活血通痹湯塌漬療法治療兔膝骨關(guān)節(jié)炎的效果及其機制

唐芳，馬武開，周靜，盧向陽，陳琳英，蘭維婭，李宇，蔣總

(1貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，貴陽550001；2貴陽中醫(yī)學(xué)院)

膝骨關(guān)節(jié)炎是由多種原因引起的以關(guān)節(jié)軟骨退變和骨質(zhì)增生為主要病理變化的一種慢性疾病[1,2]。目前膝骨關(guān)節(jié)炎的病因尚不清楚，可能與軟骨細胞自我吞噬、機械力學(xué)改變、氧化應(yīng)激、內(nèi)部免疫、軟骨過度增生、疼痛等因素有關(guān)[3]。研究顯示，Wnt/β-catenin信號通路是參與關(guān)節(jié)軟骨細胞分化、成熟及凋亡的重要信號通路，在膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生中發(fā)揮重要作用[4～6]。中藥塌漬療法具有溫經(jīng)通絡(luò)、破瘀散結(jié)的功效，加上熱力作用可使藥物成分通過皮膚直接吸收，經(jīng)穴滲透擴散，直達病所，從而發(fā)揮治療作用[7,8]。2016年4月～2017年10月，本研究觀察了活血通痹湯塌漬療法治療兔膝骨關(guān)節(jié)炎的臨床效果，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：健康新西蘭大白兔72只，4～5月齡，體質(zhì)量1.5～2.5 kg，雌雄各半，由貴陽中醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。實驗藥物：活血通痹湯為貴陽中醫(yī)學(xué)院風(fēng)濕免疫科以貴州苗藥為主要組成成分的臨床經(jīng)驗方，藥物組成為透骨香(30 g)、透骨草(30 g)、黑骨藤(30 g)、海桐皮(50 g)、白芷(20 g)、乳香(20 g)、沒藥(20 g)、川芎(30 g)、防風(fēng)(20 g)、紅花(20 g)、當(dāng)歸(20 g)、大血藤(60 g)、白芍(60 g)；雙氯芬酸二乙胺乳膏(扶他林軟膏，永信藥品工業(yè)昆山股份有限公司)。主要試劑：TRIzol總RNA提取試劑購于天根生化科技(北京)有限公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)、ROX plus、DL2000 DNA Marker均購于日本TaKaRa公司，組織蛋白抽提試劑盒、RIPA Lysis Buffer (Strong)、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE loading buffer、Wester blotting ladder pen均購于康為世紀生物科技有限公司。

1.2 動物分組與建模 將72只新西蘭大白兔隨機分為空白組、模型組、扶他林組、42 ℃塌漬組、37 ℃塌漬組、32 ℃塌漬組，每組12只。除空白組外，其余5組均采用關(guān)節(jié)制動法[9]建立兔右側(cè)膝骨關(guān)節(jié)炎模型，方法如下：將兔右側(cè)膝關(guān)節(jié)用管型石膏和小鋁板固定于伸直位，行右側(cè)肢體膝部管型石膏的開窗處理，限制兔關(guān)節(jié)活動，造成膝關(guān)節(jié)壓力異常，形成進行性膝骨關(guān)節(jié)炎，建模時間為4周。建模期間各組均正常飼養(yǎng)。

1.3 治療方法 建模第5周，扶他林組右側(cè)膝關(guān)節(jié)外用扶他林軟膏，每次約10 mg均勻外涂于右側(cè)膝關(guān)節(jié)，并輕輕揉搓至藥物完全吸收，1次/d。42 ℃塌漬組、37 ℃塌漬組、32 ℃塌漬組均采用活血通痹湯塌漬療法治療。方法如下：將活血通痹湯原藥浸泡半小時，加入適量水，放入鍋中煮沸，將藥液轉(zhuǎn)移至恒溫鍋中，42 ℃塌漬組、37 ℃塌漬組、32 ℃塌漬組分別將恒溫鍋內(nèi)藥物維持溫度調(diào)整為42、37、32 ℃；各組取紗布浸泡于不同溫度藥液中，將紗布敷于患膝，每2～4 min更換一次紗布，盡量保持溫度維持不變；三組治療時間均為20 min，1次/d。

1.4 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.4.1 膝關(guān)節(jié)軟骨表面大體情況及軟骨組織病理改變 治療28天采用空氣栓塞法處死各組動物，取出右側(cè)膝關(guān)節(jié)，肉眼大體觀察軟骨表面大體情況。取部分膝關(guān)節(jié)軟骨組織，常規(guī)HE染色后光鏡下觀察軟骨組織病理改變，其余膝關(guān)節(jié)軟骨組織置于-80 ℃冰箱保存待用。

