培養(yǎng)液勻漿人參發(fā)根抗氧化、抗黑色素瘤作用

王 璐，郜玉鋼*，郭 陽，劉 楊，陳 思，臧 埔*，何忠梅，趙 巖，張連學(xué)

癌癥嚴(yán)重威脅人類健康，每3 例確診癌癥病例中就有1 例是皮膚癌，全世界每年發(fā)生200多萬例皮膚癌病例，其中惡性黑色素瘤的致死率極高[1-2]。紫外線的輻射是皮膚癌發(fā)生的重要因素之一[3]。隨著臭氧層的破壞，越來越多的紫外線到達(dá)地面，研究表明人體長期暴露在紫外光，尤其是中波紫外線下，會引起皮膚衰老、DNA損傷、光老化甚至癌變[4]。人參皂苷可通過抑制自由基的生成，減少氧化損傷[5]，達(dá)到抗氧化、抗紫外線、抗腫瘤等作用[6]。但人參及其提取物中的重金屬、農(nóng)藥和溶劑殘留等會帶來安全風(fēng)險[7]，人參生長過程緩慢且大面積占用森林土地，為解決伐林栽參、老參地問題，科研人員以人參莖葉為外植體誘導(dǎo)出人參發(fā)根，工廠化生產(chǎn)人參皂苷[8]。目前人參發(fā)根研究多集中于發(fā)根誘導(dǎo)、培養(yǎng)條件優(yōu)化、生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物[9]，鮮見人參發(fā)根對黑色素瘤的作用研究。本實驗選擇富含人參皂苷成分、而無農(nóng)藥、無重金屬、質(zhì)量穩(wěn)定的生物反應(yīng)器人參發(fā)狀根及其培養(yǎng)液為原料[10]，對其進(jìn)行抗氧化、抗黑色素瘤功效評價，以期為黑色素瘤的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人參發(fā)根及其培養(yǎng)液由本實驗室采用1/2 MS液體培養(yǎng)基，在25 ℃、110 r/min的恒溫?fù)u床中繼代培養(yǎng)30 d所得。人參（Panax ginseng C. A. Mey.），為吉林撫松4 年生人參。

CuSO4、乙醇 北京化工廠；鄰苯二酚紫 上海源葉生物科技有限公司；抗壞血酸、焦兒茶酚 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；總抗氧化能力檢測試劑盒、細(xì)胞周期試劑盒 碧云天生物技術(shù)公司；人黑色素瘤細(xì)胞A375 北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶 美國GE公司；胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司；細(xì)胞凋亡試劑盒 美國BD公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-2010A高效液相色譜儀（配有LC-2010A型液相色譜泵、LC-2010A型自動進(jìn)樣器、CLASS-VP色譜工作站） 日本島津公司；Infinite Pro 200全波長酶標(biāo)儀瑞士TECAN公司；HHS-6s電子恒溫水浴鍋 余姚市上通溫控儀表廠；101A-2E烘箱 上海實驗儀器廠有限公司；GXZ智光照培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；Guava?easyCyte流式細(xì)胞儀 德國默克密理博公司；E000327 CO2培養(yǎng)箱 青島Haier公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及樣品溶液的制備

于150 mL發(fā)根培養(yǎng)瓶中加入50 mL pH 6.0的1/2 MS液體培養(yǎng)基，每瓶接種1 g鮮人參發(fā)根，30 d繼代培養(yǎng)1 次，第30天取鮮人參發(fā)根10 g與培養(yǎng)液以1∶6（m/V）勻漿，于烘箱中60 ℃烘至質(zhì)量恒定，待降至室溫，置于－20 ℃儲存?zhèn)溆?，培養(yǎng)液勻漿人參發(fā)根用FG表示。

精確稱取FG粉、人參粉0.5 g于10 mL離心管中，加入5 mL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液超聲108 min，離心取上清液，稀釋至系列梯度質(zhì)量濃度，做抗氧化能力測定，其余揮干乙醇，干燥至質(zhì)量恒定，密封冷藏以備后續(xù)實驗用。

