表達水平顯著高于正常人群[1]。組蛋白的共價修飾與基因表達調(diào)控密切相關，其中由組蛋白乙?；D移酶（histone acetylases, HATs）和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylases, HDACs）調(diào)控的乙?；揎椩诨蜣D錄激活過程中至關重要[2]。哮喘致病時患者體內(nèi)HDACs活性降低，HATs活性升高，且HDACs抑制劑干預能夠有效緩解哮喘相關氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應[3-7]。但HDACs家族成員眾多，迄今為止哮喘致病時各成員在肺組織中的表達形態(tài)改變?nèi)圆磺宄?。我們的團隊在應用不同亞型HDACs抑制劑（廣譜HDACs抑制劑、HDAC6特異性抑制劑、HDAC8特異性抑制劑）干預哮喘小鼠時發(fā)現(xiàn)：盡管不同亞型的HDACs抑制劑均能夠有效緩解哮喘小鼠氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應，但HDAC8特異性抑制劑的抗炎效果要優(yōu)于其他HDACs抑制劑[8]。同時，許多學者認為HDAC8在T細胞增殖分化凋亡以及平滑肌細胞分化、收縮等病理生理中均發(fā)揮了重要作用[9-11]。因此，本次研究的目的主要是明確哮喘致病時HDAC8在肺組織中的表達定位和表達水平，探討HDAC8與哮喘發(fā)病的關系。

材料和方法

1 小鼠哮喘模型制備及分組

6～8周SPF級雌性BALB/C小鼠購自遼寧長生生物技術有限公司[動物許可證號：SCXK(遼)2010-0001]。隨機數(shù)字表法分為正常組和哮喘組，12只/組。于實驗第0、7、14d，哮喘組小鼠予以卵蛋白OVA（20μg）和氫氧化鋁凝膠（2mg）混懸液腹腔注射致敏。末次致敏1周后，應用超聲霧化裝置（3ml/min）進行OVA（20mg/ml）霧化激發(fā)8周，3次/周，30min/次。正常組均以等量生理鹽水代替OVA處理。

2 HE染色評估哮喘建模

末次激發(fā)實驗24h后，各組小鼠麻醉處死，取左側肺組織，固定，包埋，切片（5μm）后行HE染色。石蠟切片脫蠟水化，蘇木素染5～10min，自來水沖洗5min，鹽酸酒精分化3s，自來水洗返藍30min，伊紅復染1～2min，自來水洗去浮色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察哮喘組小鼠氣道肺組織炎癥浸潤水平。

3 免疫組織化學染色觀察HDAC8在肺組織中的表達分布

行肺組織HDAC8免疫組織化學染色。石蠟切片脫蠟水化，3% H2O2室溫孵育5min，PBS 洗3次，5min/次；微波爐抗原修復24min，6min/次，PBS 洗3次，5min/次；10% BSA室溫孵育30min，HDAC8多克隆抗體（1∶500，美國，Novus）4℃孵育過夜。辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（1：500；北京中杉金橋生物技術有限公司37 ℃ 孵育60min，PBS 洗3次，5min/次；DAB法顯色5～10min，自來水充分沖洗，蘇木素復染，脫水，透明，封片。光鏡下觀察HDAC8在各組小鼠肺組織中的表達分布。

4 Western Blot檢測肺組織中HDAC8水平

取右側新鮮肺組織30～50mg加入RIPA裂解液(含10%PMSF)，冰上剪碎勻漿，超聲粉碎，4℃12000g離心，30min后取上清。BCA法測蛋白濃度，調(diào)整濃度并變性后，采用SDS聚丙烯酞胺凝膠電泳（80V，30min；120V，90min）分離。將蛋白轉染到PVDF膜上（0.25mA，60min），脫脂奶粉封閉液中室溫封閉2h。HDAC8多克隆抗體（1∶1000，美國，Novus）4℃孵育過夜。辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司）室溫孵育1h，ECL法檢測蛋白表達，凝膠成像系統(tǒng)成像（美國UVP公司），Gel-Pro analyzer凝膠定量分析軟件進行結果分析。

5 HDAC8酶活性熒光定量分析

取右側新鮮肺組織，采用細胞核蛋白抽提試劑盒提取核蛋白，BCA法測定蛋白濃度，熒光法[12]檢測肺組織中HDAC8酶活性，操作方法按試劑盒（HDAC8 Activity Fluorometric Assay Kit，美國，BioVision）內(nèi)附說明書操作，其基本步驟如下： HA1溶用液蒸餾水稀釋10倍， 核蛋白用HA2溶液稀釋至1μg/μl，按照樣品孔、空白孔、標準品孔加樣，37℃ 孵育 60～90min，每孔再加入 150μl HA3 溶液，37℃孵育30～45min，150μl HA1溶液洗板3次，用HA1溶液將HA4稀釋200倍后，取50μl加入至各反應孔中，搖床上室溫孵育60min，150μl HA1溶液洗板4次，用HA1溶液將HA5稀釋1000倍后，取50μl加入至各反應孔中，室溫孵育60min，150μl HA1溶液洗板4次，每孔加入100μl HA6溶液，避光室溫孵育10min，每孔加入50μl HA7溶液，立即測定OD450nm，計算HDAC8酶活性。

