在線固相萃取—高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肉和羊肉中10 種β—受體激動(dòng)劑

馬俊美 孫磊 劉茁 沈璐 張冬生 賈文軒 李強(qiáng) 范素芳

摘 要：建立在線固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測豬肉及羊肉中10 種β-受體激動(dòng)劑的全自動(dòng)分析方法。樣品于37 ℃酶解16 h后，經(jīng)MCX在線固相萃取小柱凈化，采用XBridge C18色譜柱分離，以0.1%甲酸水溶液-乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，在電噴霧電離正離子模式下，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測，內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果表明：10 種β-受體激動(dòng)劑在0.01～10.00 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 0；檢出限為0.004～0.040 μg/kg，定量限為0.02～0.20 μg/kg；方法回收率為76.5%～107.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。該方法分析速度快、靈敏度高，可用于豬肉和羊肉中10 種β-受體激動(dòng)劑的定性及定量分析。

關(guān)鍵詞：在線固相萃取；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；β-受體激動(dòng)劑；內(nèi)標(biāo)法定量

Determination of 10 β-Agonists in Pork and Lamb Samples by On-Line Solid Phase Extraction Coupled to

Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

MA Junmei1， SUN Lei1， LIU Zhuo2， SHEN Lu1， ZHANG Dongsheng1， JIA Wenxuan1， LI Qiang1，*， FAN Sufang1，*

（1.Hebei Food Inspection and Research Institute， Shijiazhuang 050000， China；

2.College of Bioscience and Bioengineering， Hebei University of Science and Technology， Shijiazhuang 050018， China）

Abstract： In this research， we developed a fully automated method to determine 10 β-agonists in pork and lamb using

on-line solid phase extraction coupled to high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

（HPLC-MS-MS）. After being enzymatically digested at 37 ℃ for 16 h， samples were purified by on-line solid phase extraction on an MCX column， and then separated on an XBridge C18 column by gradient elution using 0.1% formic acid solution and acetonitrile as the mobile phase. Mass spectrometric data were acquired under multiple reaction monitoring （MRM） mode using positive ion electrospray ionization. Quantitation was performed by the internal standard method. The results showed a good linear relationship in the concentration range of 0.01–10.00 ng/mL was achieved for all analytes with acorrelation coefficient higher than 0.999 0. The limits of detection （LOD） were in the range of 0.004–0.040 μg/kg and the limits of quantitation （LOQ） were in the range of 0.02–0.20 μg/kg. The recoveries of the method ranged from 76.5% to 107.7%， with relative standard deviation （RSD）lower than 10%. These results demonstrate that the method is simple， sensitive， and can be used for quantification of 10 β-agonists in pork and lamb samples.

Keywords： on-line solid phase extraction； liquid chromatography-tandem mass spectrometry； β-agonists； internal standard method

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201805004

中圖分類號：O657.63 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2018）05-0019-07

引文格式：

馬俊美， 孫磊， 劉茁， 等. 在線固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肉和羊肉中10 種β-受體激動(dòng)劑[J]. 肉類研究， 2018， 32（5）： 19-25. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201805004. http：//www.rlyj.pub

MA Junmei， SUN Lei， LIU Zhuo， et al. Determination of 10 β-agonists in pork and lamb samples by on-line solid phase extraction coupled to liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Meat Research， 2018， 32（5）： 19-25. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201805004. http：//www.rlyj.pub

β-受體激動(dòng)劑是一類化學(xué)合成的苯乙醇胺類物質(zhì)，具有“再分配效應(yīng)”，能夠使生物體內(nèi)的營養(yǎng)成分由脂肪向肌肉組織轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致體內(nèi)的脂肪分解代謝增強(qiáng)、蛋白質(zhì)合成增加、胴體瘦肉率提高。β-受體激動(dòng)劑在動(dòng)物體內(nèi)的殘留時(shí)間較長，可致使食用者發(fā)生嘔吐、激動(dòng)、失眠、食欲減退或心律失常等癥狀，嚴(yán)重時(shí)能誘導(dǎo)染色體畸變，引發(fā)癌癥，對人體危害巨大[1-6]。因此，我國農(nóng)業(yè)部第196號和235號公告均禁止β-受體激動(dòng)劑作為生長促進(jìn)劑用于畜牧業(yè)。

