乳中耐冷菌脂肪酶活性測(cè)定方法進(jìn)展

徐明亮，游春蘋(píng)，高海燕，劉振民

(1.乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海 200436;2.上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444）

0 引 言

市場(chǎng)上銷售的液態(tài)奶主要包括巴氏殺菌奶和超高溫瞬時(shí)滅菌(ultra-high temperature，UHT)奶。與巴氏殺菌奶相比，UHT奶解決了液態(tài)乳運(yùn)輸、貯存、保鮮難的問(wèn)題，降低了牛乳顏色、風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的損失。但UHT奶在長(zhǎng)期存放過(guò)程中仍可能發(fā)生劣變，主要原因之一是原料奶可能污染了一些耐冷菌，這些耐冷菌產(chǎn)生耐熱蛋白酶和脂肪酶[1-3]。這些耐熱酶在經(jīng)過(guò)熱處理后如巴氏殺菌甚至UHT后仍會(huì)有酶活性殘留。Choi等[4]研究表明，在UHT奶儲(chǔ)存期間仍殘留活性的脂肪酶水解脂肪生成的游離脂肪酸含量明顯增加，造成UHT奶酸度的增加，引發(fā)酸敗，對(duì)UHT奶質(zhì)量及儲(chǔ)存期間的質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味穩(wěn)定性造成不良影響[5]。而蛋白酶降解乳中的酪蛋白，產(chǎn)生疏水性多肽，會(huì)導(dǎo)致乳品發(fā)苦。為了保證乳品質(zhì)量安全及貨架期內(nèi)穩(wěn)定性，奶中耐熱脂肪酶的研究具有非常重要的意義。

1 耐冷菌的概念及特性

乳品生產(chǎn)加工過(guò)程中，微生物污染是引起乳品質(zhì)下降的主要因素之一。而耐冷菌是影響乳及乳制品質(zhì)量安全的關(guān)鍵微生物。耐冷菌[6]分為兩類：一類為專性嗜冷菌（Psychtrophiles），最高生長(zhǎng)溫度不高于20℃，最適生長(zhǎng)溫度為15℃或更低溫度，在0℃仍可以生長(zhǎng)繁殖，如耶氏菌、李斯特菌；另一類為兼性嗜冷菌（Psychrotrophs通常也被稱為耐冷菌，本文所述耐冷菌皆為此類），最高生長(zhǎng)溫度高于20℃，最適生長(zhǎng)溫度高于15℃，在0～5℃仍可以生長(zhǎng)繁殖，如假單胞菌。

專性嗜冷菌對(duì)溫度變化比較敏感，對(duì)原料乳及乳制品的影響較小。而耐冷菌廣泛存在于原料乳的外部環(huán)境中，在原料乳的低溫儲(chǔ)藏、運(yùn)輸加工過(guò)程中，耐冷菌選擇性生長(zhǎng)，成為原料乳中的優(yōu)勢(shì)菌群[7]。因此耐冷菌極易對(duì)原料乳造成污染。

原料乳中耐冷菌數(shù)量過(guò)多及其產(chǎn)生的耐熱性脂肪酶會(huì)影響UHT奶的風(fēng)味和品質(zhì)[8]。耐冷菌的本身繁殖生長(zhǎng)在生產(chǎn)過(guò)程中一般不會(huì)引起乳品的嚴(yán)重腐敗變質(zhì)，巴氏殺菌很容易殺死這些細(xì)菌[9]，但是一些耐冷菌如耐冷假單胞菌分泌的耐熱性脂肪酶在巴氏殺菌后依然存在，會(huì)導(dǎo)致乳品變質(zhì)。甚至在UHT處理后仍有部分殘留活性，它們能繼續(xù)分解乳中脂肪產(chǎn)生游離的脂肪酸，導(dǎo)致乳及乳制品的風(fēng)味劣化[10]、質(zhì)構(gòu)破壞，從而降低乳品質(zhì)量，縮短乳品的保質(zhì)期[1-3]。

2 牛乳中脂肪酶分類及特性

脂肪酶是一種水溶性的胞外酶，可以催化三?；视偷乃猓龠M(jìn)其釋放游離脂肪酸和甘油[11]。乳中脂肪酶主要有天然脂肪酶和微生物脂肪酶兩部分組成。原料乳中的天然脂肪酶有兩種：一種吸附于脂肪球膜界面間，稱為膜脂酶，在末乳和乳房炎乳中含量很高；另一種以酪蛋白結(jié)合狀態(tài)存在，稱為乳漿脂酶，它會(huì)由于牛乳的均質(zhì)而吸附于脂肪球上。牛乳中的微生物脂肪酶主要來(lái)源于耐冷菌（尤其是假單胞菌），大部分耐冷菌產(chǎn)生的脂肪酶都具有較強(qiáng)耐熱性，甚至是在高溫殺菌后仍有不同程度的酶活性存在。