6 統(tǒng)計學分析

結 果

1 哮喘小鼠肺組織炎癥浸潤水平

HE染色觀察顯示，正常小鼠肺組織中氣道上皮細胞排列整齊，基底膜連續(xù)完整，肺組織炎癥細胞浸潤幾不可見；與正常小鼠相比，哮喘小鼠肺組織氣道上皮細胞脫落，基底膜暴露，氣道及血管周圍可見大量以嗜酸性粒細胞為主的炎癥細胞浸潤（圖1），表明哮喘建模成功。

圖1肺組織HE染色。A，正常小鼠肺組織；A’，A中方框內(nèi)放大圖像；B，哮喘組小鼠肺組織；B’，B中方框內(nèi)放大；箭頭，炎癥細胞；比例尺，50μmFig. 1 HE stain of lung tissue. A, lung tissue of the normal mouse; A’, enlarged image of the square frame in A; B, lung tissue of the asthma mouse; B’,enlarged image of the square frame in B; arrows indicate inflammatory cells; scale bar, 50μm

2 HDAC8在肺組織中的免疫組織化學表達

2.1 哮喘小鼠氣道上皮細胞高表達HDAC8

正常小鼠氣道上皮細胞質中可見少量的HDAC8表達。與正常小鼠相比，哮喘小鼠氣道上皮細胞中HDAC8棕黃色染色明顯，免疫反應性明顯增強（圖2）。

圖2 HDAC8在各組小鼠氣道上皮細胞中的免疫組織化學表達。A，正常小鼠肺組織；A’，A中方框內(nèi)放大圖像；B，哮喘組小鼠肺組織；B’，B中方框內(nèi)放大；箭頭，HDAC8陽性染色細胞；比例尺，50μmFig. 2 Immunohistochemical expression of HDAC8 in the airway epithelial cells. A, lung tissue of the normal mouse; A’, enlarged image of the square frame in A; B, lung tissue of the asthma mouse; B’, enlarged image of the square frame in B; arrows indicate cells with HDAC8 positive expression;scale bar, 50μm

2.2 哮喘小鼠氣道血管周圍炎癥細胞高表達HDAC8

免疫組織化學染色顯示，正常小鼠肺組織氣道血管結構清晰，周圍并未發(fā)現(xiàn)炎癥細胞浸潤；與正常小鼠相比，哮喘小鼠氣道血管周圍可見大量炎癥細胞浸潤，且浸潤的炎癥細胞中可見HDAC8顯著表達，但HDAC8在炎癥細胞中表達水平并不均勻（圖3）。

圖3 HDAC8在各組小鼠氣道血管周圍炎癥細胞中的免疫組織化學表達。A，正常小鼠肺組織；A’，A中方框內(nèi)放大圖像；B，哮喘組小鼠肺組織；B’，B中方框內(nèi)放大；箭頭，HDAC8陽性染色細胞；比例尺，50μmFig. 3 Immunohistochemical expression of HDAC8 in the inflammatory cells around the vascular and airway. A, lung tissue of the normal mouse; A’,enlarged image of the square frame in A; B, lung tissue of the asthma mouse; B’, enlarged image of the square frame in B; arrows indicate cells with HDAC8 positive expression; scale bar, 50μm

2.3 哮喘小鼠血管平滑肌細胞高表達HDAC8

正常小鼠肺動脈和微血管平滑肌中未見HDAC8表達；OVA霧化8周后，可見哮喘小鼠肺動脈平滑肌細胞以及微血管平滑肌中HDAC8表達呈強陽性，尤其在肺微血管平滑肌中可見HDAC8表達水平明顯升高（圖4）。

2.4 哮喘小鼠肺泡腔炎癥細胞高表達HDAC8

正常小鼠肺泡腔中僅見少量炎癥細胞，且炎癥細胞中HDAC8表達極少。與正常小鼠相比，哮喘小鼠肺泡腔中可見大量以巨噬細胞和嗜酸性粒細胞為主的炎癥細胞，且在這些炎癥細胞中HDAC8表達水平顯著增多（圖5）。

3 哮喘小鼠肺組織HDAC8水平升高

Western blot進一步檢測HDAC8在肺組織中的總體水平，發(fā)現(xiàn)與正常小鼠相比，哮喘小鼠肺組織中HDAC8的總體水平顯著升高（圖6A、B）。