目前，國內(nèi)外報(bào)道的動(dòng)物源性食品中β-受體激動(dòng)劑殘留的檢測方法主要有高效液相色譜（high efficiency liquid chromatography，HPLC）法[7-8]、酶聯(lián)免疫法[9-10]、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[11-13]及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法[14-21]等。HPLC法靈敏度較差，酶聯(lián)免疫法假陽性率高，GC-MS法的前處理過程比較復(fù)雜，HPLC-MS/MS法具有優(yōu)異的定量與定性分析能力，已成為β-受體激動(dòng)劑的主要檢測和確證方法。國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22286—2008《動(dòng)物源食品中多種β-受體激動(dòng)劑殘留量的測定 液相色譜串聯(lián)質(zhì)

譜法》[22]、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1924—2011《進(jìn)出口動(dòng)物源食品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和特步他林殘留量的測定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》[23]及農(nóng)業(yè)部1025號公告-18—2008《動(dòng)物源性食品中β-受體激動(dòng)劑殘留檢測 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[24]等均采用HPLC-MS/MS法，然而，雖然這些標(biāo)準(zhǔn)中的方法能夠滿足分析要求的準(zhǔn)確度，但均采用離線固相萃取技術(shù)，操作步驟非常繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

在線固相萃取是近年來基于固相萃取技術(shù)發(fā)展起來的一種全自動(dòng)樣品前處理技術(shù)[25-26]，可有效簡化樣品前處理過程，提高工作效率，同時(shí)保證方法的靈敏度與準(zhǔn)確度。本研究采用Spark Holland公司的在線固相萃取裝置，開發(fā)了一種全新的在線固相萃取技術(shù)，用于檢測豬肉和羊肉中10 種β-受體激動(dòng)劑的殘留量，并采用內(nèi)標(biāo)法定量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽酸克倫特羅（純度98.5%）、沙丁胺醇（純度100%）、萊克多巴胺（純度97.0%）、西馬特羅（純度99.0%）、妥布特羅（純度99.0%）、鹽酸噴布特羅（純度99.0%）、非諾特羅（100 mg/mL）、特布他林（純度98.5%）、氯丙那林（純度99.0%）、苯乙醇胺A（純度99.6%）、萊克多巴胺-D3（純度97.1%）、沙丁胺醇-D3（純度98.5%）、克倫特羅-D9（純度99.0%）、苯乙醇胺A-D3（純度99.7%）標(biāo)準(zhǔn)品 德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；甲醇、甲酸（均為色譜純） 美國Fisher公司；乙酸銨（色譜純） 美國Sigma公司；超純水（電阻率18.2 MΩ·cm，25 ℃） 美國Millipore公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HySphere C18 HD在線固相萃取小柱（10 mm×1 mm） 荷蘭Spark公司；MCX、HLB在線固相萃取小柱（10 mm×1 mm） 美國Waters

公司。

Symbiosis Pico全自動(dòng)在線固相萃取系統(tǒng) 荷蘭Spark Holland公司；AB SCIEX Triple Quad 6500液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配備電噴霧電離源）、MultiQuant 3.0.1數(shù)據(jù)處理軟件 美國Sciex公司；CR22N高速冷凍離

心機(jī) 德國Hitachi公司；SHA-B恒溫水浴振蕩器

常州潤華電器有限公司；Vortex Genius 3旋渦混合器 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱取適量克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、西馬特羅、妥布特羅、噴布特羅、非諾特羅、特布他林、氯丙那林、苯乙醇胺A、萊克多巴胺-D3、沙丁胺醇-D3、克倫特羅-D9和苯乙醇胺A-D3標(biāo)準(zhǔn)品于不同的100 mL容量瓶中，用甲醇定容，將各標(biāo)準(zhǔn)品配制成質(zhì)量濃度均為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，-20 ℃保存，有效期為1 年。

