基于魚鱗貯藏方式改善鳙魚魚鱗明膠的功能特性

沙小梅，涂宗財,,*，黃 濤，胡姿姿，王 輝，張 露，李 鑫，王振興

鳙魚（Hypophthalmichthys nobilis）是一種產(chǎn)自亞洲的淡水魚，廣泛分布于湖泊和河流中。鳙魚已經(jīng)被引入歐洲、南美洲和北美洲的70多個國家[1]。在中國，鳙魚是四大家魚之一，其他3 種為青魚（Mylopharyngodon piceus）、鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）和草魚（Ctenopharyngodon idella）[2]。據(jù)報道，早在2010年，我國鯉科魚類年產(chǎn)量已達(dá)到1 500萬 t[3]。據(jù)中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒，2015年我國鳙魚養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到335.944萬 t。

魚鱗是魚制品加工過程中的主要廢棄物之一，其富含膠原蛋白，是一種良好的明膠原料[4]。近些年來，有關(guān)魚鱗明膠的研究漸漸增加，主要集中在魚鱗預(yù)處理[5]、制備過程[6]、明膠改性[7]等。Karim等[8]的報道指出，原料的貯藏方式會對明膠的功能性質(zhì)產(chǎn)生很大影響。熱風(fēng)干燥作為一種食品保存手段，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)。工業(yè)上的烘干機(jī)通常是采用熱風(fēng)或者直接將燃燒氣體作為干燥媒介[9]。太陽曬干是一種傳統(tǒng)且低成本的脫水方式，這種利用太陽對物質(zhì)進(jìn)行干燥的方式在當(dāng)代仍被廣泛使用[10]。眾所周知，一般情況下，低溫能有效延長食品的貯藏期，冰箱貯藏就是一個日常生活中用于食物保藏的典型方式。

因此，本實(shí)驗(yàn)選取熱風(fēng)干燥、太陽曬干和低溫保藏方式處理魚鱗，研究其對制備的魚鱗明膠功能性質(zhì)（凝膠強(qiáng)度、乳化性、起泡性）的影響，探尋能夠提高鳙魚魚鱗明膠功能性質(zhì)的原料貯藏方式。此外，采用傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectra，F(xiàn)TIR）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）和掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）探究魚鱗貯藏方式對明膠結(jié)構(gòu)特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鳙魚魚鱗為市售。

蛋白分子質(zhì)量Marker 美國Thermo Scientific公司；KBr（光譜級） 上海晶純實(shí)業(yè)有限公司；其他均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Nicolet 5700 FTIR儀 美國Thermo公司；環(huán)境SEM 德國FEI Deutschland GmbH公司；CT3質(zhì)構(gòu)分析儀 美國Brookfield公司；T25分散機(jī) 德國IKA公司；T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 魚鱗的貯藏

將新鮮魚鱗清洗3 遍以去除雜質(zhì)，再等分成5 份。第1份魚鱗直接用于明膠的制備，作為空白組；第2份魚鱗在約30 ℃下日光曬約48 h，至水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于10%，然后在室溫（約25 ℃）下貯藏1 個月；第3份魚鱗置于4 ℃貯藏1 個月；第4份魚鱗置于－20 ℃貯藏1 個月；第5份魚鱗在60 ℃烘干至水質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于10%，然后在室溫（約25 ℃）下貯藏1 個月。

1.3.2 魚鱗明膠的提取

5 份魚鱗分別置于組織搗碎機(jī)中搗碎5 min，以去除魚鱗表面的銀白色物質(zhì)。接下來對魚鱗進(jìn)行脫鈣處理，脫鈣工藝如下：鹽酸濃度0.5 mol/L、料液比1∶25（m/V）、脫鈣時間1 h。脫鈣后，進(jìn)一步清洗魚鱗以去除殘存的酸液，以用于下一步的魚鱗明膠提取?；谡n題組前期研究[11]并進(jìn)行適當(dāng)?shù)男薷模_定魚鱗明膠的制備工藝如下：濕魚鱗和去離子水1∶3（m/V）、加熱溫度80 ℃、制備時間2 h。過濾去除魚鱗殘渣，將濾液置于60 ℃的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，將濾液體積蒸發(fā)至原體積的1/3。凍干濃縮后的魚鱗明膠，備用。測定不同方式貯藏魚鱗后制備得到的明膠組成。結(jié)果顯示，所有明膠樣品都具有高蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)（90.87%～92.53%）、低水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（4.89%～6.43%）和低灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.39%～0.94%）。

