MiR-425對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖遷移的作用及分子機(jī)制

萬正英，李雙蘭，馬銳

（南陽市張仲景醫(yī)院內(nèi)科，南陽 47300000）

血管重構(gòu)是許多心血管系統(tǒng)疾病如高血壓、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化等的重要病理學(xué)特征[1]。血管平滑肌細(xì)胞是血管壁的主要組成部分，位于管壁的中層；其生物學(xué)功能的改變，特別是細(xì)胞的過度增生及肥大被認(rèn)為是引發(fā)血管重構(gòu)的重要原因之一[2-4]；故而深入研究血管平滑肌細(xì)胞的生物學(xué)行為及其調(diào)節(jié)機(jī)制可為深入認(rèn)識(shí)及防治血管重構(gòu)提供新的方向和干預(yù)靶點(diǎn)。

microRNAs (miRNAs)是一類內(nèi)源性非蛋白編碼的RNA分子，可通過促進(jìn)mRNA的轉(zhuǎn)錄或者在轉(zhuǎn)錄后水平抑制其翻譯來調(diào)控一個(gè)或多個(gè)靶基因的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞的各種生物學(xué)功能[5]。近年的大量研究證明，miRNAs可參與調(diào)控心血管系統(tǒng)的發(fā)育及血管平滑肌細(xì)胞的生物學(xué)特性[5,6]。許多參與血管重構(gòu)的miRNAs，如miR-130a可參與調(diào)控肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的EMT進(jìn)程，進(jìn)而參與肺血管重構(gòu)[7]；miR-4632可靶向c-JUN調(diào)控肺主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖及凋亡[8]。miR-425是近年來最為廣泛研究的miRNAs分子之一，定位于3號(hào)染色體，具有高度的保守性。但對(duì)其研究多集中于腫瘤相關(guān)疾病，且在不同類型的腫瘤中miR-425的作用不盡相同。在肝細(xì)胞癌中，miR-425可通過多條信號(hào)通路發(fā)揮原癌基因樣作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[9]；而在ER-α陰性的乳腺癌細(xì)胞中，miR-425 可靶向CCND2、PTEN等抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[10]。 miR-425也可表達(dá)于心血管系統(tǒng)，研究顯示心衰模型大鼠經(jīng)過一段時(shí)間的有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練之后，可檢測(cè)到心肌組織中miR-425的高表達(dá)[11]?？紤]到基因調(diào)控的復(fù)雜性，且各研究所采用的研究對(duì)象及實(shí)驗(yàn)條件不盡相同，關(guān)于miR-425對(duì)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖及遷移的具體調(diào)控作用及潛在分子機(jī)制尚不完全清楚。本研究通過轉(zhuǎn)染miR-425 inhibitor下調(diào)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中miR-425的表達(dá)，探討miR-425對(duì)HASMCs增殖、周期及遷移等生物學(xué)行為的影響，并進(jìn)一步分析其可能涉及的分子機(jī)制。

材料和方法

1 材料與試劑

人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞HASMCs購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；胎牛血清（fetal bovine serum, FBS），DMEM/F12培養(yǎng)基及Opti-NEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）購自美國Sigma 公司；Lipofectamine 2000和相關(guān)轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen； PTEN、PI3K、p-AKT/AKT、MMP-9及GAPDH抗體購于美國CST公司；CCK-8細(xì)胞增殖分析試劑盒購于日本同仁化學(xué)研究所；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購于南京凱基公司；miR-425 inhibitor及negative control miRNA、SYBR Green I real-time PCR kit由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組

實(shí)驗(yàn)用HASMCs常規(guī)培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基中；培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件設(shè)置為37 ℃，5% CO2。每2d換液，3～5d常規(guī)使用0.25%的胰酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板上，待細(xì)胞生長至60%～80%融合，更換為不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基同步化12h，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。組別設(shè)置：空白對(duì)照組（Control）、陰性對(duì)照組（negative control miRNA, NC）、miR-425 inhibitor轉(zhuǎn)染組（miR-425 inhibitor，425-i）。將miR-425 inhibitor或者negtive control miRNA溶解于Opti-MEM培養(yǎng)基中室溫孵育5min；同時(shí)另取Lipofectamine 2000加入Opti-MEM培養(yǎng)基室溫孵育5min，將兩者輕柔混合后室溫繼續(xù)反應(yīng)20min。而后將混合物分別加入相應(yīng)組別的細(xì)胞中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h。提取細(xì)胞蛋白測(cè)定轉(zhuǎn)染效率并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

