大豆異黃酮誘導(dǎo)小鼠肝癌移植瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制

田 笑，金梅花，劉莉園，何 鑫，全吉淑*

大豆異黃酮是大豆中分離的重要活性成分，具有典型異黃酮結(jié)構(gòu)。自從Walz[1]首次從大豆分離出染料木苷以來，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)12 種不同結(jié)構(gòu)的大豆異黃酮，分別為游離型大豆異黃酮3 種（7,4’-二羥異黃酮——大豆苷元、7,4’-二羥-6-甲氧異黃酮——大豆黃素、5,7,4’-三羥異黃酮——染料木素）和對(duì)應(yīng)的葡萄糖苷及其衍生物9 種[2]。研究表明，大豆異黃酮具有抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)心血管等多種藥理活性[2-6]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，大豆異黃酮的攝取與乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌及前列腺癌等多種癌癥的發(fā)病率呈負(fù)相關(guān)性[7-10]。動(dòng)物及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也顯示，大豆異黃酮具有明顯的抗腫瘤作用，特別是對(duì)激素相關(guān)性腫瘤，如乳腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌[11-13]。其抗癌機(jī)制可能包括類雌激素作用及抗激素作用、抑制腫瘤血管生成的作用、阻滯細(xì)胞周期等多個(gè)方面[14-16]。盡管流行病學(xué)和動(dòng)物、細(xì)胞模型的研究結(jié)果明確了其抗腫瘤作用，但其對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用機(jī)理和靶點(diǎn)尚不清楚。本課題組近年來的研究表明，大豆異黃酮對(duì)家兔鱗癌移植瘤和小鼠肝癌移植瘤均具有促細(xì)胞凋亡作用[5-6]。眾所周知，細(xì)胞凋亡存在復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，有許多蛋白參與其調(diào)控過程，如死亡受體、胞漿信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）家族和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）家族等[7]。本實(shí)驗(yàn)擬通過小鼠H22肝癌皮下移植瘤模型，探討大豆異黃酮對(duì)H22移植瘤細(xì)胞的促凋亡作用機(jī)制，旨在為大豆異黃酮抑制腫瘤研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

昆明小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，由延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

小鼠H22肝癌細(xì)胞株由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院韓春姬教授惠贈(zèng)。

大豆異黃酮（純度≥80%）購自華北制藥集團(tuán)有限責(zé)任公司，含大豆苷45.9%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）、黃豆苷21.0%、染料木苷13.4%、大豆苷元0.96%、黃豆苷元0.05%和染料木素0.02%。

5-氟尿嘧啶（5-fuorouracil，5-Fu） 上海旭東海普藥業(yè)有限公司；細(xì)胞凋亡-DNA ladder抽提試劑盒 碧云天生物技術(shù)公司；小鼠Caspase-3（Casp-3）單克隆抗體、兔Caspase-8（Casp-8）單克隆抗體、小鼠Caspase-9（Casp-9）單克隆抗體、兔Bcl-2多克隆抗體、兔細(xì)胞色素c（cytochrome c，Cyt c）單克隆抗體、兔細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis inducing factor，AIF）單克隆抗體、小鼠p53單克隆抗體、兔Survivin單克隆抗體、兔信號(hào)傳導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子（signal transducer and activator of transcription，STAT）3單克隆抗體、兔p-STAT3單克隆抗體 美國賽信通公司；小鼠Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）多克隆抗體 美國艾博抗公司；小鼠β-肌動(dòng)蛋白單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗小鼠免疫球蛋白G、羊抗兔免疫球蛋白G美國西格瑪奧德里奇公司。

1.2 儀器與設(shè)備

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國艾本德公司；平板電泳槽北京六一生物科技有限公司；小型垂直電泳槽、小型轉(zhuǎn)印槽 美國伯樂公司；化學(xué)發(fā)光成像儀 上海培清科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 建立H22小鼠肝癌移植瘤模型及分組處理

常規(guī)進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)和腹腔傳代。取第2代腹水，將細(xì)胞密度調(diào)至1×107個(gè)/mL，接種到小鼠腋下[5]。第2天，將30 只小鼠分為模型組（陰性對(duì)照組）、大豆異黃酮組和5-Fu組（陽性對(duì)照組）。大豆異黃酮組小鼠每日灌胃100 mg/kg大豆異黃酮（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%羧甲基纖維素鈉的生理鹽水溶解），共10 次；5-Fu組小鼠隔日腹腔注射25 mg/kg 5-Fu，共5 次；模型組小鼠灌胃等體積含0.5%羧甲基纖維素鈉的生理鹽水。16 h后處死動(dòng)物，迅速取出腫瘤組織，稱瘤質(zhì)量，并根據(jù)下式計(jì)算抑瘤率。