1.4.2 膝關(guān)節(jié)軟骨組織Wnt蛋白(Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a ) mRNA表達 采用real-time PCR法檢測。取-80 ℃保存的膝關(guān)節(jié)軟骨組織約50 μg放入研缽中，充分剪碎后加入液氮反復(fù)研磨，待組織完全成粉末狀。采用TRIzol總RNA提取試劑盒提取總RNA，NanoDrop?ND-2000檢測RNA濃度和純度合格后，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將所有cDNA樣品配置real-time PCR反應(yīng)體系，于real-time PCR儀上進行反應(yīng)。Wnt3a上游引物：5′-ACGACAGCGCCTCGGAGATGG-3′，下游引物：5′-GGTTGGGCTCGCAGAAGTTGG -3′，引物長度150 bp；Wnt5a上游引物：5′-TGCCACTTGTATCAGGACCAC-3′，下游引物：5′-GCTGCCTATCTGCATCACTCT-3′，引物長度150 bp；Wnt7a上游引物：5′-CATCGGCTTCGCCAAGGTCT-3′，下游引物：5′-GCACTCCAGCTTCATGTTCTC-3′，引物長度124 bp；內(nèi)參18srRNA上游引物：5′-TCTGTGATGCCCTTAGATGTCG-3′，下游引物：5′-AATGGGGTTCAACGGGTTAC-3′，引物長度104 bp。采用2-ΔΔCt法計算Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a mRNA相對表達量。

1.4.3 膝關(guān)節(jié)軟骨組織連環(huán)素蛋白(β-catenin)、糖原合酶激酶3β(GSK-3β)蛋白表達 采用Western blotting法檢測。取-80 ℃保存的膝關(guān)節(jié)軟骨組織約50 μg，充分研磨后提取軟骨細胞蛋白。BCA定量試劑盒檢測提取的蛋白濃度，根據(jù)目的蛋白分子量大小，選擇10%的分離膠濃度。樣品加入上樣緩沖液后100 ℃加熱3 min，每孔上樣20 μL總蛋白進行SDS-PAGE，電泳后半干轉(zhuǎn)蛋白至裁剪好的電轉(zhuǎn)膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束，取下PVDF膜，放入TBST中，搖床洗膜10 min/次，共2次。將PVDF膜浸泡于封閉液中，搖床封閉2 h。加入β-catenin、GSK-3β或β-actin一抗(稀釋比例分別為1∶5 000、1∶500、1∶5 000)，4 ℃孵育過夜，加入二抗(稀釋比例均為1∶200)，室溫下?lián)u床孵育3 h。TBST充分洗滌PVDF膜3～5次，每次5 min。ECL發(fā)光試劑盒顯影、拍照，對雜交帶進行密度掃描分析。以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白與β-actin條帶灰度值的比值計算β-catenin、GSK-3β蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組膝關(guān)節(jié)大體情況及病理改變比較 ①關(guān)節(jié)軟骨表面大體情況：空白組關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，有光澤且富有彈性，未見裂痕，未見明顯腫脹、增生及滑膜充血。模型組關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙不平整，色澤暗淡，軟骨較薄伴有糜爛，可見明顯腫脹、增生及滑膜充血。其他各組關(guān)節(jié)表面大體情況均優(yōu)于模型組，但差于空白組；42 ℃塌漬組關(guān)節(jié)表面較光滑，可見輕度腫脹及滑膜充血；扶他林組及37 ℃塌漬組、32 ℃塌漬組關(guān)節(jié)軟骨表面均不平整，伴有腫脹及滑膜充血。②軟骨組織病理改變：空白組軟骨細胞數(shù)量較多，分布均勻，排列整齊，潮線完整。模型組軟骨較薄，表面粗糙，伴有列缺，細胞數(shù)目較少，排列紊亂，局部聚集明顯，染色不明顯，潮線模糊。其他各組在軟骨細胞數(shù)目、分布、染色情況及潮線等方面均優(yōu)于模型組，但差于空白組；42 ℃塌漬組軟骨細胞數(shù)目較多，分布較均勻，可染色，潮線模糊但有層次；37 ℃塌漬組、扶他林組、32 ℃塌漬組軟骨細胞數(shù)量較少，分布比較亂，有局部細胞積聚，潮線較模糊。

2.2 各組膝關(guān)節(jié)軟骨組織Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a mRNA表達比較 空白組、42 ℃塌漬組、37 ℃塌漬組、扶他林組、32 ℃塌漬組、模型組膝關(guān)節(jié)軟骨組織Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a mRNA相對表達量均依次升高，兩兩比較P均<0.05。見表1。

表1 各組膝關(guān)節(jié)軟骨組織Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a mRNA相對表達量比較

注：與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與32 ℃塌漬組比較，cP<0.05；與37 ℃塌漬組比較，dP<0.05；與42 ℃塌漬組比較，eP<0.05。

2.3 各組膝關(guān)節(jié)軟骨組織β-catenin、GSK-3β蛋白表達比較 空白組、42 ℃塌漬組、37 ℃塌漬組、扶他林組、32 ℃塌漬組、模型組膝關(guān)節(jié)軟骨組織軟骨組織β-catenin、GSK-3β蛋白相對表達量均依次升高，兩兩比較P均<0.05。見表2。

