草魚幼魚肝胰臟抗氧化系統(tǒng)對MC-LR脅迫的響應(yīng)

隗黎麗，何 麗，阮記明，劉 毅，付建平，鐘其旺

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南昌 330045；2.江西師范大學(xué)生命學(xué)院，南昌 330022；3.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，南昌 330045）

在自然環(huán)境因子和人類活動的雙重影響下，水體的富營養(yǎng)化問題日趨嚴重，現(xiàn)已經(jīng)成為全球水生態(tài)系統(tǒng)中所面臨的主要環(huán)境問題之一[1]。富營養(yǎng)化水體可導(dǎo)致藍藻水華的暴發(fā)，一些有毒藍藻細胞破裂后可向水體釋放藻毒素。在已發(fā)現(xiàn)的藻毒素中，由銅綠微囊藻（Microcysis aeruginosa）等產(chǎn)生的微囊藻毒素（Mi?crocystins，MCs）是出現(xiàn)頻率最高、產(chǎn)生量最大、危害最嚴重的一類藻毒素[2]，其中，微囊藻毒素-LR（MCLR）是目前已知的毒性最強、研究最多的一種MCs。已有的研究表明MC-LR的致毒機理與抑制絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶1（PP1）和2A（PP2A）有關(guān)[3-5]。除此之外，自從上世紀90年代有學(xué)者報道MCs可誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生氧化損傷以來[6]，大量的研究報道表明氧化應(yīng)激也是MCs的致毒機制之一[7-10]，但是MCs如何誘導(dǎo)機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激仍然沒有完全弄清楚[11]。

生物體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)是抵御污染脅迫的第一道屏障，抗氧化因子中的活性成分如超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD），過氧化氫酶（Cata?lase，CAT），谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxi?dase，GPx）和谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase，GR）等可隨污染物脅迫而做出迅速響應(yīng)[12]。生物體內(nèi)的這些抗氧化因子在清除氧自由基和過氧化氫、遏制或減少羥自由基形成、保護機體免受自由基損害等方面具有關(guān)鍵作用。目前，國內(nèi)外針對MC-LR對魚類抗氧化酶活性和抗氧化酶基因表達的影響等方面開展了較多的研究，例如，楊靜東等[13]監(jiān)測了不同時間鰣魚抗氧化酶活性的變化，發(fā)現(xiàn)SOD、CAT、GST和GR活性與組織中MCs的含量呈正相關(guān)；任平等[14]比較了不同濃度MC-LR對斑馬魚（Danio rerio）卵巢抗氧化酶的影響，發(fā)現(xiàn)卵巢中丙二醛（MDA）含量和谷胱甘肽還原酶（GR）活性在不同濃度處理組中均發(fā)生顯著下降，谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）活性和GR酶活性隨著水體毒素濃度的增加而顯著下降；Hou等[9]研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚中SOD、CAT、GST、GPx和GSH酶活性以及基因表達變化與MC-LR劑量相關(guān)。草魚（Ctenopharygodon idella）作為淡水養(yǎng)殖的主要養(yǎng)殖品種，尤其是在池塘集約化養(yǎng)殖的情況下，池塘水體極易被MCs污染，如淮河流域池塘水體MCs濃度達到了3.69 μg·L-1[15]，超過了世界衛(wèi)生組織（WHO）規(guī)定飲用水中MC-LR含量的安全指導(dǎo)值（1.0 μg·L-1）[16]。但現(xiàn)在還未見有關(guān)草魚幼魚抗氧化系統(tǒng)對MC-LR脅迫響應(yīng)的報道，因此，本文將以淡水養(yǎng)殖常見品種——草魚作為研究對象，從抗氧化酶活性和基因表達變化來評價MC-LR對草魚幼魚肝胰臟氧化脅迫的響應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗用草魚為當年孵化繁殖的幼魚，平均體重為22.13±2.17 g，購自江西省南昌神龍漁業(yè)公司養(yǎng)殖基地。實驗用MC-LR（純度≥95%），購自Taiwan Algal Science Inc公司，間氨基苯甲酸乙酯甲烷磺酸鹽（MS-222）為Sigma公司產(chǎn)品，RNA提取試劑盒TRIzol reagent購自Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Re?vertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit和SYBR Green Real-time PCR Master Mix購自Promega公司，酶活性測定試劑盒購于南京建成生物有限公司。

1.2 實驗魚的處理及取樣

從養(yǎng)殖場購買的實驗草魚幼魚在實驗室暫養(yǎng)2周，暫養(yǎng)期間每日按照魚體質(zhì)量的2.0%投喂商品飼料，試驗前48 h停止投喂并將草魚隨機分為實驗組和對照組，每組設(shè)置3個重復(fù)。在先前的研究基礎(chǔ)上，實驗組草魚注射劑量設(shè)為25μg MC-LR·kg-1（低劑量）和100μg MC-LR·kg-1（高劑量）。對草魚進行染毒前，根據(jù)說明書用甲醇將MC-LR粉末溶解成1 μg·μL-1的儲備液，注射前用0.8%生理鹽水稀釋成所需濃度，每尾魚注射0.1 mL MC-LR溶液，對照組每尾草魚則注射等量的0.8%的生理鹽水，具體操作方法詳見參考文獻[17]。各實驗組和對照組草魚分別在處理24、48 h和72 h后各取6尾魚，使用MS-222麻醉后，用紗布擦干魚體表面，先迅速分離50 mg左右肝胰臟，置于無RNA酶活性的離心管作為提取RNA的樣品，隨后分離剩余的肝胰臟放入冰冷的PBS（0.01 mol·L-1，pH 7.2）中漂洗兩次除去血液，濾紙擦干后稱重，放入離心管中，用眼科剪刀快速剪碎組織，整個操作在冰水浴中進行。隨后將樣品置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 酶活性的測定分析