1.3.3 魚鱗明膠的結(jié)構(gòu)特性測定

SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)方法[12]如下：質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%濃縮膠和質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.5%分離膠。制備5 mg/mL的魚鱗明膠樣品，在95 ℃加熱5 min，再5 000×g離心10 min，取10 μL上清液上樣。

FTIR光譜測定方法[13]如下：將干燥的明膠樣品和光譜級的KBr粉末混合均勻，并壓成片狀。魚鱗明膠的FTIR光譜圖采用Nicolet 5700 FTIR儀在波數(shù)范圍400～4 000 cm－1采集，獲得的數(shù)據(jù)繪制成以吸光度為y軸和以波數(shù)為x軸的圖譜。

SEM的測定參考Chen Jun等[14]的方法。將10 mg/mL的魚鱗明膠溶液凍干，置于樣品臺的導(dǎo)電膠上。采用環(huán)境SEM在低真空模式下放大1 000 倍拍攝魚鱗明膠的微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.4 魚鱗明膠的功能性質(zhì)測定

魚鱗明膠的凝膠強(qiáng)度測定方法[7]如下：在55 ℃水浴鍋中利用去離子水溶解魚鱗明膠制備成66.7 mg/mL溶液，在10 ℃下冷卻16～18 h。采用質(zhì)構(gòu)分析儀以直徑1.27 cm的平底圓柱形探頭測定魚鱗明膠的凝膠強(qiáng)度，測試速率為1 mm/s。當(dāng)魚鱗明膠樣品被擠壓4 mm時產(chǎn)生的最大受力（g）即為凝膠強(qiáng)度。樣品規(guī)格：直徑33 mm，高度22 mm。

魚鱗明膠的乳化活性根據(jù)Nagarajan等[15]的方法進(jìn)行適當(dāng)修改，9 mL魚鱗明膠溶液（1 mg/mL）和3 mL大豆油混合，在T25分散機(jī)中9 500 r/min下分散1 min。立即從燒杯底部取100 μL乳濁液，加入5 mL 1 mg/mL的SDS溶液，混勻10 s后，立即采用紫外-可見分光光度計測定其在波長500 nm處的吸光度（A0），乳化活性的計算見式（1）。

式中：DF表示為稀釋系數(shù)（50）；ρ表示蛋白質(zhì)量濃度（1 000 g/m3）；φ表示油占乳濁液的比例（0.25）；I表示比色皿的寬度（0.01 m）。

魚鱗明膠起泡能力的測定參考Shyni等[16]的方法，并略作修改。運(yùn)用T25分散機(jī)以13 500 r/min分散20 mL 2 mg/mL魚鱗明膠溶液2 min，再將起泡后的溶液倒入50 mL的量筒中，立即記錄總的樣品體積。起泡能力按照式（2）進(jìn)行計算。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均測定3 次平行，結(jié)果取平均值。數(shù)據(jù)通過SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，選取Duncan’s新復(fù)極差法用于顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚鱗明膠的分子質(zhì)量分析

