膝骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨組織、軟骨細胞中l(wèi)et-7a表達變化及意義

陳林建，李朝暉，羅真

(廣東醫(yī)科大學(xué)附屬佛山禪城中心醫(yī)院，廣東佛山528031)

骨關(guān)節(jié)炎是以關(guān)節(jié)軟骨退變?yōu)樘卣鞯睦夏瓿Ｒ娂膊?，以膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA)最為常見。研究證實，關(guān)節(jié)軟骨細胞數(shù)量減少和軟骨基質(zhì)降解是KOA的主要病理改變[1]，軟骨細胞凋亡和自噬在KOA的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[2,3]。miRNA是一類長度為20～24 nt高度保守的小分子非編碼RNA，通過對靶基因表達的調(diào)控參與細胞增殖、分化、凋亡、自噬等一系列重要生理及病理過程[4～6]。let-7家族是最先被鑒定的miRNA之一，let-7a是該家族的成員。目前關(guān)于let-7a在KOA患者軟骨細胞中的表達及其作用機制尚不清楚。為此，我們于2016年6月～2017年6月進行了如下研究。

1 材料

膝關(guān)節(jié)軟骨組織：KOA軟骨組織取自我院行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的40例KOA患者(男12例、女28例，年齡64～75歲，均符合2007年中華醫(yī)學(xué)會骨科學(xué)分會制定的KOA診療指南診斷標準[7]，排除因其他疾病行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)者)，為其膝關(guān)節(jié)軟骨外漏區(qū)邊緣的軟骨退變組織。正常膝關(guān)節(jié)軟骨組織標本取自同期因創(chuàng)傷于我院行下肢截肢手術(shù)的15例患者(男10例、女5例，年齡16～40歲，均為非KOA患者，既往膝關(guān)節(jié)功能正常)。膝關(guān)節(jié)軟骨細胞：取部分KOA軟骨組織及正常軟骨組織，參考文獻[8,9]的方法，用含青霉素、鏈霉素雙抗的冰冷PBS沖洗3遍，無菌眼科小剪刀剪成大小約為1 mm×1 mm×1 mm的碎塊。加入0.25 %胰蛋白酶，置于37 ℃培養(yǎng)箱中振蕩消化40 min，棄上清液，加入Ⅱ型膠原酶，37 ℃培養(yǎng)箱中振蕩消化4～6 h。3 000 r/min離心10 min，收集細胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3天換液1次，細胞融合至85%左右時進行消化傳代，取傳2代細胞用于后續(xù)實驗。主要試劑：胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基均購自美國Hyclone公司，TRIzol試劑購自北京雷根生物技術(shù)有限公司，Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司，SYBR Premix EX Taq(Perfect Real time染料法)實時熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司，Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，抗微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)抗體、抗Beclin1抗體均購自美國Santa Crus公司，抗Bax抗體、抗Bcl-2抗體均購自上海生工生物工程有限公司，HRP標記的二抗購自美國BioWorld公司。let-7a模擬物let-7a mimics及陰性對照NC-mimics均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，let-7a及U6引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計合成。

2 方法與結(jié)果

2.1 軟骨組織及軟骨細胞let-7a mRNA表達檢測

2.1.1 軟骨組織let-7a mRNA表達檢測 采用實時熒光定量PCR法。分別取部分KOA軟骨組織及正常軟骨組織100 mg，充分研磨后加入TRIzol試劑提取組織總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計對每個樣本提取總RNA的A260/A280進行測定，證實符合實驗要求。按M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，參照SYBR Premix EX Taq實時熒光定量試劑盒說明書配置反應(yīng)體系，應(yīng)用實時熒光定量PCR儀進行檢測。let-7a上游引物：5′-GCCGCTGAGGTAGTAGGTTGTA-3′，下游引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。內(nèi)參U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應(yīng)條件：94 ℃、10 s，94 ℃、5 s，60 ℃、34 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算let-7a mRNA相對表達量。結(jié)果顯示，KOA軟骨組織及正常軟骨組織let-7a mRNA相對表達量分別為0.48±0.18、1.02±0.07，二者比較P<0.01。