人黑色素瘤細(xì)胞A375用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，液氮中凍存。

醇提的FG、人參（用RS表示）及達(dá)卡巴嗪（用DK表示）分別用DMEM培養(yǎng)基溶解后稀釋成100、200、400、600、800 μg/mL的含藥培養(yǎng)液。

1.3.2 人參皂苷含量的測定

取FG粉0.5 g加入5.0 mL色譜甲醇溶液，室溫下超聲提取30 min，4 000 r/min離心20 min，取上清液過0.45 μm濾膜備用[11]。每個樣品設(shè)3 個平行。色譜條件參照本實驗室建立的同時測定20 種人參皂苷的方法[12]。

1.3.3 Cu2+螯合能力的測定

取160 μL 0.1 mg/mL CuSO4溶液，加入40 μL 4 mmol/L的鄰苯二酚紫溶液，再加入80 μL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液后混勻，室溫反應(yīng)20 min后于632 nm波長處測吸光度。以同質(zhì)量濃度VC作為陽性對照，實驗重復(fù)3 次[13-14]。螯合率根據(jù)下式計算。

式中：Ai為加入樣品的反應(yīng)液吸光度；A0為用醇替代樣品的反應(yīng)液吸光度；A1為樣品對照組的吸光度。

1.3.4 PPO活力的測定

準(zhǔn)確量取100 μL pH 7.4磷酸鹽緩沖液，向其中緩慢加入50 μL 2 mol/L的焦兒茶酚溶液，混勻后，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱預(yù)熱15 min后加入50 μL各個質(zhì)量濃度的樣品、對照品溶液，于525 nm波長處分別測定第0、0.5、1.0分鐘時的吸光度。定義1 min內(nèi)1 g人參發(fā)根樣品使A525nm改變0.01為1 個多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活力單位[15]。

1.3.5 總抗氧化能力的測定

根據(jù)總抗氧化能力檢測試劑盒建立FeSO4·7H2O標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出線性回歸方程。用試劑盒對人參發(fā)根的總抗氧化能力在593 nm波長處進(jìn)行測定，OD值代入回歸方程求出FG的抗氧化能力[16-17]。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測黑色素瘤細(xì)胞A375凋亡

根據(jù)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書，將對數(shù)期的A375細(xì)胞以1×106個/mL，接種于6 孔板內(nèi)加藥孵育24 h收集細(xì)胞，加V-FITC孵育15 min取1×104個細(xì)胞用配有GuavaSoft 3.1系統(tǒng)的流式細(xì)胞儀對每個樣品進(jìn)行分析。

1.3.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布

根據(jù)細(xì)胞周期試劑盒說明書，將對數(shù)期的A375細(xì)胞以1×106個/mL，接種于6 孔板內(nèi)加藥孵育24 h收集細(xì)胞，于預(yù)冷體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液中4 ℃固定過夜。PI染色后，重懸細(xì)胞，37 ℃避光溫浴30 min。用配有GuavaSoft 3.1系統(tǒng)的流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長488 nm波長處檢測紅色熒光，同時檢測光散射情況。對細(xì)胞DNA含量和光散射進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

用SPSS 17.0軟件進(jìn)行ANOVA單因素方差分析，數(shù)據(jù)用 ±s表示，并進(jìn)行Duncans’差異顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 FG中人參皂苷含量

表1 FG中20 種人參皂苷單體含量Table 1 Contents of 20 ginsenosides in ginseng hairy root culture

圖1 FG高效液相色譜圖Fig. 1 High performance liquid chromatogram of ginsenosides in ginseng hairy root culture

如表1、圖1所示，采用20 種皂苷含量測定方法對FG進(jìn)行測定，共檢測出13 種人參皂苷。Rg1、Re含量較高，皂苷含量加和值為（0.160 7±0.011 0）%。