如圖1所示，所有的魚鱗明膠樣品均含有特征性的α鏈（α1和α2）、β鏈（兩條α鏈共價交聯(lián)形成）和高分子質(zhì)量聚合物（high molecule weight polymer，HMWP）。相比新鮮魚鱗和60 ℃熱風(fēng)干燥魚鱗制備得到的明膠，太陽曬干和低溫方式（4 ℃和－20 ℃）貯藏的魚鱗制備得到的明膠具有更多的α鏈、β鏈和HMWP。在所有的魚鱗明膠樣品中，新鮮魚鱗和60 ℃熱風(fēng)干燥魚鱗制備得到的明膠具有更多分子質(zhì)量低于100 Da的多肽。這些結(jié)果與Liu Haiying等[17]的報道一致，其研究結(jié)果表明，相比于25 ℃熱風(fēng)干燥魚鱗和－18 ℃低溫貯藏魚鱗制備的明膠，新鮮魚鱗制備的明膠含有較少的α鏈、β鏈和HMWP。干燥會引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，如脫水和變性[18]。脫水可能會促進(jìn)蛋白質(zhì)間的相互作用，并誘導(dǎo)蛋白質(zhì)發(fā)生聚集，從而影響明膠的形成[19]。因此，太陽曬干后的魚鱗制備得到的明膠具有更多的α鏈、β鏈和HMWP。同樣的，魚鱗在低溫條件下（4 ℃、－20 ℃）因水分蒸發(fā)而引起脫水，因此制備得到的明膠含有較多的高分子質(zhì)量成分。值得說明的是，蛋白質(zhì)在較高干燥溫度下可能會發(fā)生變性，而變性會促使蛋白質(zhì)丟失其特有的結(jié)構(gòu)特征，包括氫鍵和常用于維持蛋白質(zhì)分子穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)。60 ℃熱風(fēng)干燥可能引發(fā)魚鱗膠原蛋白發(fā)生變性，進(jìn)而使得制備的明膠具有更少的α鏈、β鏈和HMWP。

圖1 魚鱗經(jīng)不同方式貯藏后制備的明膠電泳圖Fig. 1 SDS-PAGE profile of fish gelatin extracted from bighead scales under various conditions

2.2 魚鱗明膠的FTIR分析

圖2 魚鱗經(jīng)不同方式貯藏后制備的明膠FTIR圖Fig. 2 FTIR spectra of fish gelatin extracted from bighead scales under various storage conditions

由圖2可知，所有的魚鱗明膠樣品都含有4 個類似的酰胺帶吸收峰：酰胺A帶（3 440～3 300 cm－1）、酰胺I帶（1 600～1 700 cm－1）、酰胺II帶（1 560～1 540 cm－1）、酰胺III帶（1 250～1 230 cm－1），表明所有貯藏魚鱗的方式都不會破壞明膠的功能性基團(tuán)。新鮮、太陽曬干、4 ℃貯藏、－20 ℃貯藏和60 ℃熱風(fēng)干燥的魚鱗制備的明膠酰胺A帶吸收峰波數(shù)分別為3 401.98、3 336.91、3 332.67、3 337.29 cm－1和3 400.41 cm－1。酰胺A帶吸收峰是由N—H伸縮振動引起的。一般而言，單獨(dú)的N—H伸縮振動引起的酰胺A帶吸收峰的波數(shù)在3 400～3 440 cm－1范圍內(nèi)。當(dāng)N—H基團(tuán)涉及氫鍵，酰胺A帶吸收峰將向低波數(shù)移動。氫鍵越強(qiáng)，酰胺A帶吸收峰將向更低波數(shù)移動[12]。在所有樣品中，經(jīng)4 ℃貯藏的魚鱗制備的明膠顯示了最低波數(shù)的酰胺A帶吸收峰，表明含有更強(qiáng)的氫鍵。新鮮和60 ℃熱風(fēng)干燥的魚鱗制備的明膠顯示了最高波數(shù)的酰胺A帶吸收峰，表明含有最弱的氫鍵。類似于SDS-PAGE結(jié)果分析，脫水可能是增強(qiáng)氫鍵、促進(jìn)蛋白質(zhì)間相互作用的重要原因。