2.1.2 軟骨細胞let-7a mRNA表達檢測 分別取KOA軟骨細胞及正常軟骨細胞各1×107個，加入細胞裂解液進行裂解，參照2.1.1采用實時熒光定量PCR法檢測let-7a mRNA相對表達量。結(jié)果顯示，KOA軟骨細胞及正常軟骨細胞let-7a mRNA相對表達量分別為0.29±0.13、0.98±0.05，二者比較P<0.01。

2.2 let-7a過表達對KOA軟骨細胞凋亡及自噬影響的觀察

2.2.1 let-7a過表達的KOA軟骨細胞模型建立 取生長狀態(tài)良好的KOA軟骨細胞接種于6孔板，接種密度為3×105個/孔，待細胞融合60%～80%時隨機分為let-7a過表達組及對照組，分別采用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染let-7a mimics及NC-mimics，轉(zhuǎn)染6 h更換新鮮培養(yǎng)液；轉(zhuǎn)染48 h收集兩組細胞，參照2.1.1采用實時熒光定量PCR法檢測let-7a mRNA相對表達量。結(jié)果顯示，let-7a 過表達組及對照組細胞 let-7a mRNA相對表達量分別為14.84±0.58、1.01±0.06，兩組比較P<0.01。證實let-7a過表達的KOA軟骨細胞模型成功建立。

2.2.2 let-7a過表達的KOA軟骨細胞凋亡能力檢測 采用流式細胞術(shù)。收集let-7a過表達組及對照組轉(zhuǎn)染48 h后的細胞，PBS沖洗2遍，以不含EDTA的胰蛋白酶消化后，離心收集細胞制成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×106個/mL。取100 μL細胞懸液置于流式管中，加入10 μL Annexin V-FITC溶液和 5 μL碘化丙啶(PI)混勻，冰浴、暗處靜置10 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。結(jié)果顯示，let-7a 過表達組及對照組細胞凋亡率分別為(5.41±1.43)%、(18.52±4.21)%，兩組比較P<0.01。

2.2.3 let-7a過表達的KOA軟骨細胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2及自噬相關(guān)蛋白LC3(LC3Ⅱ、LC3Ⅰ)、Beclin1表達檢測 采用Western blotting法。收集let-7a 過表達組及對照組轉(zhuǎn)染48 h的細胞，PBS沖洗3遍，加入細胞裂解液和1%蛋白酶抑制劑，冰上處理20 min。4 ℃條件下離心15 min，收集上清液，BCA法進行蛋白定量。兩組分別取30 μg蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉。加入Bax、Bcl-2、LC3、Beclin1和GAPDH一抗(稀釋倍數(shù)均為1∶500)，4 ℃孵育過夜，洗膜；加入二抗(稀釋倍數(shù)均為1∶1 000)，37 ℃孵育1 h，洗膜。ECL染色，拍照后對蛋白條帶灰度值進行分析。以Bax、Bcl-2、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin1與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值計算蛋白相對表達量，并計算Bcl-2/Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ。結(jié)果顯示，let-7a 過表達組Bax蛋白相對表達量低于對照組，Bcl-2蛋白相對表達量及Bcl-2/Bax均高于對照組，兩組比較P均<0.01。見表1。let-7a過表達組LC3Ⅱ、Beclin1蛋白相對表達量及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均高于對照組，LC3Ⅰ蛋白相對表達量低于對照組(P均<0.05)。見表2。