2.2 Cu2+螯合能力

圖2 FG及VC對Cu2＋螯合率Fig. 2 Cu2+-chelating rates of VC and ginseng hairy root culture

如圖2所示，VC的Cu2+螯合率先增加后緩慢降低，F(xiàn)G對Cu2+的螯合率隨著質(zhì)量濃度的增大顯著增加（P＜0.05），其中40 mg/mL時螯合率已達(dá)到50.73%，100 mg/mL時螯合率為66.51%，顯著高于FG的其他組（P＜0.05），雖低于同質(zhì)量濃度的VC，但差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 FG的PPO活力

圖3 多酚氧化酶活力Fig. 3 Polyphenol oxidase activity in the presence of VC or ginseng hairy root culture

如圖3所示，在PPO活力測定中VC與FG呈現(xiàn)相同趨勢，酶活力隨著質(zhì)量濃度的增加逐步提高，呈現(xiàn)較好的量效關(guān)系。在5、10、20 mg/mL時FG活力均顯著低于同質(zhì)量濃度VC（P＜0.05），40、60、80、100 mg/mL時FG的PPO活力分別為2.19、3.36、4.66、5.16 U/g，低于同質(zhì)量濃度VC，但差異不顯著（P＞0.05）。

2.4 FG的總抗氧化能力

圖4 FG總抗氧化能力Fig. 4 Total antioxidant capacity of ginseng hairy root culture

參照總抗氧化能力試劑盒說明書建立FeSO4·7H2O標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程：y＝3.169 8x－0.284 97，吸光度在0.13～0.55范圍內(nèi)線性關(guān)系良好R2＝0.997 2。如圖4所示，在發(fā)根的總抗氧化能力測定中，隨著質(zhì)量濃度的增大抗氧化能力逐漸增加，除10 mg/mL與20 mg/mL總抗氧化能力差異不顯著外，其余各組間均差異顯著（P＜0.05），當(dāng)質(zhì)量濃度升高到100 mg/mL時，F(xiàn)G的總抗氧化能力高達(dá)0.877 4 mmol FeSO4/g，顯著高于其他組（P＜0.05）。

2.5 FG對黑色素瘤細(xì)胞A375凋亡的影響

圖5 FG對黑色素瘤細(xì)胞A375凋亡圖Fig. 5 Flow cytometric analysis of apoptosis in A375 cells exposed to ginseng hairy root culture

表2 FG對黑色素瘤細(xì)胞A375凋亡的影響Table 2 Effect of ginseng hairy root culture on apoptosis in A375 cells

由圖5、表2可知，不同質(zhì)量濃度（200、400、600 μg/mL）的FG、RS、DK對A375細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，且隨藥物質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞的抑制率明顯增加，呈劑量依賴性。200 μg/mL時FG組的早期凋亡率顯著高于RS組、DK組（P＜0.05）；400 μg/mL時FG組早期凋亡與DK組差異不顯著，晚期凋亡與RS差異不顯著（P＞0.05）；600 μg/mL FG組晚期凋亡率顯著高于RS組、DK組（P＜0.05），RS組與DK組早期凋亡顯著高于FG（P＜0.05）。

2.6 FG對A375細(xì)胞周期的影響

表3 FG對A375細(xì)胞周期的影響Table 3 Effect of ginseng hairy root culture on cell cycle in A375 cells

圖6 FG對A375細(xì)胞周期圖Fig. 6 Flow cytometric analysis of cell cycle in A375 cells

如表3、圖6所示，200 μg/mL時FG組、DK組與對照組相比G0/G1期細(xì)胞比例降低，G2/M期細(xì)胞比例增加，說明200 μg/mL時FG、DK可將細(xì)胞阻滯在G2/M期。400 μg/mL時與對照組相比，F(xiàn)G組S期細(xì)胞比例顯著增加，F(xiàn)G、RS、DK組G2/M期細(xì)胞比例顯著增加，說明400 μg/mL時FG可將細(xì)胞阻滯于S、G2/M期，RS、DK可將細(xì)胞阻滯于G2/M。600 μg/mL時FG、RS、DK組與對照組相比G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低，S、G2/M期細(xì)胞比例顯著增加，S期DK細(xì)胞比例最高，G2/M期RS細(xì)胞比例最高，F(xiàn)G的S、G2/M期細(xì)胞比例為29.82%、28.70%，顯著高于對照組。說明600 μg/mL時FG、RS、DK可將A375細(xì)胞阻滯于S期、G2/M期，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