新鮮、太陽曬干、4 ℃貯藏、－20 ℃貯藏和60 ℃熱風(fēng)干燥的魚鱗制備的明膠酰胺I帶吸收峰波數(shù)分別為1 658.06、1 658.25、1 654.84、1 654.83 cm－1和1 653.54 cm－1，這與Bhat等[20]報道的商業(yè)魚明膠結(jié)果（～1 655 cm－1）類似。酰胺I帶代表C＝O伸縮振動/COO締合氫鍵的情況[15]，它可能是FTIR中分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的最有力工具。新鮮、太陽曬干、4 ℃貯藏、－20 ℃貯藏和60 ℃熱風(fēng)干燥的魚鱗制備的明膠酰胺II帶吸收峰波數(shù)分別為1 549.45、1 550.40、1 549.23 cm－1和1 549.98 cm－1。酰胺II帶是由N—H基團(tuán)彎曲振動和C≡N基團(tuán)伸縮振動引起[15]。一般認(rèn)為，相比于二級結(jié)構(gòu)改變，水合作用更易引起酰胺II帶變化。新鮮、太陽曬干、4 ℃貯藏、－20 ℃貯藏和60 ℃熱風(fēng)干燥的魚鱗制備的明膠酰胺III帶吸收峰波數(shù)分別為1 242.76、1 240.45、1 241.12、1 240.90 cm－1和1 241.04 cm－1。酰胺III帶由多種因素產(chǎn)生，包括C≡N基團(tuán)伸縮振動、酰胺鍵引起的N—H基團(tuán)變形、甘氨酸和脯氨酸的—CH2基團(tuán)的非平面搖擺振動[23]。

2.3 魚鱗明膠的微觀結(jié)構(gòu)分析

圖3 魚鱗經(jīng)不同方式貯藏后制備的明膠微觀結(jié)構(gòu)圖（×1 000）Fig. 3 SEM micrographs of fish gelatin extracted from bighead scales under various storage conditions (× 1 000)

由圖3可知，不同方式貯藏魚鱗會導(dǎo)致明膠具有不同的微觀結(jié)構(gòu)。新鮮和60 ℃熱風(fēng)干燥的魚鱗制備得到的明膠微觀結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出較大孔洞。太陽曬干、4 ℃和－20 ℃貯藏的魚鱗制備得到的明膠具有致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)外觀。明膠的微觀結(jié)構(gòu)受其組分影響，高含量的α鏈有利于明膠凝膠的形成[15]，β鏈和HMWP也能促進(jìn)凝膠網(wǎng)絡(luò)形成，然而低分子質(zhì)量的明膠碎片將起到相反的影響[24]。因此，相比于新鮮和60 ℃熱風(fēng)干燥魚鱗制備的明膠，太陽曬干、4 ℃貯藏和－20 ℃貯藏魚鱗制備的明膠含有更多的α鏈、β鏈和HMWP，繼而呈現(xiàn)了更好的凝膠狀態(tài)，即更致密的網(wǎng)絡(luò)微觀結(jié)構(gòu)。

2.4 魚鱗明膠的凝膠強(qiáng)度分析

圖4 魚鱗經(jīng)不同方式貯藏后制備的明膠凝膠強(qiáng)度Fig. 4 Gel strength of fish gelatin extracted from bighead scales under various storage conditions

