食源性沙門氏菌分離株致病性研究和毒力相關基因檢測

劉書宏，吳科敏，周辰瑜，梁競臻，韋 平*

沙門氏菌（Salmonella）是無芽孢革蘭氏陰性直桿菌[1]，是一種重要食品源性病原菌，極易污染食品、水源及畜產(chǎn)品，人一旦攝入了含有大量沙門氏菌的動物性食品，可導致食源性中毒，引發(fā)急性胃腸炎、敗血癥等[2-3]，世界上每年都會有數(shù)以百萬計的人死于沙門氏菌感染[4]。無論是發(fā)達國家還是發(fā)展中國家，沙門氏菌都是嚴格檢疫和監(jiān)控的對象[5]。在我國，由沙門氏菌引起的食物中毒也是居細菌性食物中毒的首位[6]。因此畜禽產(chǎn)品中，沙門氏菌的存在對食品安全、獸醫(yī)公共衛(wèi)生等構成嚴重威脅。沙門氏菌在自然界中分布廣泛，極易污染食物、水源、土壤等。沙門氏菌血清型復雜，目前已發(fā)現(xiàn)超過2 500 種[7]，絕大多數(shù)血清型能在人和動物間交叉感染，對鮮肉食品中分離到的主要血清型的沙門氏菌進行致病力研究可以驗證這些不同血清型的食源性沙門氏菌對人的潛在危害。近年來，隨著現(xiàn)代分子生物學技術的不斷發(fā)展和應用，人們發(fā)現(xiàn)細菌的致病力是大量細菌毒力相關基因相互作用的結果[8]。沙門氏菌毒力相關基因主要分布在毒力島、菌毛、鞭毛、脂多糖和質粒等上[9]。根據(jù)本研究所2008年至今對廣西地區(qū)鮮肉食品中沙門氏菌污染情況的監(jiān)測結果，實驗選取了分離率最高的S. agona、S. derby和對人危害較大的S. enteritidis、S. typhimurium，對其致病力以及毒力基因的分布進行研究，以了解廣西地區(qū)畜禽鮮肉產(chǎn)品中沙門氏菌的致病力強弱，從而防范食源性沙門氏菌對公共安全的潛在威脅，并為廣西地區(qū)防控食品源性沙門氏菌，開展食品衛(wèi)生安全防控工作提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、動物與試劑

從市售鮮肉中分離的沙門氏菌優(yōu)勢血清型分離株：S. agona、S. derby、S. enteritidis、S. typhimurium。

4 周齡左右的SPF級昆明系小白鼠，體質量18～22 g，雌雄各半，購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心。

緩沖蛋白胨水、木糖賴氨酸脫氧膽鹽培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂、營養(yǎng)瓊脂、沙門氏菌生化試劑盒 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；沙門氏菌診斷血清（60 種） 寧波天潤生物技術有限公司；2×Taq Master Mix、DL2000 plus Marker、普通質粒小提試劑盒（離心柱型） 北京康為生物科技有限公司；引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.2 儀器與設備

電熱恒溫培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；ETC811聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀日本東勝公司；小型高速離心機 德國Eppendorf公司；凝膠成像系統(tǒng) 英國UVITEG公司；DYY-8C電泳儀北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 動物致病性實驗

1.3.1.1 半數(shù)致死量的測定

首先通過遞加法預實驗確定最大耐受劑量（maximum tolerated dose，LD0）、絕對致死劑量（absolute lethal dose，LD100）以及組間劑量，然后將50 只昆明小鼠隨機分成5 組，每組10 只，其中一組為對照組。將實驗組的每只昆明小鼠分別腹腔注射0.5 mL不同濃度的攻毒分離株菌液，攻毒濃度見表1。對照組腹腔注射0.5 mL的生理鹽水。隔離飼養(yǎng)，每天觀察數(shù)次，連續(xù)觀察7 d，記錄小鼠的精神狀態(tài)、外觀變化以及死亡情況。分別按改良寇氏法[10]計算攻毒株的半數(shù)致死量（median lethal dose，LD50）。

表1 沙門氏菌攻毒濃度Table 1 Salmonella infection concentrations CFU/mL

1.3.1.2 攻毒小鼠剖檢并回收細菌

對攻毒后死亡的小鼠剖檢觀察各組織臟器病變。按照GB/T 4789.4—2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》[11]對死亡小鼠進行沙門氏菌的檢測分離并回收細菌；回收細菌經(jīng)生化鑒定和血清分型判斷是否為攻毒分離株。7 d后對未死亡的小鼠進行致死處理。