3 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力

取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板中（2×103個(gè)/孔），經(jīng)過相應(yīng)處理后繼續(xù)培養(yǎng)22h，向每孔加10μL CCK-8試劑，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2h。而后用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔在450nm波長處的吸光度值。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔取均值，另設(shè)單孔只加入培養(yǎng)基作空白對(duì)照。

4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

各組細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化、離心收集細(xì)胞。PBS漂洗3次后重懸細(xì)胞，同時(shí)調(diào)整密度至1×106個(gè)/mL；加入70%無水乙醇置于4℃避光固定過夜。離心洗去乙醇，加碘化丙啶（PI）染液于37℃避光反應(yīng)30min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)激發(fā)波長488nm處的熒光強(qiáng)度。

5 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移

收集各組細(xì)胞并用培養(yǎng)基重懸，然后調(diào)整密度至2×105個(gè)/mL。將各組細(xì)胞分別接種于Transwell小室的上室中，同時(shí)在下室內(nèi)加入常規(guī)培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h。取出細(xì)胞經(jīng)PBS沖洗（3次）后用棉簽擦除上室表面的細(xì)胞，而后將小室置于90%無水乙醇中固定，加0.1%的結(jié)晶紫染色，PBS漂洗后倒置顯微鏡下觀察拍照，并計(jì)數(shù)染色細(xì)胞的個(gè)數(shù)(每組細(xì)胞計(jì)數(shù)5個(gè)視野取其均值)。

6 Western blot測(cè)定蛋白水平

用含蛋白酶抑制劑Cocktail的RIPA裂解提取各組細(xì)胞蛋白，而后用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。調(diào)整各組蛋白上樣總量至70μg，加入4倍體積的上樣緩沖液，變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。待藍(lán)色的上樣緩沖液 泳出后將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜，加5%脫脂牛奶室溫封閉90min，依據(jù)按說明書要求加入一抗4℃孵育過夜，復(fù)溫后TBST漂洗5min×3次；加相應(yīng)二抗室溫孵育2h；TBST漂洗10min×3次，暗室中加ECL發(fā)光液顯影，定影并沖洗膠片。所得結(jié)果經(jīng)Image J 行蛋白灰度半定量分析。

7 qRT-PCR測(cè)定mRNA表達(dá)

Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，依據(jù)說明書進(jìn)行操作。所提RNA經(jīng)純化、定量后，取2μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用SYBR Green I real-time PCR的方法檢測(cè)mRNA的相對(duì)表達(dá)量，U6作為內(nèi)參。引物設(shè)計(jì)如下：miR-425-F∶ 5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’,miR-425-R∶ 5’-ACACTCCAGCTGGGAATGACACGATCACTCC -3’； U6-F∶ 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’, U6-R∶ 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’ 。PCR 循環(huán)條件為 95℃ 10s；95℃ 5s，60℃ 34s，45個(gè)循環(huán)。記錄CT值并采用2-△△CT法分析mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)均錄入SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件中進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)所得的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 血管緊張素Ⅱ上調(diào)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)miR-425表達(dá)

血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）是血管重構(gòu)的關(guān)鍵分子之一[12]。本實(shí)驗(yàn)先用Ang Ⅱ刺激HASMCs增殖，并檢測(cè)miR-425的表達(dá)情況。qRT-PCR的結(jié)果顯示（圖1），Ang Ⅱ可時(shí)間及劑量依賴性的上調(diào)HASMCs中miR-425的表達(dá)。