表1 let-7a過表達組及對照組Bax、Bcl-2蛋白表達比較

注：與對照組比較，*P<0.01。

表2 let-7a過表達組及對照組LC3、BedLin蛋白表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

miRNA通過調(diào)控靶基因表達而參與細胞增殖、分化、凋亡等過程，在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[10,11]。研究發(fā)現(xiàn)，與正常膝關(guān)節(jié)軟骨組織相比，許多miRNA在骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨組織中存在差異表達[12]；骨關(guān)節(jié)炎不同病情者軟骨組織中miRNA表達亦存在差異[13]，提示miRNA在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展過程中可能具有重要作用。let-7a屬于let-7家族的重要成員，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其在白內(nèi)障晶狀體上皮細胞、阿爾茨海默病神經(jīng)細胞以及骨關(guān)節(jié)炎滑膜液等老年退行性疾病中表達異常[14～16]。本研究結(jié)果顯示，KOA軟骨組織及KOA軟骨細胞let-7a mRNA相對表達量均低于正常軟骨組織及正常軟骨細胞，提示let-7a可能與KOA的發(fā)生密切相關(guān)。

關(guān)節(jié)軟骨退變是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制的中心環(huán)節(jié)，軟骨細胞衰老凋亡是其最主要的病理表現(xiàn)[17]。既往研究表明，骨關(guān)節(jié)炎的一系列病理生理過程，如軟骨形成和分化、軟骨基質(zhì)降解以及軟骨細胞增殖、凋亡、自噬等過程幾乎均有miRNA的參與[18]。Zhang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，miR-210能夠通過靶向DR6抑制NF-κB活性抑制軟骨細胞凋亡。Huang等[20]證實，miR-337-3p能夠通過調(diào)控PTEN/AKT通路促進OA軟骨細胞增殖并抑制其凋亡。Bcl-2是Bcl-2家族中最重要的凋亡抑制因子，Bax與其功能相反，是重要的凋亡促進因子。Bcl-2/Bax是決定對細胞凋亡抑制作用強弱的關(guān)鍵因素，可反映細胞凋亡情況。本研究結(jié)果顯示，let-7a過表達組細胞凋亡率、Bax蛋白相對表達量均明顯低于對照組，Bcl-2蛋白相對表達量及Bcl-2/Bax均高于對照組；證實上調(diào)軟骨細胞let-7a表達可抑制其凋亡。

細胞自噬亦稱Ⅱ型程序性細胞死亡，是機體在生理或病理條件下的應(yīng)激反應(yīng)，通過溶酶體清除受損或老化的細胞器，并將其轉(zhuǎn)化為新的能量物質(zhì)，從而維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。自噬是正常軟骨細胞的保護或平衡機制，細胞自噬水平下降在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用[21]。Caramés等[22]研究發(fā)現(xiàn)，骨關(guān)節(jié)炎小鼠模型中自噬相關(guān)蛋白ULK1、Beclin1和LC3表達均明顯降低。Cheng等[23]證實，軟骨細胞自噬水平下降與骨關(guān)節(jié)炎密切相關(guān)，提高細胞自噬水平可延緩骨關(guān)節(jié)炎進展，對軟骨組織具有重要的保護作用。骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞的自噬水平較正常軟骨細胞明顯降低，許多miRNA可通過調(diào)控軟骨細胞的自噬水平而調(diào)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎進展[24～26]。目前研究通常以LC3Ⅱ/LC3Ⅰ評估細胞的自噬水平。Beclin-1基因是酵母菌ATG6同源體，其表達水平與自噬水平呈正相關(guān)，亦是反映細胞自噬水平的常用指標。本研究結(jié)果顯示，let-7a 過表達組LC3Ⅱ、Beclin1蛋白相對表達量及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均高于對照組，LC3Ⅰ蛋白相對表達量低于NC-mimics組；說明上調(diào)KOA軟骨細胞let-7a表達可促進其自噬。

綜上所述，let-7a在KOA患者軟骨組織、軟骨細胞中的表達均降低；上調(diào)let-7a表達能促進軟骨細胞自噬并抑制其凋亡，從而發(fā)揮軟骨保護作用。let-7a可能成為KOA治療的一個潛在靶點。