用甲醇稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，將各標(biāo)準(zhǔn)品配制成質(zhì)量濃度均為1.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，4 ℃保存，有效期為3 個(gè)月。

1.3.2 樣品前處理

稱取5 g試樣，置于50 mL聚丙烯離心管中，加入100 μL混合內(nèi)標(biāo)工作溶液（4 種內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度均為10 ng/mL）和10 mL乙酸銨緩沖溶液（2 mol/L），再加入40 μL β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，充分振蕩混勻，37 ℃酶解16 h，酶解液于8 000 r/min條件下離心5 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，置于Spark進(jìn)樣器，待測。

1.3.3 在線固相萃取條件優(yōu)化

目前常用于β-受體激動(dòng)劑檢測的離線固相萃取柱類型有MCX、HLB和C18[27-30]，本研究選取這3 種填料的在線固相萃取小柱，通過考察10 種β-受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)品

（5 ng/mL）的出峰情況，選擇合適的在線固相萃取小柱。

在上樣量（50 μL）一定的條件下，考察不同洗脫溶劑（2%氨水甲醇和5%氨水甲醇）、洗脫速率（0.05、0.10、0.15、0.20 mL/min）和洗脫體積（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mL）對目標(biāo)化合物的洗脫效果，根據(jù)10 種β-受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)品（5 ng/mL）的響應(yīng)值和出峰情況選擇合適的洗脫溶劑、洗脫速率和洗脫體積。

1.3.4 HPLC條件優(yōu)化

分別選用乙腈水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇水溶液和甲醇-0.1%甲酸水溶液4 種體系作為流動(dòng)相，考察相同洗脫程序下化合物的響應(yīng)和出峰情況。在線凈化過程中的洗脫溶劑為高比例有機(jī)相，流動(dòng)相保持高濃度水相才能避免洗脫液在色譜柱入口處發(fā)生擴(kuò)散，考察流動(dòng)相中水相的初始比例為90%、95%和98%時(shí)目標(biāo)化合物在色譜柱上的保留情況。

1.3.5 MS參數(shù)優(yōu)化

通過針泵進(jìn)樣的方式，將10 種化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 ng/mL）以7 μL/min的速率直接注入Triple Quad 6500質(zhì)譜儀中，在電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）正離子模式（ESI+）下，對目標(biāo)物進(jìn)行Q1 MS全掃描，確定母離子，對母離子進(jìn)行Product ion二級掃描，分別確定其定性和定量離子，再選擇多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式對子離子的去簇電壓、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.6 方法的線性關(guān)系、檢出限和定量限測定

分別準(zhǔn)確移取適量10 種β-受體激動(dòng)劑的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，置于同一容量瓶中，經(jīng)甲醇稀釋后配制成各β-受體激動(dòng)劑的質(zhì)量濃度均分別為0.01、0.02、0.10、0.20、0.50、1.00、5.00、10.00 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)混合溶液（含0.1 ng/mL的內(nèi)標(biāo)），采用優(yōu)化后的條件進(jìn)行測定。同時(shí)，采用空白樣品中添加目標(biāo)化合物的方法，以信噪比（RS/N）=3時(shí)目標(biāo)化合物的濃度作為檢出限（limit of detection，LOD），RS/N=10時(shí)目標(biāo)化合物的濃度作為定量限（limit of quantification，LOQ）。

1.3.7 加標(biāo)回收率測定

向空白豬肉基質(zhì)和空白羊肉基質(zhì)中添加10 種β-受體激動(dòng)劑的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收率測定，添加水平分別為1 倍、2 倍、10 倍LOQ，同時(shí)計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。每個(gè)添加水平重復(fù)測定6 次。

1.3.8 與標(biāo)準(zhǔn)方法的比較

選取豬肉和羊肉陰性樣品各1 份，以1 μg/kg的加標(biāo)量，加入10 種β-受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，分別采用本研究建立的方法（方法1）、GB/T 22286—2008（方法2）

和農(nóng)業(yè)部1025號公告-18—2008（方法3）中的方法進(jìn)行測定。每個(gè)樣品平行測定3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 在線固相萃取條件的選擇