圖1 miR-425在HASMCs中表達(dá)的qRT-PCR檢測(cè)。A，Ang Ⅱ濃度依賴性提高細(xì)胞活力；B，Ang Ⅱ時(shí)間依賴性提高細(xì)胞活力；C，Ang Ⅱ濃度依賴性促進(jìn)細(xì)胞中miR-425表達(dá)； D，Ang Ⅱ時(shí)間依賴性促進(jìn)細(xì)胞中miR-425表達(dá)；*0.01＜P＜0.05 vs 0μmol/L; #0.01＜P＜0.05 vs 0h；n=6 Fig. 1 The expression of miR-425 in HASMCs. A, Ang Ⅱ increased cell viability in a dose-dependent manner; B, Ang Ⅱ increased cell viability in a time-dependent manner; C, Ang Ⅱ up-regulated miR-425 expression in a dose-dependent manner; D, Ang Ⅱ up-regulated miR-425 expression in a time-dependent manner; *0.01＜ *P＜0.05 vs 0μmol/L; #0.01＜*P＜0.05 vs 0h; n=6

2 下調(diào)miR-425抑制Ang Ⅱ所致的HASMCs增殖

為進(jìn)一步確定miR-425對(duì)血管重構(gòu)過程中HASMCs生物學(xué)行為的影響，本實(shí)驗(yàn)通過轉(zhuǎn)染miR-425 inhibitor 下調(diào)細(xì)胞中miR-425的表達(dá)。轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)顯示（圖2A），425-i組miR-425的表達(dá)下調(diào)至對(duì)照組的0.39±0.04倍。CCK-8細(xì)胞活力分析顯示（圖2B），下調(diào)miR-425可部分逆轉(zhuǎn)Ang Ⅱ所致的細(xì)胞活力增加。流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期檢測(cè)顯示（圖2C），Ang Ⅱ處理后G0/G1期細(xì)胞比例由87.21%±2.37%下降到54.26%±2.34%，與之對(duì)應(yīng)，S期細(xì)胞比例由8.07%±1.15%上升到38.63%±2.47%。下調(diào)miR-425后Ang Ⅱ處理細(xì)胞的G0/G1期比例為70.08%±2.19%，S期比例為20.17%±1.69%。結(jié)果表明下調(diào)miR-425可顯著抑制Ang Ⅱ所致的細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)換。

圖2 下調(diào)miR-425抑制Ang Ⅱ所致的HASMCs增殖. A，轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)；B，下調(diào)miR-425部分逆轉(zhuǎn)Ang Ⅱ所致的HASMCs活力增加；C，下調(diào)miR-425部分逆轉(zhuǎn)Ang Ⅱ所致的HASMCs 周期G1/S轉(zhuǎn)換；*P＜0.01 vs control; #0.01＜P＜0.05 vs Control＋Ang Ⅱ; n=6Fig. 2 Down-regulation of miR-425 inhibited Ang Ⅱ-induced HASMCs proliferation. A, the detection of transfection efficacy; B, knockdown of miR-425 partly reversed Ang Ⅱ-induced HASMCs viability increase; C, knockdown of miR-425 partly reversed Ang Ⅱ-induced HASMCs cell cycle G1/S transition (flow cytometry detection); D, statistical analysis for the results of flow cytometry detection; *P＜0.01 vs Control; 0.01＜#P＜0.05 vs Control＋ AngⅡ; n=6

3 下調(diào)miR-425抑制HASMCs遷移

本實(shí)驗(yàn)還進(jìn)一步采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了下調(diào)miR-425對(duì)HASMCs細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果顯示（圖3），下調(diào)miR-425后細(xì)胞的遷移率由對(duì)照組的100% ± 3.34 %下降至62.04% ± 3.47%，即下調(diào)miR-425可顯著抑制HASMCs的遷移。

圖3 下調(diào)miR-425抑制HASMCs遷移. *P＜0.01 vs Control; n=6；比例尺，100μmFig. 3 Down-regulation of miR-425 inhibited HASMCs migration. *P＜0.01 vs Control; n=6; scale bar, 100μm

4 下調(diào)miR-425抑制PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路活性

為了探討下調(diào)miR-425抑制HASMCs增殖及遷移的潛在分子機(jī)制，采用Western blot檢測(cè)了下調(diào)miR-425對(duì)細(xì)胞中PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路活性的影響。Western blot檢測(cè)顯示，相對(duì)于Control組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染miR-425 inhibitor之后PI3K、p-Akt及MMP-9水平均顯著降低，而PTEN水平則明顯升高。結(jié)果表明，下調(diào)miR-425可抑制PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路的活性。