1.3.1.3 病理組織學觀察

對肉眼觀察病變明顯的器官制作石蠟切片，并進行常規(guī)蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。光學顯微鏡觀察攻毒后小鼠臟器的病理組織學變化。

1.3.2 毒力基因檢測

1.3.2.1 引物合成

根據(jù)GenBank中收錄的沙門氏菌與毒力相關的質?；?、菌毛基因、腸毒素基因以及毒力島基因，并參考文獻[12-17]，Primer Premier 5軟件設計了以下毒力基因引物（表2）。

表2 毒力相關基因PCR引物及其序列Table 2 PCR primers for virulence genes

1.3.2.2 總DNA和質粒的提取

熱裂解法提取總DNA：接種環(huán)取純培養(yǎng)的食源菌一環(huán)，放入盛有50 μL 25 mmol/L NaOH溶液的EP管中，混勻，于100 ℃水浴加熱10 min，然后加入4 μL的1 mol/L Tris-HCl，將上述混懸液12 000 r/min離心5 min，最后取上清液作為PCR擴增的模板。按試劑盒說明書提取質粒。

1.3.2.3 PCR擴增與檢測

反應體系：12.5 μL的2×Taq mix，20 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，2 μL DNA模板，加滅菌超純水配制成25 μL的體系；PCR條件：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸35 s，循環(huán)32 次，最后72 ℃終延伸2 min。將PCR擴增產(chǎn)物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，最終通過凝膠成像系統(tǒng)拍照、觀察結果。

2 結果與分析

2.1 優(yōu)勢血清型分離株的致病力實驗結果

2.1.1 攻毒小鼠的觀察

將攻毒分離株接種小鼠后，小鼠均出現(xiàn)精神沉郁、被毛粗亂、發(fā)抖、運動減少以及飲食欲下降等癥狀，且實驗組在接種后的7 d內先后均有不同程度的死亡，回收的細菌經(jīng)生化實驗與血清型鑒定，確定其與攻毒菌株的血清型相同。其LD50見表3。攻毒株S. agona、S. derby、S. enteritidis、S. typhimurium對小鼠致死率分別為70%、70%、60%、40%。對照組表現(xiàn)正常，沒有小鼠死亡。說明攻毒分離株對小鼠均有致病力，且致死率不同。攻毒分離株的LD50顯示，本研究中的S. enteritidis、S. agona、S. derby對昆明小鼠的致病力相似，而S. typhimurium較弱。

表3 沙門氏菌分離株的LD50檢測結果Table 3 LD50 of Salmonella isolates CFU/mL

2.1.2 攻毒小鼠的剖檢變化

圖1 小鼠剖檢病變Fig. 1 Necropsy lesion of mice

由圖1可見，4 種血清型的沙門氏菌對小鼠所致病變相同，小鼠腹腔積液，心臟腫大，肝臟變黃，脾臟腫大、充血；腸壁變薄，腸道內有黃色液體；癥狀明顯者還表現(xiàn)出肺臟的嚴重腫大、出血，腸道的萎縮、黏連。

2.1.3 攻毒小鼠的病理組織學觀察

圖2 小鼠病理組織學觀察結果Fig. 2 Histological photomicrographs of splanchnic tissues

由圖2可見，4 種血清型的沙門氏菌對小鼠的病理組織學變化影響相似，感染致死的小鼠肝臟病變明顯，胞漿或胞核內出現(xiàn)大小不等的空泡，整個細胞呈蜂窩狀結構，肝細胞胞漿或胞核內出現(xiàn)大小不等的空泡，整個細胞呈蜂窩狀結構，肺臟出血、肺泡隔結締組織增生，間質增寬，心肌出現(xiàn)梭狀細胞，腸絨毛、腺體脫落。

2.2 優(yōu)勢血清型分離株毒力基因的檢測結果

圖3 毒力基因S. agona（A）、S. derby（B）、S. enteritidis（C）、S. typhimurium（D）PCR檢測結果Fig. 3 PCR patterns of virulence genes in S. agona (A), S. derby (B),S. enteritidis (C) and S. typhimurium (D)

對致病力實驗中的攻毒株毒力基因的檢測結果顯示（圖3），S. enteritidis與S. derby對所測的stn、fimA、virK、sseL、mgtC、siiE、sopB、spvC、invA 9 種毒力基因均有檢出；S. typhimurium除了SPI-2中的sseL，其他8 種基因均有檢出；S. agona檢出virK、sseL、siiE、sopB、invA、spvC共6 種。

