纈沙坦對(duì)膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，山東 青島 266071)

膿毒癥是重癥醫(yī)學(xué)科的常見(jiàn)疾病，其發(fā)病率、病死率均居高不下[1-2]，是重癥醫(yī)學(xué)科醫(yī)生經(jīng)常要面對(duì)的挑戰(zhàn)之一。細(xì)胞凋亡是膿毒癥發(fā)生器官功能損傷的主要病理機(jī)制之一[3]，能夠?qū)е聝?nèi)皮細(xì)胞功能障礙、免疫紊亂等不良事件的發(fā)生[4-5]，其中心肌細(xì)胞過(guò)度凋亡是膿毒癥心肌抑制的重要機(jī)制之一[6]。腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的激活在生理狀態(tài)下是維持人體血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定的重要機(jī)制，但越來(lái)越多的研究證實(shí)RAS的過(guò)度激活是膿毒癥器官功能損傷的重要病理機(jī)制之一[7-8]，纈沙坦作為血管緊張素Ⅱ的Ⅰ型受體的拮抗劑(ARB)在膿毒癥的治療中已逐漸引起人們的重視。本研究擬使用盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)法[9]復(fù)制膿毒癥大鼠模型，通過(guò)蘇木精-伊紅(HE)染色觀察膿毒癥大鼠心肌病理?yè)p傷的變化，采用原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)的變化，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定大鼠心肌組織凋亡蛋白表達(dá)量的變化，以初步探討纈沙坦對(duì)膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

健康雄性SD大鼠(青島大任富城畜牧有限公司，許可證號(hào)：SCXKL魯20140007)共50只，體質(zhì)量280～330 g。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組(A組)、假手術(shù)組(B組)、膿毒癥組(C組)、小劑量纈沙坦組(D組)、大劑量纈沙坦組(E組)5組，每組10只大鼠。

1.2 各組的處理

A組大鼠不給予任何處理；B組大鼠開(kāi)腹找到盲腸后立即還納關(guān)腹，不予結(jié)扎穿孔；C、D、E組按照CLP法[9]制備膿毒癥模型，術(shù)后自由進(jìn)食水，嚴(yán)密觀察大鼠的狀態(tài)。A、B、C組在術(shù)后以生理鹽水(10 mL/kg)灌胃。D組大鼠術(shù)后給予纈沙坦(規(guī)格為80 mg，北京諾華制藥公司)溶液(以生理鹽水溶解至5 g/L)灌胃，劑量為10 mL/kg，E組大鼠在D組基礎(chǔ)上，術(shù)后6 h再次給予同等劑量的纈沙坦溶液灌胃。C、D、E組大鼠術(shù)后腹壁皮下注射生理鹽水(30 mL/kg)，模擬液體復(fù)蘇。

所有動(dòng)物術(shù)后24 h再次麻醉，沿原腹部切口再次打開(kāi)腹腔，觀察腹腔感染的情況，向上縱行延長(zhǎng)切口分離心臟，4 ℃生理鹽水洗凈血污，取一部分左心室游離壁組織保存于40 g/L多聚甲醛中待HE及TUNEL染色，剩余心肌組織保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1術(shù)后大鼠生存情況 觀察CLP術(shù)后各組大鼠的生存狀態(tài)、應(yīng)激反應(yīng)、神經(jīng)系統(tǒng)功能的改變，記錄各組大鼠的病死率，CLP術(shù)后24 h內(nèi)死亡的大鼠不納入最終觀察對(duì)象，及時(shí)補(bǔ)齊各組大鼠的樣本量。術(shù)后24 h再次麻醉后開(kāi)腹，觀察腹肌的緊張度及腹腔液體的性狀、腹腔感染和腹膜炎的程度。

1.3.2心肌病理學(xué)變化觀察 心肌組織在多聚甲醛中保存72 h以上，流水沖洗5～12 h洗凈甲醛，經(jīng)梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋后制成蠟塊，蠟塊以5 μm厚連續(xù)切片，取形態(tài)規(guī)則的完整切片，用玻璃板撈出。置于60 ℃的電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中30 min烘干。經(jīng)脫蠟、水化、HE染色，中性樹(shù)膠和二甲苯(比例為3∶7)混合溶液封片后，光學(xué)顯微鏡下觀察心肌顯微結(jié)構(gòu)的變化，并拍攝圖片。

1.3.3細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)的檢測(cè) 使用石蠟切片進(jìn)行TUNEL染色，步驟嚴(yán)格按照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Alexa Fluor 488)(上海翊圣生物科技有限公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，載玻片封片后，于光學(xué)顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞凋亡情況，Image-Pro Plus分析各樣本的AI。其中凋亡的細(xì)胞核呈棕黃色，正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色，即AI=視野內(nèi)凋亡細(xì)胞核個(gè)數(shù)/視野內(nèi)所有心肌細(xì)胞核個(gè)數(shù)，每個(gè)樣本隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)算出的AI取平均數(shù)計(jì)入結(jié)果。