凝膠強(qiáng)度是一項重要的凝膠性能表征指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)測定了不同方式貯藏魚鱗后制備得到的明膠凝膠強(qiáng)度，如圖4所示。新鮮、太陽曬干、4 ℃貯藏、－20 ℃貯藏和60 ℃熱風(fēng)干燥的魚鱗制備的明膠凝膠強(qiáng)度分別為（450.33±12.12）、（488.86±8.40）、（516.91±4.50）、（497.65±22.44）g和（434.25 ±7.01）g。相比于新鮮和60 ℃熱風(fēng)干燥方式，太陽曬干和低溫（4 ℃和－20 ℃）貯藏魚鱗使得明膠具有更強(qiáng)的凝膠強(qiáng)度（P＜0.05）。值得特別指出的是，魚鱗經(jīng)過4 ℃貯藏1 個月，制備得到的明膠凝膠強(qiáng)度比新鮮魚鱗制備的明膠凝膠強(qiáng)度高出66.58 g。在4 ℃的保藏溫度下，魚鱗脫水可能會促進(jìn)其蛋白質(zhì)間的相互作用，進(jìn)而增強(qiáng)其凝膠強(qiáng)度。此外，4 ℃貯藏能較好地防止魚鱗膠原蛋白變性，提高魚鱗明膠的品質(zhì)。在許多情況下，高凝膠強(qiáng)度的明膠是應(yīng)用過程中所需要的。例如，高Bloom值的A型明膠特別適用于生產(chǎn)低脂黃油或人造奶油[8]。因此，將魚鱗貯藏在4 ℃，可能是一種簡單而有前景的改善明膠凝膠強(qiáng)度的方法。

凝膠強(qiáng)度與多種結(jié)構(gòu)特征有關(guān)，其中，包括分子質(zhì)量分布[15]、氫鍵[20]和微觀結(jié)構(gòu)[25]。結(jié)合圖4的凝膠強(qiáng)度和圖1的SDS-PAGE結(jié)果可知，α鏈、β鏈和HMWP是增強(qiáng)魚鱗明膠凝膠強(qiáng)度的重要組分，此外，減少低分子質(zhì)量的組分含量也將提升魚鱗明膠的凝膠強(qiáng)度。以前的許多研究報道也得到了一致的結(jié)果，例如，含有更多α鏈的明膠呈現(xiàn)了更好的功能特性，包括凝膠強(qiáng)度[15,26]；Kaewruang等[27]的研究結(jié)果表明α鏈和β鏈會影響凝膠強(qiáng)度，增加這兩個組分的含量將增強(qiáng)明膠結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性；HMWP與明膠的凝膠強(qiáng)度有著高度的正相關(guān)性[28]；降解的明膠片段與低凝膠強(qiáng)度相關(guān)[29]。

由圖2、4可知，4 ℃貯藏的魚鱗制備的明膠具有最強(qiáng)的凝膠強(qiáng)度和最強(qiáng)的氫鍵（基于FTIR中酰胺A帶的最低波數(shù)）；太陽曬干和－20 ℃貯藏的魚鱗制備的明膠具有中等強(qiáng)度的凝膠強(qiáng)度和氫鍵；新鮮和60 ℃熱風(fēng)干燥的魚鱗制備的明膠具有最低的凝膠強(qiáng)度和最弱的氫鍵（基于FTIR中酰胺A帶的最高波數(shù)）。上述結(jié)果表明，凝膠強(qiáng)度可能和氫鍵強(qiáng)度有關(guān)。不同方式貯藏魚鱗可能會導(dǎo)致明膠具有不同的氫鍵強(qiáng)度，進(jìn)而影響其凝膠強(qiáng)度。

低凝膠強(qiáng)度的魚鱗明膠（新鮮和60 ℃熱風(fēng)干燥魚鱗制備得到的明膠）有著松散的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這說明魚鱗明膠的微觀結(jié)構(gòu)可能在一定程度上反映其凝膠強(qiáng)度。伴隨著致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，魚鱗明膠有更好的能力以抵制外部破壞力，因此顯示出高的凝膠強(qiáng)度。Wangtueai等[30]通過比較狗母魚魚鱗明膠的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，狗母魚魚鱗明膠的微觀結(jié)構(gòu)可能和凝膠強(qiáng)度相關(guān)。Benjakul等[31]指出凝膠物質(zhì)中蛋白質(zhì)分子的排列和連接直接影響黃笛鯛魚皮明膠的凝膠強(qiáng)度。Jongjareonrak等[32]研究表明，谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶處理的明膠具有更高的凝膠強(qiáng)度和更致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