2.3 優(yōu)勢血清型分離株的致病力與其毒力基因之間的相關性

根據(jù)4 種血清型沙門氏菌LD50的結果顯示，S. agona、S. derby、S. enteritidis的LD50相近，S. typhimurium最大，因此說明S. agona、S. derby、S. enteritidis的致病力相近，而S. typhimurium最弱。毒力相似的S. agona、S. derby、S. enteritidis中sseL基因均被檢出，而致病力最弱的S. typhimurium中，只有sseL基因未被檢出。這說明本研究中不同血清型的分離株對小鼠的致病力表型與毒力基因中sseL基因密切相關。

3 討 論

優(yōu)勢血清型的致病力實驗結果顯示，實驗中的攻毒分離株對昆明小鼠均有致病力，且不同血清型分離株對小鼠的致死率不同。LD50顯示，S. enteritidis、S. agona、S. derby對小鼠的致病力相似，S. typhimurium的致病力相對較弱。毒力基因的檢測結果顯示，致死率較高的S. agona、S. derby、S. enteritidis均有SPI-2中sseL基因的檢出，致病力相對較弱的S. typhimurium則沒有檢出sseL基因。說明沙門氏菌分離株致病性的強弱與毒力島SPI-2中的sseL基因密切相關。

SPI是位于染色體上負責編碼毒力基因簇的染色體片段[18]。目前已有SPI-1、SPI-2、SPI-3、SPI-4、SPI-5等20多個毒力島被發(fā)現(xiàn)[19]。其中SPI-2的基因可編碼Ⅲ型分泌系統(tǒng)2（T3SS-2）的結構蛋白、效應蛋白、伴侶蛋白等。有研究證明，SPI-2的突變能使傷寒沙門氏菌對小鼠的毒力降低1 000 倍[20-21]。sseL是SPI-2中重要的操縱子，沙門氏菌sseL基因可編碼T3SS-2效應蛋白SseL。效應蛋白SseL是一種去泛素酶，能夠抑制宿主細胞的核因子κB信號通路，抑制機體炎性作用，在小鼠體內發(fā)揮毒力起著重要作用[22]。SseL蛋白還能夠延遲巨噬細胞對Salmonella的毒性作用，而且對巨噬細胞具有一定的殺傷能力，使菌體逃避巨噬細胞輔酶殺傷作用[23-24]，是沙門氏菌發(fā)揮毒力作用的重要因子。此外，薛穎[25]證明sseL基因缺失株與野生株雖然體外競爭生長能力差異不顯著，但是體內競爭生長能力在3 d時顯著弱于野生株。因此推斷可能是sseL發(fā)生突變或缺失導致SPI-2基因突變，S. typhimurium的毒力降低，對小鼠的致病力減弱。另外，老鼠和人類基因組相似度很高，其基因數(shù)目和人類均有3萬 個左右，有99%的基因都能在人類基因組中找到相應的同源基因，對之進行比較研究可得知很多關于人類疾病和生理機能的信息[26-27]。因此，通過對小鼠進行致病力實驗可檢測食源性沙門氏菌的毒力，有效地預測和推斷食源性沙門氏菌對食品安全和人類健康的危害。

近年來，廣西地區(qū)市售鮮肉中分離的沙門氏菌以S. agona、S. derby為主[28-30]，由S. enteritidis、S. typhimurium引發(fā)的食物中毒事件在各地均屢有發(fā)生[31-33]。沙門氏菌分離株對磺胺異惡唑、四環(huán)素、甲氧嘧啶、復方新諾明產(chǎn)生了很強的耐藥性，耐藥率均在50%以上，多重耐藥率高達60.5%[34]。因此，對這4 種血清型的Samonella分離株的致病力及毒力基因的檢測具有重要意義。本研究表明，本地區(qū)市售鮮肉中流行的S. enteritidis、S. agona、S. typhimurium、S. derby 4 種血清型沙門氏菌分離株對昆明小鼠有較強的致病力，且不同血清型對小鼠的致病力差異與毒力基因的分布有關。因此，有關部門應繼續(xù)加強本地區(qū)食源性沙門氏菌的監(jiān)測，嚴控本地區(qū)市售鮮肉食品的衛(wèi)生與安全，減少食源性沙門氏菌對人類的危害，保障人們的身體健康與生命安全。