1.3.4心肌組織凋亡蛋白含量的檢測(cè) 電子天平稱(chēng)取0.07～0.09 g的心肌組織，按1∶10 000的比例加入組織裂解液(不超過(guò)1 mL)，使用手持式樣品制備儀制備成組織勻漿后，于低溫離心機(jī)中4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取上清液用ELISA法檢測(cè)心肌組織凋亡蛋白含量的變化。步驟嚴(yán)格按照大鼠B細(xì)胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)試劑盒以及大鼠半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)試劑盒以及大鼠P53蛋白(P53)試劑盒(均購(gòu)自北京冬歌生物技術(shù)有限公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠生存情況比較和腹腔感染程度

C、D組大鼠術(shù)后24 h均出現(xiàn)精神不振、蜷縮少動(dòng)、嗜睡、對(duì)刺激反應(yīng)降低等神經(jīng)系統(tǒng)的癥狀，以及寒戰(zhàn)等中毒癥狀，部分大鼠可見(jiàn)四肢腳爪青紫。E組大鼠同樣具有上述感染中毒癥狀，但較少出現(xiàn)對(duì)刺激無(wú)反應(yīng)和腳爪青紫等休克和微循環(huán)障礙的癥狀。

最終實(shí)驗(yàn)所用大鼠共65只，其中死亡15只大鼠，其中C、D、E組分別死亡7、5、3只大鼠，E組大鼠病死率與C組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但呈下降趨勢(shì)。

術(shù)后24 h C、D、E組大鼠可觀察到腹部膨隆、腹壁張力增大，開(kāi)腹后可聞及惡臭，見(jiàn)大量咖啡色滲出液流出，結(jié)扎的盲腸末端壞死發(fā)黑，與腸管大面積粘連，部分可見(jiàn)與壁層腹膜粘連，大網(wǎng)膜在盲腸局部包裹成團(tuán)，其余腸壁充血水腫，伴部分腸管擴(kuò)張。

2.2 各組大鼠心肌組織病理學(xué)變化

A、B組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)正常，鏡下可見(jiàn)心肌纖維排列緊密，無(wú)水腫、充血及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。C組與A、B組比較，心肌纖維明顯水腫、排列疏松、明顯空泡化改變，大量細(xì)胞核腫脹，可見(jiàn)核淡染、染色質(zhì)聚集成塊及核周間隙增寬，部分心肌纖維斷裂，間質(zhì)滲出明顯、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。D組與C組比較心肌纖維、細(xì)胞核形態(tài)改善不明顯。E組與C、D組比較心肌纖維水腫、空泡化減輕，間質(zhì)滲出減少，結(jié)構(gòu)排列較緊密，細(xì)胞核形態(tài)較C組改善，但仍然有腫脹。見(jiàn)圖1。

2.3 各組大鼠心肌細(xì)胞AI、Bcl-2、Caspase-3和P53蛋白表達(dá)比較

C組大鼠心肌凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增加，AI明顯升高，與A、B組比較，差異有顯著性(F=38.47，q=13.64、12.19，P<0.05)；而D組大鼠心肌凋亡細(xì)胞數(shù)略減少，AI也有下降趨勢(shì)，但與C組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；E組大鼠心肌凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少、AI明顯下降，與C組比較差異有顯著性(q=9.68，P<0.01)；且與D組比較，E組的AI也明顯下降(q=8.04，P<0.05)。見(jiàn)圖2，表1。

A、B、C、D、E分別代表A、B、C、D、E組。HE染色，400倍。

A、B、C、D、E分別代表A、B、C、D、E組。TUNEL染色，400倍。

組別nAI(χ/%)Bcl-2(ρ/ng·L-1)Caspase-3(c/pmol·L-1)P53(ρ/ng·L-1)A組104.49±1.41105.77±7.1220.11±1.97204.82±13.81B組106.16±1.131110.61±5.3622.45±1.22236.87±21.48C組1020.08±6.5358.84±13.4334.46±5.03412.69±63.06D組1018.20±7.8970.96±8.7832.80±3.78386.87±61.55E組109.01±2.6086.46±19.9523.68±2.31287.62±37.01

C組大鼠心肌細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)量與A、B組相比較，明顯降低(F=47.70，q=14.73、15.84，P<0.05)；與C組比較，D組大鼠心肌細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=4.25，P<0.05)；與D組比較，E組大鼠心肌細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)量升高更加顯著(q=9.68，P<0.01)。見(jiàn)表1。