1.3.2 DNA ladder法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡

提取移植瘤細(xì)胞DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡特征性DNA ladder[6]。

1.3.3 蛋白印跡法檢測(cè)移植瘤組織蛋白的表達(dá)

裂解細(xì)胞并提取蛋白，加熱變性。進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉，用相應(yīng)一抗孵育，洗膜，二抗孵育。化學(xué)發(fā)光顯色法顯色，并進(jìn)行灰度分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以 ±s表示，應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆異黃酮對(duì)荷瘤小鼠瘤質(zhì)量和抑瘤率的影響

模型組、大豆異黃酮組和5-Fu組小鼠瘤質(zhì)量分別為2.00、1.30、0.83 g；抑瘤率計(jì)算結(jié)果顯示，大豆異黃酮和5-Fu對(duì)荷瘤小鼠的抑瘤率分別為36%和59%。與模型組比較，大豆異黃酮組和5-Fu組小鼠瘤質(zhì)量減輕（P＜0.05）；與5-Fu組比較，大豆異黃酮組瘤質(zhì)量增加（P＜0.05）。提示大豆異黃酮和5-Fu明顯抑制荷瘤小鼠肝癌移植瘤的生長，但大豆異黃酮的抑瘤作用低于5-Fu。

2.2 移植瘤組織DNA ladder檢測(cè)

圖1 移植瘤組織DNA ladder檢測(cè)結(jié)果Fig. 1 DNA ladder observation of transplanted tumor tissue

細(xì)胞凋亡時(shí)DNA在核小體間斷裂形成一些DNA ladder，其形成是判斷細(xì)胞凋亡的重要標(biāo)準(zhǔn)[6]。如圖1所示，模型組小鼠移植瘤細(xì)胞有少量凋亡特征性DNA ladder存在。與模型組比較，大豆異黃酮組小鼠移植瘤細(xì)胞凋亡特征性DNA ladder增多（P＜0.05）。5-Fu組小鼠移植瘤細(xì)胞DNA損傷較為嚴(yán)重，DNA ladder少量存在，更多的是細(xì)胞壞死引起的DNA無規(guī)則斷裂。

2.3 移植瘤組織Casp-3、Casp-8和Casp-9活性片段的表達(dá)

Caspase是一組胞漿蛋白水解酶，與真核細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，在正常細(xì)胞內(nèi)以無活性的酶原狀態(tài)存在，可將部分肽段切除后激活成有活性的片段，其中Casp-3為凋亡執(zhí)行者，可直接水解靶蛋白從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[17-18]。

圖2 移植瘤組織Casp-3、Casp-8和Casp-9活性片段表達(dá)Fig. 2 Expression of active caspase-3, caspase-8 and caspase-9 fragments in transplanted tumor tissue

由圖2可知，與模型組比較，大豆異黃酮組和5-Fu組小鼠移植瘤組織Casp-3、Casp-8和Casp-9活性片段增多（P＜0.05）；與5-Fu組比較，大豆異黃酮組小鼠移植瘤組織Casp-3、Casp-8和Casp-9活性片段增多（P＜0.05）。

2.4 移植瘤組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)

圖3 移植瘤組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)Fig. 3 Expression of Bcl-2 and Bax proteins in transplanted tumor tissue

許多蛋白參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控過程，其中Bcl-2蛋白家族是細(xì)胞凋亡研究中最受重視的癌蛋白之一，其中，Bax促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡[19-21]。由圖3可知，與模型組比較，大豆異黃酮組小鼠移植瘤細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），5-Fu組小鼠移植瘤細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)有降低趨勢(shì)，但差異無顯著性（P＞0.05）；與5-Fu組比較，大豆異黃酮組小鼠移植瘤組織Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，大豆異黃酮組和5-Fu組小鼠移植瘤細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05），且兩組小鼠移植瘤組織Bax/Bcl-2比值均顯著升高（P＜0.05）。

2.5 移植瘤組織胞漿Cyt c和AIF蛋白表達(dá)

細(xì)胞凋亡時(shí)，線粒體內(nèi)Cyt c可釋放到胞漿后導(dǎo)致依賴Caspase的凋亡途徑，AIF則為不依賴Caspase的凋亡效應(yīng)分子；而Bcl-2能夠阻止Cyt c和AIF從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生[19-21]。

圖4 移植瘤組織胞漿Cyt c和AIF蛋白表達(dá)Fig. 4 Expression of cytoplasmic Cyt c and AIF proteins in transplanted tumor tissue