微生物脂肪酶的最適反應(yīng)溫度一般在30～50℃之間，但有些脂肪酶在1～8℃甚至是更低的溫度-10～-30℃也能引起食品的腐敗變質(zhì)。耐冷菌中的假單胞菌產(chǎn)生的脂肪酶的最適pH值在8～9之間。其在乳中有相當(dāng)大的活性[12]。研究發(fā)現(xiàn)每毫升原料乳中含有0.0012 U的耐熱脂酶時(shí)，在室溫下貯存四周就會(huì)出現(xiàn)腐敗。脂肪酶分解乳脂肪產(chǎn)生的游離脂肪酸含量超過(guò)65μg/mL時(shí)，乳品就會(huì)出現(xiàn)風(fēng)味缺陷[13]。

3 乳中耐冷菌脂肪酶酶活力檢測(cè)前處理

酶活力檢測(cè)時(shí)，酶前處理及底物的制備是非常重要的。細(xì)菌脂肪酶的處理通常是先通過(guò)菌體的活化復(fù)壯，然后用產(chǎn)酶培養(yǎng)基對(duì)菌體恒溫培養(yǎng)，再將培養(yǎng)液離心處理取上清得到粗酶液。在菌體培養(yǎng)時(shí)不同耐冷菌有不同的最佳產(chǎn)酶條件，可根據(jù)其最佳產(chǎn)酶條件進(jìn)行培養(yǎng)。如果酶活力過(guò)低可對(duì)粗酶液純化使酶活性達(dá)到最高。脂質(zhì)底物通常加入表面活性劑（膽酸鹽、膠等）而形成穩(wěn)定乳液后再加入反應(yīng)體系。酶反應(yīng)結(jié)束后如果反應(yīng)體系渾濁，可加入澄清劑。

4 乳中耐冷菌脂肪酶活力的檢測(cè)方法

乳中耐冷菌脂肪酶活力測(cè)定方法根據(jù)檢測(cè)指標(biāo)不同可分為兩類：一類是通過(guò)測(cè)定底物的減少量；一類是通過(guò)測(cè)定產(chǎn)物的增加量。另外根據(jù)檢測(cè)手段的不同有平板法、濁度分析法、滴定法、比色法、熒光法、色譜法等。

4.1 平板法

原理：平板法測(cè)定脂肪酶的活性主要是依據(jù)脂肪酶將瓊脂平板中的底物（如三丁酸甘油脂）催化生成的游離脂肪酸與瓊脂中的指示劑（羅丹明B或維多利亞藍(lán)）反應(yīng)，在瓊脂平板上形成比較清晰的水解圈。由于水解圈有效直徑的大小與酶活力對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，因此可根據(jù)水解圈直徑對(duì)酶活力進(jìn)行定性和定量分析[14-15]。

此法多適用于細(xì)菌堿性脂肪酶活性的快速粗略測(cè)定。通過(guò)改變瓊脂平板中的底物以及pH等條件，可以很方便地用于其它酶活性的測(cè)定。

4.2 濁度分析法[16]

原理：脂肪酶對(duì)三酰基甘油如三丁酸甘油酯乳液的反應(yīng)導(dǎo)致濁度的降低。該降低的速率與脂肪酶的活性直接相關(guān)。渾濁度的減少可以通過(guò)凝膠狀乳劑中的澄清區(qū)域的大小來(lái)測(cè)量。

Smeltzer等[17]研究表明此法可以檢測(cè)1μg/mL假單胞菌脂肪酶的活性，Lawrence等[18]研究表明濁度分析法可以檢測(cè)0.06μg/mL微球菌脂肪酶的活性。Choi等[4]已經(jīng)用三丁酸甘油酯擴(kuò)散方法成功的檢測(cè)了UHT乳中低含量脂肪酶的活性。

4.3 滴定法[19]

原理：利用脂肪酶將乳化的橄欖油水解成脂肪酸和甘油，再使用標(biāo)準(zhǔn)堿溶液結(jié)合指示劑對(duì)產(chǎn)物脂肪酸進(jìn)行酸堿滴定（或直接用p H酸度計(jì)代替指示劑），由耗堿量求出脂肪酶的活性。包括p H-stat法[20]、溶劑萃取滴定法。

此法設(shè)備便宜、操作簡(jiǎn)單，可廣泛應(yīng)用于奶及奶制品中的脂肪酶活性測(cè)定，但不適用于低含量脂肪酶活性測(cè)定。橄欖油的乳化程度是影響測(cè)定結(jié)果的一個(gè)重要因素。

4.4 比色法

4.4.1 β-萘酚法[21-22]

原理：無(wú)色疏水性β-萘酯與脂肪酶反應(yīng)釋放β-萘酚，β-萘酚的重氮鹽反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致形成彩色的偶氮染料，由此可通過(guò)分光光度法對(duì)脂肪酶活性的定量測(cè)定。Christen等[13]用此方法與瓊脂擴(kuò)散法比較了10株熒光假單胞菌的酶活性測(cè)定，但當(dāng)乳脂肪或渾濁存在時(shí)會(huì)影響測(cè)定的靈敏度。