C組大鼠心肌組織中Caspase-3的含量與A、B組比較明顯升高(F=80.33，q=19.93、16.43，P<0.05)；D組與C組比較，Caspase-3的表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；而E組與C、D組比較，心肌組織中Caspase-3的含量則明顯降低(q=15.18、12.45，P<0.05)。

C組大鼠心肌P53蛋白的表達(dá)量與A、B組比較明顯升高(F=74.15，q=19.75、16.71，P<0.05)；D組與C組比較，心肌組織中P53蛋白的含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；而E組與C、D組比較，心肌組織中P53蛋白的含量則明顯降低(q=11.68、8.96，P<0.05)。

3 討 論

膿毒癥是指嚴(yán)重感染導(dǎo)致的機(jī)體的反應(yīng)失調(diào)，進(jìn)而引發(fā)器官功能障礙[10]，目前已經(jīng)成為重癥醫(yī)學(xué)科發(fā)病率、病死率最高的疾病之一。其發(fā)病機(jī)制可能與炎癥因子的釋放[11]、缺血再灌注損傷[12]、氧化應(yīng)激損傷[13]等病理過(guò)程有關(guān)，這些病理?yè)p傷均可導(dǎo)致DNA損傷，激活各種細(xì)胞凋亡途徑，促進(jìn)免疫功能紊亂、組織細(xì)胞功能障礙的發(fā)生。抑制細(xì)胞凋亡可起到保護(hù)組織器官的作用[14]，CHUNG等[15-16]使用Fas受體融合蛋白阻斷Fas信號(hào)通路的傳導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)可提高膿毒癥小鼠的生存率，改善膿毒癥時(shí)微循環(huán)灌注不足。

RAS是生理狀態(tài)下維持血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定、參與機(jī)體應(yīng)激、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的重要調(diào)節(jié)系統(tǒng)，膿毒癥患者常常因感染導(dǎo)致組織灌注不足、高熱應(yīng)激引起RAS系統(tǒng)的過(guò)度激活，導(dǎo)致血管緊張素Ⅱ(Ang2)大量釋放入血，與血管緊張素Ⅰ型受體(AT1 receptor)結(jié)合，參與眾多病理生理過(guò)程，是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡重要的病理機(jī)制之一，AT1的抑制劑能夠減少細(xì)胞凋亡，發(fā)揮器官保護(hù)作用[17]。ARB能夠抑制Ang2與AT1的結(jié)合，研究結(jié)果證實(shí)ARB類(lèi)藥物可在肝臟[18]、肺泡上皮細(xì)胞[19]、腸黏膜[20]等組織器官中發(fā)揮器官保護(hù)作用，一項(xiàng)納入3 180例膿毒癥患者的臨床研究證實(shí)，應(yīng)用ARB類(lèi)藥物能夠明顯降低膿毒癥患者的30 d病死率[21]。本研究選用纈沙坦阻斷Ang2與AT1的結(jié)合，探討ARB類(lèi)藥物在抑制細(xì)胞凋亡方面的作用機(jī)制。

感染所致的急性腹膜炎是膿毒癥的常見(jiàn)病因，致病菌主要為大腸桿菌，約占59.7%[22]。CLP法通過(guò)盲腸結(jié)扎穿孔模擬腹腔感染、急性腹膜炎的病理過(guò)程，是最符合膿毒癥病理過(guò)程的實(shí)驗(yàn)方法，與腹腔注射脂多糖比較更符合膿毒癥的發(fā)病機(jī)制、血流動(dòng)力學(xué)變化及代謝的變化[23]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，CLP術(shù)后24 h時(shí)心肌損傷最明顯[24]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C、D、E組大鼠術(shù)后24 h出現(xiàn)腹肌緊張、腹部張力明顯增大等表現(xiàn)，開(kāi)腹可聞及糞臭味，并見(jiàn)大量渾濁的滲出性液體及腸內(nèi)容物，腸蠕動(dòng)減弱，結(jié)扎的盲腸末端變黑、充血壞死，表明膿毒癥造模成功。各實(shí)驗(yàn)組大鼠腹腔感染、腹膜炎的嚴(yán)重程度一致。

HE染色是最常用的觀察心肌纖維結(jié)構(gòu)變化、病理?yè)p傷的方法。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C組大鼠心肌纖維正常結(jié)構(gòu)破壞、排列紊亂，大量細(xì)胞核形態(tài)異常，間質(zhì)滲出，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，提示膿毒癥大鼠心肌顯微結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，CLP腹腔嚴(yán)重感染導(dǎo)致了心肌損傷的發(fā)生。D組與C組比較心肌纖維、細(xì)胞核形態(tài)改善不明顯。E組與C組比較，心肌纖維結(jié)構(gòu)相對(duì)正常，排列規(guī)則，纖維空泡形成、間質(zhì)滲出明顯減少，心肌損傷明顯減輕，表明大劑量纈沙坦能夠明顯改善膿毒癥大鼠心肌纖維結(jié)構(gòu)，減輕病理?yè)p傷。