相較于HLB和C18 2 款小柱，MCX在線凈化小柱對酶解后的樣品凈化效果最好，加標(biāo)回收率最高。β-受體激動(dòng)劑結(jié)構(gòu)中含有堿性β-羥胺側(cè)鏈，在酸性條件下呈陽離子特性，可被MCX小柱有效吸附，用酸性甲醇將雜質(zhì)進(jìn)行淋洗后，再用堿性甲醇對目標(biāo)物進(jìn)行洗脫，能對酶解后樣品起到很好的凈化作用。

在上樣量、洗脫速率和洗脫體積一定的條件下，考察2%氨水甲醇和5%氨水甲醇作為洗脫溶劑時(shí)對目標(biāo)化合物的洗脫效果。結(jié)果表明，使用5%氨水甲醇作為洗脫溶劑時(shí)的回收率較高，故選用5%氨水甲醇作為洗脫溶劑。

當(dāng)洗脫速率為0.05 mL/min時(shí)，色譜峰的峰型較差，出現(xiàn)嚴(yán)重拖尾；當(dāng)洗脫速率增大至0.10 mL/min時(shí)，色譜峰的峰型良好，峰面積顯著增大；洗脫速率繼續(xù)增大時(shí)，洗脫效率降低，峰面積變小。故選擇洗脫速率為0.10 mL/min。

在線凈化過程中，洗脫體積與洗脫效果密切相關(guān)，直接影響回收率和色譜峰型。由圖1可知：洗脫體積對10 種β-受體激動(dòng)劑的影響顯著，當(dāng)洗脫體積為0.05、0.10 mL時(shí)，未能對目標(biāo)物進(jìn)行有效洗脫；隨著洗脫體積的增大，10 種β-受體激動(dòng)劑的峰面積逐漸增加，洗脫體積為0.20 mL時(shí)，峰面積最大；當(dāng)洗脫體積繼續(xù)增大時(shí)，峰面積趨于穩(wěn)定。故選擇洗脫體積為0.20 mL。

最終優(yōu)化得到的在線固相萃取條件如表1所示。

2.2 HPLC條件的選擇

本研究使用Symbiosis Pico全自動(dòng)在線固相萃取系統(tǒng)，該系統(tǒng)由在線凈化裝置和液相色譜2 部分組成，2 部分獨(dú)立運(yùn)行，經(jīng)過在線固相萃取凈化后的樣品采用HPD聚焦模式直接注入色譜柱進(jìn)行分析。凈化過程中的洗脫速率為0.1 mL/min，為避免總體速率變化較快而導(dǎo)致的壓力波動(dòng)，造成出峰異常，需要降低流動(dòng)相的速率（由0.6 mL/min降至0.5 mL/min），使洗脫速率與流動(dòng)相速率之和保持不變。

在ESI+條件下，加入甲酸有助于化合物的離子化，提高分離效率和MS信號強(qiáng)度。甲醇和乙腈作為流動(dòng)相時(shí)對信號強(qiáng)度的影響均較小，但以甲醇作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，色譜柱壓力變化較大，平衡所需時(shí)間較長。故選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相。

流動(dòng)相中水相的初始比例為90%時(shí)，沙丁胺醇和特布他林在色譜柱上有明顯的擴(kuò)散現(xiàn)象；流動(dòng)相中水相的初始比例為95%時(shí)，所有化合物峰型良好；流動(dòng)相中水相的初始比例為98%時(shí)的分類效果與水相的初始比例為95%時(shí)無差別。故選擇流動(dòng)相中水相的初始比例為95%。

最終優(yōu)化得到的HPLC條件為：色譜柱：XBridgeTM C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量50 μL；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B：乙腈；洗脫程序：0～0.05 min，0.6～0.5 mL/min，流動(dòng)相B 5%；0.05～2.00 min，0.5 mL/min，流動(dòng)相B 5%；2.00～2.05 min，0.5～0.6 mL/min，流動(dòng)相B 5%；2.05～8.00 min，0.6 mL/min，流動(dòng)相B 5%～90%；8.00～9.50 min，0.6 mL/min，流動(dòng)相B 90%；9.50～10.00 min，0.6 mL/min，流動(dòng)相B 90%～5%；10.00～12.00 min，0.6 mL/min，流動(dòng)相B 5%。