3 討 論

人體長期暴露在紫外光下，尤其是中波紫外線，會引起皮膚過敏、衰老、DNA損傷、光老化甚至癌變。黑色素瘤是一種侵襲性皮膚癌，傳統(tǒng)療法對其無效[18]。主要由紫外線輻射使皮膚層產(chǎn)生黑色素，黑色素在合成過程中產(chǎn)生的親氧化狀態(tài)使其易受到氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激水平升高導(dǎo)致細(xì)胞的生長、分裂失控，入侵臨近的機(jī)體組織而成癌[19]。氧化應(yīng)激能誘導(dǎo)DNA、蛋白質(zhì)、線粒體等細(xì)胞成分損傷并影響細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[20-21]。線粒體為細(xì)胞中水平最高的抗氧化劑，在維護(hù)細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)中起著重要的作用[22]。研究報道黑色素瘤的發(fā)生都伴有抗氧化酶活性降低或其表達(dá)下調(diào)、氧化與抗氧化作用失衡[23-24]。抗氧化酶可保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷，抗氧化酶活性和表達(dá)的失調(diào)與黑色素瘤發(fā)生密切相關(guān)，是黑色素瘤發(fā)生發(fā)展的重要影響因素[25-26]。人參[27-28]、人參發(fā)根[29]抗氧化活性顯著。而關(guān)于FG的抗氧化能力未知，因此選用Cu2+、PPO、總抗氧化能力3 種方法對FG的抗氧化能力進(jìn)行測定。由實驗結(jié)果可知隨著質(zhì)量濃度的增大，F(xiàn)G的Cu2+螯合率逐漸接近VC，在100 mg/mL時FG的Cu2+螯合率達(dá)到66.5%與VC差異不顯著；FG與VC有相同的酶活力清除趨勢，大于40 mg/mL時兩者差異不顯著；FG的總抗氧化能力在100 mg/mL時達(dá)到0.877 4 mmol FeSO4/g。

研究發(fā)現(xiàn)，中草藥提取物產(chǎn)生抗腫瘤作用的主要機(jī)制是阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞周期阻滯能夠抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[30]。主要抑制細(xì)胞周期蛋白、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶及其抑制因子等3大類與細(xì)胞周期有關(guān)的分子的表達(dá)對細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控，從而誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯并抑制腫瘤細(xì)胞增殖[31]。主要表現(xiàn)為藥物作用于細(xì)胞干預(yù)DNA復(fù)制或者造成DNA損傷及有絲分裂所必需的蛋白質(zhì)合成，細(xì)胞周期進(jìn)程就會發(fā)生停滯，若不能及時進(jìn)行修復(fù)，就會抑制細(xì)胞增殖，甚至誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生凋亡[32]。與對照組相比，F(xiàn)G組、RS組、DK組均出現(xiàn)明顯的凋亡細(xì)胞，F(xiàn)G組較RS組、DK組晚期凋亡率高，這種作用可能是將皮膚癌細(xì)胞周期阻滯在S、G2/M期實現(xiàn)的。人參發(fā)根與人參具有相似的化學(xué)成分[33-34]，可通過減少氧化損傷、阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程、誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞凋亡產(chǎn)生抗皮膚癌作用，其具體促凋亡機(jī)制有待進(jìn)一步研究。綜上，人參發(fā)根具有抗氧化、抗黑色素瘤作用。本研究為人參發(fā)根產(chǎn)品開發(fā)提供了理論依據(jù)。