細(xì)胞凋亡時(shí)DNA核酸內(nèi)切酶被激活，切割核小體間的基因組，暴露3′-OH末端，TUNEL染色[25]在末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)的作用下，將Alexa Fluor 488-12-dUTP結(jié)合到暴露的3′-OH上，識(shí)別凋亡細(xì)胞，通過(guò)DAP顯色液可以觀察到凋亡的或正在凋亡的細(xì)胞核為棕黃色，正常的細(xì)胞核被蘇木素染成深藍(lán)色。本研究通過(guò)TUNEL染色對(duì)HE染色的石蠟切片進(jìn)行半定量分析，C組與A、B組比較，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高，表明膿毒癥時(shí)細(xì)胞凋亡是心肌損傷的重要病理機(jī)制之一，對(duì)比D組、C組的凋亡指數(shù)表明小劑量的纈沙坦就可膿毒癥心肌細(xì)胞凋亡的作用并不明顯，而通過(guò)對(duì)比E組與D、C組心肌細(xì)胞的凋亡狀態(tài)，證實(shí)大劑量纈沙坦抑制細(xì)胞凋亡的作用更加顯著。

Caspase-3是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，是外源性凋亡途徑、線粒體凋亡途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑的交匯點(diǎn)，通過(guò)識(shí)別和切割抗凋亡蛋白氨基酸序列、水解DNA核酸內(nèi)切酶抑制因子，增強(qiáng)DNA內(nèi)切酶的活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[26-27]。P53是另一種重要的凋亡調(diào)節(jié)蛋白，當(dāng)組織細(xì)胞輕度損傷時(shí)，能夠修復(fù)受損的DNA片段，穩(wěn)定染色體結(jié)構(gòu)，而當(dāng)組織細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重的功能障礙、能量代謝障礙時(shí)，細(xì)胞損傷難以逆轉(zhuǎn)，P53將會(huì)通過(guò)活化FasL調(diào)控外源性凋亡途徑，激活Bax調(diào)控線粒體凋亡途徑，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[28]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C組較A、B組大鼠心肌組織中Caspase-3、P53的含量明顯升高，表明膿毒癥時(shí)大鼠心肌細(xì)胞中促凋亡蛋白的表達(dá)量明顯增加，從而發(fā)揮強(qiáng)大的促凋亡作用，加速心肌細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。D組與C組比較，Caspase-3、P53的含量未見(jiàn)明顯降低，表明小劑量纈沙坦抑制促凋亡基因表達(dá)的作用并不明顯，不能抑制心肌細(xì)胞凋亡。而E組與C組比較，心肌組織中Caspase-3、P53的含量明顯下降，證實(shí)了大劑量纈沙坦能夠通過(guò)減少促凋亡蛋白的含量，發(fā)揮抑制凋亡的作用。

Bcl-2家族的激活可參與線粒體凋亡途徑，主要分為抗凋亡基因(如Bcl-2、Bcl-xl等)和促凋亡基因(如Bax、Bid等)[29]。因此Bcl-2家族調(diào)控細(xì)胞凋亡的機(jī)制主要取決于哪種凋亡基因的表達(dá)更占優(yōu)勢(shì)，Bcl-2能夠抑制細(xì)胞色素C從線粒體釋放至細(xì)胞內(nèi)，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C組Bcl-2蛋白的含量較A、B組明顯降低，表明膿毒癥時(shí)心肌細(xì)胞中抗凋亡蛋白的表達(dá)降低，而D組心肌細(xì)胞中Bcl-2的含量較C組明顯升高，表明小劑量的纈沙坦就可增加細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)。但E組Bcl-2的含量較C、D組均明顯升高，證實(shí)了與小劑量纈沙坦相比，大劑量纈沙坦更能明顯增加抗凋亡蛋白的表達(dá)。

綜上所述，膿毒癥時(shí)大鼠心肌細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重的細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致心肌損傷加重。而纈沙坦能夠抑制RAS系統(tǒng)的活性，減輕膿毒癥心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮器官保護(hù)作用，這可能是通過(guò)抑制促凋亡蛋白的表達(dá)，增加抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄，抑制了三種細(xì)胞凋亡通路的激活，降低凋亡執(zhí)行者Caspase-3的含量實(shí)現(xiàn)的，但這一過(guò)程與纈沙坦的劑量密切相關(guān)，具體的使用劑量仍需大量實(shí)驗(yàn)研究探索，抑制細(xì)胞凋亡或?qū)⒊蔀槟摱景Y治療的關(guān)鍵。