4.4.2 對(duì)硝基酚法[23-24]

原理：對(duì)硝基酚法是以對(duì)硝基苯酚酯作為底物，脂肪酶水解底物產(chǎn)生具有顏色的對(duì)硝基苯酚，在相應(yīng)波長(zhǎng)下測(cè)出其吸光光度值，再對(duì)照對(duì)硝基苯酚吸光度工作曲線得出脂肪酶活力。

Humbert等[25]已經(jīng)證明對(duì)硝基苯酚法與萃取滴定法有很好的相關(guān)性（r=0.89），但是奶中游離脂肪酸和脂肪的存在會(huì)影響對(duì)硝基苯酯的水解。

4.4.3 銅皂法[26]

原理：銅皂法是利用脂肪酶將橄欖油、三丁酸甘油酯、三油酸甘油酯水解生成脂肪酸和甘油，脂肪酸和顯色劑（5%的醋酸酮溶液用吡啶調(diào)至p H＝6.1）中的銅離子反應(yīng)生成銅皂藍(lán)色絡(luò)合物在710 nm波長(zhǎng)下有最大吸收值，再對(duì)照脂肪酸吸光度工作曲線得出脂肪酸的濃度，計(jì)算酶的活性。

表1 不同脂肪酶活力測(cè)定方法歸納比較

Lowry等[27]描述了允許在2.0-14.0μmo（l 0.5～4.0 mg油酸）水平下非?？焖贉y(cè)定游離脂肪酸。但操作相對(duì)復(fù)雜，易受金屬離子的干擾。

4.5 熒光分析法

4.5.1 4-甲基傘形酮[20,28]

原理：熒光化合物4-甲基傘形酮的?；ビ米髦久富钚詼y(cè)定的底物，通過(guò)水解釋放的4-甲基傘形酮的熒光是脂肪酶活性的量度。

Vercet等[28]研究表明加入2～50μL脂肪酶溶液即可定時(shí)檢測(cè)熒光強(qiáng)度，此法相對(duì)靈敏快速，但容易受到溫度、pH等的影響。

4.5.2 傘形酮方法[29]

原理：當(dāng)非熒光傘形酯被脂肪酶水解時(shí)，傘形酮的熒光強(qiáng)度直接指示脂肪酶活性。

此法已被報(bào)道比4-甲基傘形酮酰基酯更適合進(jìn)行脂肪酶活檢測(cè)。

4.5.3 三?；视腿〈?/p>

原理：三?；视偷囊粋€(gè)烷基熒光基團(tuán)被取代，取代后的三?；视涂捎米鞯孜飦?lái)檢測(cè)脂肪酶活性。

Celestino等[30-32]已經(jīng)將1(3)-pyrenylbutanoyl-2,3(1,2)-dipalmitoyl-sn-glycerol（1,2-DPPBA）作為底物的方法應(yīng)用于奶中脂肪酶活性的檢測(cè)。

4.6 色譜法[33-35]

原理：在脂肪酶與酯底物（通常為三?；视停┓跤陂g形成的游離脂肪酸用溶劑萃取并通過(guò)GC或HPLC進(jìn)行定量。脂肪酸可以從殘留的底物分離，并可以進(jìn)行色譜分離。

這是實(shí)驗(yàn)室常用的方法，可以用于痕量分析，但是設(shè)備昂貴。

4.7 其他

對(duì)于脂肪酶活性檢測(cè)還有其他方法，如放射性測(cè)量法、酶法、物理方法等，可根據(jù)脂肪酶特性選擇合適的方法進(jìn)行酶活力測(cè)定。

5 脂肪酶活力檢測(cè)方法比較

對(duì)于乳品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)分析及管控來(lái)說(shuō)，微生物產(chǎn)酶篩查及確證工作是非常有意義的。在脂肪酶活力測(cè)定時(shí)，可以根據(jù)脂肪酶的特點(diǎn)選擇相應(yīng)的方法。表1列舉了幾種脂肪酶活力檢測(cè)方法，總結(jié)了不同檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用[36]。

6 結(jié)論及展望

通過(guò)比較幾種脂肪酶活力檢測(cè)方法得知：濁度分析法、酶法及放射性測(cè)量法適用于所有脂肪酶活力的測(cè)定[16]；滴定法常用于乳脂肪酶及細(xì)菌脂肪酶的定性測(cè)定；比色法多用于細(xì)菌脂肪酶活力定量測(cè)定；熒光法及色譜法一般只用于細(xì)菌脂肪酶的定性及定量測(cè)定。可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)設(shè)施及節(jié)約成本的原則選擇適宜的方法和底物來(lái)檢測(cè)脂肪酶活性。

針對(duì)酶的不穩(wěn)定特性，可通過(guò)酶的固定化等方式使酶趨于穩(wěn)定，亦可結(jié)合電化學(xué)等方法間接檢測(cè)酶活性。