由圖4可知，與模型組比較，大豆異黃酮組和5-Fu組小鼠移植瘤組織胞漿Cyt c和AIF蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05）；與5-Fu組比較，大豆異黃酮組小鼠移植瘤組織胞漿Cyt c和AIF蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。

2.6 移植瘤組織p53、Survivin蛋白表達(dá)和STAT3活化

Bcl-2家族也受多種信號(hào)途徑的調(diào)控，其中p53和Survivin是研究廣泛的途徑之一，STAT3也是近年來研究較多的一條胞內(nèi)信號(hào)通路[22-23]。

圖5 移植瘤組織p53、Survivin蛋白表達(dá)和STAT3活化Fig. 5 Expression of p53 and survivin proteins, and STAT3 activation in transplanted tumor tissue

由圖5可知，與模型組比較，大豆異黃酮組小鼠移植瘤組織p53蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），STAT3活化和Survivin蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與5-Fu組比較，大豆異黃酮組小鼠移植瘤組織STAT3活化和Survivin蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。

3 討 論

小鼠H22肝癌移植瘤模型是篩選抗癌化療藥物常用的腫瘤模型[24]。該小鼠移植瘤成瘤率高，腫瘤生長緩慢、穩(wěn)定，肺轉(zhuǎn)移少，是理想的腫瘤模型[25]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大豆異黃酮抑制小鼠H22移植瘤生長，抑瘤率大于30%，雖然其抑癌作用低于5-Fu，但符合抗腫瘤藥物的要求[26]。

細(xì)胞核染色質(zhì)DNA斷裂成180～200 bp或者其多聚體片段是細(xì)胞凋亡的生化特征[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，大豆異黃酮增加小鼠移植瘤細(xì)胞凋亡特征性結(jié)構(gòu)——DNA ladder的形成，同時(shí)上調(diào)小鼠移植瘤組織Casp-3、Casp-38和Casp-39活性片段的形成，提示大豆異黃酮可促進(jìn)H22小鼠肝癌移植瘤細(xì)胞凋亡。這與本課題組前期研究[5]相一致。

眾所周知，細(xì)胞凋亡可通過線粒體途徑、死亡受體途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑實(shí)現(xiàn)[18]。其中，線粒體途徑是凋亡的主要途徑，又分為依賴Caspase和不依賴Caspase的凋亡途徑[18]。Caspase依賴性凋亡主要為線粒體受損，促使Cyt c釋放到胞漿中，啟動(dòng)Caspase激活，引起細(xì)胞凋亡[18]。而AIF是一種不依賴Caspase的凋亡效應(yīng)分子，細(xì)胞受到凋亡刺激后，AIF成熟并從線粒體釋放到胞漿，繼而轉(zhuǎn)位到核內(nèi)作用于DNA，使其發(fā)生片段化，引起不依賴Caspase的凋亡途徑[19-21]。線粒體凋亡途徑激活中，Bcl-2家族成員起重要調(diào)節(jié)作用。其中，Bcl-2為抗凋亡因子，Bax為促凋亡因子，可拮抗Bcl-2的抗凋亡作用，兩者的比值決定細(xì)胞的存活或死亡[19-21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大豆異黃酮上調(diào)小鼠移植瘤組織胞漿Cyt c和AIF蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，上調(diào)Bax蛋白表達(dá)，升高Bax/Bcl-2比值。提示大豆異黃酮促細(xì)胞凋亡作用至少部分是與Bcl-2家族成員有關(guān)。

Bcl-2家族蛋白表達(dá)受多種信號(hào)途徑的調(diào)控，其中p53是研究較廣泛的途徑之一，而Bax是第一個(gè)被鑒定為受其調(diào)控的Bcl-2家族成員[22]。JAK2/STAT3途徑也是近年來研究較多的一條胞內(nèi)信號(hào)通路，涉及細(xì)胞增殖、凋亡、分化及炎癥發(fā)生等過程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[22-23]。研究表明，STAT3可通過上調(diào)抗凋亡因子Bcl-2、Bcl-xl以及凋亡抑制因子Survivin的表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡[27-28]。也有報(bào)道稱Survivin可受p53調(diào)控，二者可能共屬于相同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中[29-30]。本研究結(jié)果表明，大豆異黃酮上調(diào)p53蛋白表達(dá)，下調(diào)STAT3活化和Survivin蛋白表達(dá)，提示其促凋亡機(jī)制可能與STAT3和p53有關(guān)。

綜上所述，大豆異黃酮可誘導(dǎo)小鼠H22移植瘤細(xì)胞凋亡，其促細(xì)胞凋亡作用可能與p53和STAT3介導(dǎo)的凋亡途徑有關(guān)。