4 哮喘小鼠肺組織中HDAC8活性增強

熒光定量分析檢測HDAC8活性發(fā)現(xiàn)，在正常肺組織HDACs活性較低，哮喘小鼠肺組織中HDAC8活性較正常小鼠顯著升高（圖6C）。

討 論

目前哺乳類HDACs已知有4類18種，不同類別的HDACs通過調(diào)節(jié)不同底物的乙?；揎梾⑴c體內(nèi)多種應激性反應[13]。其中HDAC8是I類HDACs家族的重要成員，在全身多臟器中均有表達，與體內(nèi)T細胞增殖分化、炎性免疫應答、以及平滑肌細胞分化收縮等過程均密切相關[14-16]。本次研究結果顯示，HDAC8在健康小鼠肺組織中表達極少，而在以嗜酸性炎癥為主的慢性哮喘小鼠肺組織中表達水平和酶活性均顯著上調(diào)。免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)HDAC8高表達于氣道上皮細胞、氣道血管周圍以及肺泡腔炎癥細胞和血管平滑肌細胞，尤其在新生血管的平滑肌細胞中可見HDAC8規(guī)律且特異性表達。然而有意思的是在支氣管氣道平滑肌細胞中HDAC8表達卻并不明顯。本團隊既往的研究發(fā)現(xiàn)，哮喘致病過程中血管平滑肌細胞的表型、結構和功能均發(fā)生病理性改變，且直接參與哮喘時血管的損傷修復以及再生和重塑過程[17-19]。綜合HDAC8在哮喘肺組織血管中的表達特點以及哮喘致病時血管表型和功能的異常改變，我們推測HDAC8很可能參與哮喘致病時血管的再生與重塑。

圖4 HDAC8在小鼠血管平滑肌細胞中的免疫組織化學表達。A，正常小鼠肺內(nèi)動脈；A’，A中方框內(nèi)放大圖像；B，正常小鼠肺內(nèi)微血管；B’，B中方框內(nèi)放大圖像；C，哮喘組小鼠肺內(nèi)動脈；C’，C中方框內(nèi)放大；D，哮喘組小鼠肺內(nèi)微血管；D’，D中方框內(nèi)放大；箭頭，HDAC8陽性染色細胞；比例尺，50μmFig. 4 Immunohistochemical expression of HDAC8 in the vascular smooth muscle cells. A, pulmonary artery of the normal mouse; A’, enlarged image of the square frame in A; B, pulmonary capillaries of the normal mouse; B’, enlarged image of the square frame in B; C, pulmonary artery of the asthma mouse; C’, enlarged image of the square frame in C; D, pulmonary capillaries of the asthma mouse; D’, enlarged image of the square frame in D; arrows indicate cells with HDAC8 positive expression; scale bar, 50μm

盡管哮喘和COPD都屬于呼吸系統(tǒng)氣道炎癥性疾病，但研究發(fā)現(xiàn)在COPD患者體內(nèi)HDAC8表達水平顯著低于健康人，而我們的研究結果卻提示哮喘小鼠體內(nèi)HDAC8表達水平顯著升高。HDAC8這一截然相反的變化趨勢很可能是由于哮喘和COPD兩者在炎癥細胞表型和分子特征上皆不同所致[20]，即COPD則主要是由中性粒細胞介導的炎癥反應，而我們的哮喘模型主要表現(xiàn)為嗜酸性粒細胞性炎癥，而哮喘中HDAC8的升高很可能與哮喘中嗜酸粒細胞炎癥反應相關。從免疫組織化學染色結果也可看出，在哮喘肺組織氣道血管周圍以及肺泡腔炎癥細胞中HDAC8表達并不均勻，嗜酸性粒細胞和巨噬細胞中HDAC8的表達水平明顯高于其他炎癥細胞。

目前針對HDAC8的選擇性抑制劑的研究越來越受到人們的重視，其中PCI-34051是一個低分子量的異羥肟酸類化合物，是HDAC8的特異性抑制劑，應用PCI-34051干預哮喘小鼠能夠顯著緩解哮喘氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應[21]。盡管PCI-34051作用于哮喘的具體機制尚不明確，但有研究顯示HDAC8能夠調(diào)控組蛋白上H3K9、H2BK12、H3K18的乙?；?，影響下游基因轉錄激活[22]，這一結果很有可能為HDAC8作用于哮喘的具體機制研究帶來新突破。

圖5 HDAC8在各組小鼠肺泡腔炎癥細胞的免疫組織化學表達。A，正常小鼠肺組織；A’，A中方框內(nèi)放大圖像；B，哮喘組小鼠肺組織；B’，B中方框內(nèi)放大；箭頭，HDAC8陽性染色細胞；比例尺，50μmFig. 5 Immunohistochemical expression of HDAC8 in the alveolar inflammatory cells. A, lung tissue of the normal mouse; A’, enlarged image of the square frame in A; B, lung tissue of the asthma mouse; B’, enlarged image of the square frame in B; arrows indicate cells with HDAC8 positive expression; scale bar, 50μm

圖6 HDAC8在各組小鼠肺組織中的表達水平和活性檢測。 A，HDAC8水平的Western blot檢測代表性結果；B，HDAC8水平的統(tǒng)計學分析；C，HDAC8活性熒光檢測結果的統(tǒng)計學分析；*，與正常組比較，P＜0.01Fig. 6 Detection for expression level and activity of HDAC8 in the lung tissue. A, representative results of HDAC8 level detected by Western blot; B,statistical analysis for expression level of HDAC8 detected by Western blot; C, statistical analysis for activity of HDAC8 detected by fluorometric assay;*, P＜0.01, compared with the normal group