2.3 MS參數(shù)的選擇

優(yōu)化后的MS參數(shù)為：離子化電壓5.5 kV；離子源溫度550 ℃；氣簾氣壓力206.8 kPa；霧化器壓力310.3 kPa；輔助氣壓力344.8 kPa。10 種β-受體激動(dòng)劑的MRM參數(shù)如表2所示，色譜-質(zhì)譜圖如圖2所示。

a. 氯丙那林；b. 西馬特羅；c. 特布他林；d. 妥布特羅；e. 沙丁胺醇；

f. 克倫特羅；g. 噴布特羅；h. 萊克多巴胺；i. 非諾特羅；j. 苯乙醇胺A；k. 沙丁胺醇-D3；l. 克倫特羅-D9；m. 萊克多巴胺-D3；n. 苯乙醇胺A-D3。

2.4 方法的線性關(guān)系、LOD和LOQ

參照GB/T 22286—2008，苯乙醇胺A-D3作為苯乙醇胺A的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，萊克多巴胺-D3作為萊克多巴胺的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，沙丁胺醇-D3作為沙丁胺醇和特布他林的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，克倫特羅-D9作為其余β-受體激動(dòng)劑的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。

由表3可知，10 種β-受體激動(dòng)劑在0.01～10.00 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，均滿足相關(guān)系數(shù)≥0.999 0，LOD為0.004～0.040 μg/kg，LOQ為0.02～0.20 μg/kg，低于GB/T 22286—2008（LOD為0.5 μg/kg）和農(nóng)業(yè)部1025號公告-18—2008（LOD為0.25 μg/kg）。

2.5 方法的加標(biāo)回收率

由表4可知，10 種β-受體激動(dòng)劑在豬肉基質(zhì)中的加標(biāo)回收率為76.5%～107.7%，RSD為2.4%～9.5%，在羊肉基質(zhì)中的加標(biāo)回收率為78.3%～102.1%，RSD為3.1%～9.2%。

2.6 與標(biāo)準(zhǔn)方法的比較結(jié)果

由表5可知，3 種方法的測定結(jié)果基本一致，而本研究中的方法在檢測成本、測定效率、靈敏度和重復(fù)性等方面均優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)方法。標(biāo)準(zhǔn)方法均采用離線固相萃取方法，固相萃取柱為一次性使用，單次檢測成本較高，而在線固相萃取小柱可以重復(fù)進(jìn)樣，有效降低了檢測成本；離線固相萃取過程需要經(jīng)過活化、平衡、上樣、淋洗、洗脫、氮吹、復(fù)溶等，步驟繁瑣，且容易引入人為誤差，本方法從在線固相萃取凈化到完成分析僅需12 min，分析效率大大提高，且過程中流量、流速可控，自動(dòng)化和簡便化的操作更好地提高了方法的精密度和準(zhǔn)確度。

2.7 實(shí)際樣品測定結(jié)果

對購自當(dāng)?shù)爻械?0 個(gè)豬肉樣品和10 個(gè)羊肉樣品中的10 種β-受體激動(dòng)劑進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，檢測結(jié)果均為陰性，且本方法的測定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法

（GB/T 22286—2008、農(nóng)業(yè)部1025號公告-18—2008）的測定結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

本研究采用在線固相萃取-HPLC-MS/MS方法，建立了豬肉和羊肉中10 種β-受體激動(dòng)劑的全自動(dòng)檢測方法。酶解后的樣品經(jīng)過MCX在線固相萃取小柱凈化，用HPLC-MS/MS結(jié)合內(nèi)標(biāo)法校正。該方法操作更加簡便，有機(jī)溶劑使用少，極大縮短了檢測時(shí)間，適用于豬肉和羊肉中10 種β-受體激動(dòng)劑的含量測定，也為其他基質(zhì)中其他β-受體激動(dòng)劑的含量測定提供了參考。

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