2.5 魚鱗明膠的界面性質(zhì)分析

圖5 魚鱗經(jīng)不同方式貯藏后制備的明膠乳化活性Fig. 5 Emulsifying activity of fish gelatin extracted from bighead scales under various storage conditions

如圖5所示，各種魚鱗貯藏方式顯著改善了明膠的乳化活性，新鮮、太陽曬干、4 ℃貯藏、－20 ℃貯藏和60 ℃熱風(fēng)干燥的魚鱗制備的明膠乳化活性分別為47.26、49.87、54.26、58.56 m2/g和52.29 m2/g。在上述所有的魚鱗貯藏方式中，－20 ℃貯藏是最有效的改善明膠乳化活性的手段。

圖6 魚鱗經(jīng)不同方式貯藏后制備的明膠起泡能力Fig. 6 Foaming ability of fish gelatin extracted from bighead scales under various storage conditions

圖6 為不同方式貯藏后的魚鱗制備的明膠起泡能力，太陽曬干、4 ℃貯藏、－20 ℃貯藏和60 ℃熱風(fēng)干燥的魚鱗制備的明膠起泡能力分別為90.83%、83.33%、95.83%和90.00%，顯著高于新鮮魚鱗制備的明膠起泡能力（71.67%）。其中，－20 ℃貯藏魚鱗的方式提升明膠起泡能力的幅度達(dá)到33.71%。

最低的魚鱗貯藏溫度（－20 ℃）能顯著提高明膠的乳化活性和起泡能力，這也許歸因于冰凍貯藏過程中表面疏水性的改變。在長期的冰凍貯藏過程中，蛋白質(zhì)會經(jīng)歷構(gòu)象的改變，暴露蛋白質(zhì)的部分疏水性區(qū)域[33]。Wang Pei等[21]也指出冰凍能使更多的谷蛋白疏水性基團(tuán)暴露。表面疏水性是改變蛋白質(zhì)乳化特性和起泡特性的重要因素。表面疏水性影響蛋白質(zhì)吸附到油-水界面層的能力，此時，更強(qiáng)的吸附特性將顯示更高的乳化能力[34]。疏水性對蛋白質(zhì)起泡性發(fā)揮作用的原因可能部分源于其快速吸附到空氣-水界面，也可能與疏水性蛋白質(zhì)間的相互作用有關(guān)[35-36]。Moro等[37]的研究結(jié)果亦表明，增加表面疏水性可能是改善起泡能力的決定性因素。

3 結(jié) 論

太陽曬干后室溫貯藏、4 ℃貯藏、－20 ℃貯藏和60 ℃熱風(fēng)干燥后室溫貯藏均不會破壞明膠的特征性結(jié)構(gòu)（所有的魚鱗明膠樣品都含有α鏈、β鏈和HMWP，且具有4 個類似的酰胺帶吸收峰：酰胺A帶、酰胺I帶、酰胺II帶和酰胺III帶）。相比新鮮魚鱗和60 ℃熱風(fēng)干燥魚鱗制備得到的明膠，太陽曬干和低溫方式（4 ℃和－20 ℃）貯藏的魚鱗制備得到的明膠結(jié)構(gòu)特征如下：含有更多的α鏈、β鏈和HMWP；酰胺A帶吸收峰的波數(shù)較低，表明包含更強(qiáng)的氫鍵；呈現(xiàn)更致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)外觀。這些結(jié)構(gòu)特征的變化可能是導(dǎo)致太陽曬干和低溫（4 ℃和－20 ℃）貯藏魚鱗制備得到的明膠呈現(xiàn)更強(qiáng)凝膠強(qiáng)度的主要原因。太陽曬干、4 ℃貯藏、－20 ℃貯藏和60 ℃熱風(fēng)干燥魚鱗均能提升明膠的乳化活性和起泡能力，其中，－20 ℃貯藏魚鱗1 個月對改善明膠乳化活性和起泡能力的效果最佳。