圖4 下調(diào)miR-425抑制PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路的活性. *0.01＜P＜0.05 vs Control; n=6Fig. 4 Down-regulation of miR-425 inhibited the activity of PTEN/PI3K/Akt pathway. *0.01＜P＜0.05 vs Control; n=6

討 論

血管平滑肌細(xì)胞過度增殖是心血管疾病進(jìn)展中血管重構(gòu)的關(guān)鍵因素之一，為系統(tǒng)分析miR-425對(duì)HASMCs增殖及遷移等生物學(xué)行為的影響，本實(shí)驗(yàn)首先通過Ang Ⅱ刺激HASMCs增殖，并檢測(cè)該過程中miR-425的表達(dá)情況，結(jié)果顯示Ang Ⅱ可時(shí)間及劑量依賴性的促進(jìn)HASMCs中miR-425的表達(dá)。眾所周知，Ang Ⅱ可經(jīng)多條復(fù)雜交錯(cuò)的信號(hào)通路誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖，參與血管重構(gòu)并最終導(dǎo)致高血壓、腦卒中等心血管疾病的發(fā)生[12]。本實(shí)驗(yàn)的初步檢測(cè)結(jié)果表明，miR-425可能參與調(diào)控Ang Ⅱ所致的HASMCs增殖過程。

隨后本研究采用miR-425 inhibitor下調(diào)HASMCs中內(nèi)源性miR-425的表達(dá)，以進(jìn)一步分析miR-425在Ang Ⅱ所致細(xì)胞增殖中具體作用及潛在機(jī)制，結(jié)果顯示下調(diào)miR-425可部分逆轉(zhuǎn)Ang Ⅱ所致的細(xì)胞活力增加。細(xì)胞增殖與細(xì)胞的周期轉(zhuǎn)換密切相關(guān)，故而我們通過流式細(xì)胞術(shù)分析了下調(diào)miR-425對(duì)HASMCs周期轉(zhuǎn)換的影響，結(jié)果顯示，Ang Ⅱ可促進(jìn)HASMCs細(xì)胞周期由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化，而下調(diào)miR-425可部分逆轉(zhuǎn)該作用。此外，Transwell的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，下調(diào)miR-425可抑制HASMCs的遷移。由此可見，miR-425可參與調(diào)控人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖及遷移等生物學(xué)行為。

miRNAs作用的發(fā)揮主要是通過靶基因的調(diào)控來實(shí)現(xiàn)的，已報(bào)道的miR-425靶基因包括PTEN、SMAD2、CTNNA3、CCM3、CYLD等[10,13-16]。同時(shí)細(xì)胞的增殖、周期轉(zhuǎn)換及細(xì)胞遷移往往與細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)分子及信號(hào)通路的調(diào)控密不可分。在眾多信號(hào)通路中，PTEN/PI3K/Akt是調(diào)控細(xì)胞生長、分化、凋亡、代謝等的經(jīng)典通路，PTEN缺失或功能下調(diào)會(huì)導(dǎo)致PI3K的激活，活化的PI3K可進(jìn)一步將底物PIP2轉(zhuǎn)化為PIP3，作為第二信使激活該通路下游包括Akt在內(nèi)的眾多信號(hào)分子，從而參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、遷移、凋亡等病理生理學(xué)過程[17,18]。故而本研究分析了下調(diào)miR-425對(duì)PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路的影響。結(jié)果顯示，相對(duì)于Control組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染miR-425 inhibitor之后PTEN的蛋白表達(dá)明顯升高，而PI3K及p-Akt的蛋白表達(dá)均顯著降低。由此表明，下調(diào)miR-425可抑制PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路的活性。MMP-9則是PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路下游與細(xì)胞遷移密切相關(guān)的因子之一[19,20]，下調(diào)miR-425也可降低HASMCs中MMP-9的表達(dá)水平，這可能是其抑制遷移的潛在機(jī)制之一。以上結(jié)果說明下調(diào)miR-425對(duì)HASMCs生物學(xué)功能產(chǎn)生的調(diào)控作用可能與PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)，但是兩者之間具體的作用機(jī)制以及涉及的其他信號(hào)分子還有進(jìn)一步深入的研究。