表2 各組膝關(guān)節(jié)軟骨組織β-catenin、GSK-3β蛋白表達比較

注：與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與32 ℃塌漬組比較，cP<0.05；與37 ℃塌漬組比較，dP<0.05；與42 ℃塌漬組比較，eP<0.05。

3 討論

膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制尚不清楚，臨床缺乏有效的治療方法，只能以緩解臨床癥狀、延緩關(guān)節(jié)破壞為主[10,11]。扶他林為治療膝骨關(guān)節(jié)炎的常用藥，臨床常用其緩解疼痛。膝骨關(guān)節(jié)炎在中醫(yī)屬于“痹病”，中醫(yī)認為其病機為肝腎虧虛、筋脈失養(yǎng)，風(fēng)寒濕之邪侵襲人體，氣血阻滯經(jīng)絡(luò)，或過勞，或跌打損傷致瘀血阻絡(luò)。我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療膝骨關(guān)節(jié)炎的方法很多，其中塌漬療法的應(yīng)用已有上千年歷史，其作用原理為熱力作用有助于打開皮膚毛孔, 藥物成分可通過皮膚吸收，從而改善血液循環(huán)，發(fā)揮消腫止痛和祛風(fēng)祛濕作用。活血通痹湯根據(jù)患者的病情辨證組方，具有活血化瘀、通絡(luò)止痛、強筋健骨的作用，既往有研究采用活血化瘀藥物溻漬療法治療骨關(guān)節(jié)炎臨床效果較好、不良反應(yīng)較少[12,13]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，扶他林組及各溫度塌漬組治療后關(guān)節(jié)組織病理改變均有所改善，但42 ℃塌漬組改善最明顯。證實活血通痹湯塌漬療法治療膝骨關(guān)節(jié)炎效果較好， 42 ℃條件下的治療效果最佳。

Wnt/β-catenin信號通路為Wnt信號通路中的經(jīng)典通路[14]，該信號通路在早期胚胎發(fā)育、細胞增殖分化和凋亡、器官形成以及腫瘤形成中均發(fā)揮重要作用[15]。Wnt/β-catenin信號通路主要包括Wnt蛋白、跨膜受體(Frizzled)、散亂蛋白(Dsh)、軸蛋白(Axin)、GSK-3β、腺瘤性結(jié)腸息肉病蛋白(APC)、β-catenin及T細胞因子/淋巴增強因子(Tcf/Lef)等[16]。Wnt信號通路傳導(dǎo)過程中的重要組成部分是Wnt家族蛋白，其中Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a、Wnt10a等已被證實是參與Wnt信號通路激活的上游基因[17]。β-catenin是Wnt信號通路中的關(guān)鍵成員[18]，在正常細胞中的表達水平較低。當(dāng)Wnt信號通路被激活時，Wnt蛋白與細胞膜上的特異性受體蛋白結(jié)合，活化胞質(zhì)內(nèi)蓬亂蛋白(dishevelled、Dsh或Dvl)，抑制由β-catenin、Axin、GSK-3β、APC等組成的降解復(fù)合物合成，導(dǎo)致β-catenin磷酸化水平降低；β-catenin在細胞質(zhì)內(nèi)濃度逐漸升高，達到一定濃度后轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)與TCF/LEF結(jié)合，激活Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP-3)、MMP-13、骨形成蛋白2等表達，從而促進軟骨細胞增殖、分化與凋亡[19～21]。這個降解復(fù)合體中，GSK-3β發(fā)揮主要作用，GSK-3β可以促進β-catenin磷酸化，導(dǎo)致磷酸化的β-catenin經(jīng)泛素化和蛋白酶體降解[22]。當(dāng)無Wnt信號時，β-catenin與Axin、GSK-3β、APC等形成降解復(fù)合物，使β-catenin被磷酸化，無法激活下游基因表達，因此其在正常軟骨細胞中的表達水平較低。本研究結(jié)果顯示，空白組、42 ℃塌漬組、37 ℃塌漬組、扶他林組、32 ℃塌漬組、模型組膝關(guān)節(jié)軟骨組織Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a mRNA相對表達量及β-catenin、GSK-3β蛋白相對表達量均依次升高，兩組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；說明活血通痹湯溻漬療法治療兔膝骨關(guān)節(jié)炎的相關(guān)機制可能與其抑制Wnt/β-catenin信號通路傳導(dǎo)有關(guān)；且42 ℃條件下對軟骨細胞Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)因子表達的抑制作用最強。活血通痹湯塌漬療法可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路上相關(guān)因子的表達而調(diào)控軟骨細胞增殖、分化和凋亡，從而控制膝骨關(guān)節(jié)炎的疾病進展，但是其具體的調(diào)控機制仍需進一步探討。

綜上所述，活血通痹湯塌漬療法治療兔膝骨關(guān)節(jié)炎的效果較好，42 ℃條件下的治療效果最佳；其作用機制可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。