將液氮中保存的作為酶活性分析的肝胰臟樣品按質(zhì)量（g）∶體積（mL）=1∶9的比例加入9倍體積的生理鹽水，冰水浴條件下勻漿，2500 r·min-1，離心10 min，收集上清液測定酶活性。SOD和CAT活性的測定的具體操作步驟均根據(jù)南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書進行，SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測定，在波長為550 nm處比色測定吸光度值計算其活力，活力單位定義為每毫克組織蛋白在反應(yīng)液中SOD抑制率達到50%時所對應(yīng)的SOD量為1個SOD活力單位（U·mg-1prot）。CAT活性通過405 nm波長下測定H2O2減少的量測定，活力單位定義為每毫克組織蛋白每秒鐘分解1 μmol的H2O2的量作為1個CAT活力單位（U·mg-1prot）。蛋白含量采用考馬斯亮藍法，以南京建成生物工程研究所提供的試劑盒中蛋白標準液為標準蛋白，同樣按照試劑盒說明書進行測定。

1.4 核酸的提取、cDNA模板的合成及qRT-PCR檢測分析

采用Invitrogen公司的Trizol試劑盒提取總RNA，具體提取方法參考試劑盒的說明書進行。cDNA按RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit操作手冊進行合成。Real-time quantitative PCR（qRT-PCR）反應(yīng)在伯樂公司CFX96 TouchTMReal-time PCR Detec?tion System上完成。反應(yīng)所有引物見表1，其中引物參考了文獻[18]。反應(yīng)體系根據(jù)Promega公司的SYBR Green Real-time PCR Master Mix的說明配制，共20 μL，反應(yīng)條件：94 ℃變性5 min，94 ℃ 10 s，58 ℃15 s，72 ℃ 20 s，45個循環(huán)，72℃延伸5 min。熒光定量PCR的數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進行計算。

1.5 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示，采用多因素方差分析進行統(tǒng)計學(xué)檢驗（SPSS 16.0），統(tǒng)計學(xué)顯著性水平設(shè)定P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 MC-LR對草魚幼魚肝胰臟抗氧化酶活性的影響

多因素方差分析結(jié)果表明，不同MC-LR誘導(dǎo)時間（24、48 h和72 h）對SOD酶活性有顯著影響（F=8.161，P=0.001），不同的誘導(dǎo)劑量對其活性也有顯著影響（F=5.053，P=0.010），作用時間和誘導(dǎo)劑量之間有交互作用（F=3.397，P=0.016）。由圖1A可知，低劑量組草魚幼魚肝胰臟SOD活性在3個時間段變化均不明顯，無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。高劑量組草魚幼魚肝胰臟SOD活性在24 h和48 h均顯著上升（P＜0.05），且在 24 h后達到高峰，為778.97 U·mg-1prot，隨后下降，在72h的活性下降為252.29 U·mg-1prot，差異不顯著（P＞0.05）。

對CAT活性進行多因素方差分析表明，MC-LR誘導(dǎo)不同時間后對CAT酶活性有顯著影響（F=19.642，P＜0.001），不同的誘導(dǎo)劑量對其活性影響無顯著差異（F=0.925，P=0.404），作用時間和誘導(dǎo)劑量之間有交互作用（F=5.607，P=0.001）。由圖1B可知，在24 h，高劑量組肝胰臟中CAT活性在24 h升高，達到43.99 U·mg-1prot，與對照組相比差異顯著（P＜0.05），隨后活性下降；而低劑量組肝胰臟中CAT活性在24 h增強，但與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。然而，低劑量組和高劑量組肝胰臟CAT活性在48 h和72 h均下降，但與對照組相比差異均不顯著（P＞0.05）。

2.2 MC-LR對草魚幼魚肝胰臟抗氧化基因的影響

采用qRT-PCR檢測了MC-LR脅迫下草魚幼魚肝胰臟SOD、CAT、GPx和GR基因表達量的變化（圖2）。多因素方差分析統(tǒng)計結(jié)果表明，MC-LR誘導(dǎo)不同時間（24、48 h和72 h）對SOD基因有顯著影響（F=6.341，P=0.004），不同的誘導(dǎo)劑量對其表達也有顯著影響（F=1.086E3，P=0.000），但作用時間和誘導(dǎo)劑量之間無交互作用（F=1.314，P=0.279）。LSD分析結(jié)果表明，經(jīng)不同劑量MC-LR脅迫不同時間后，SOD基因的表達量與對照組相比均顯著下降（P＜0.05），且低劑量組和高劑量組中肝胰臟SOD隨著時間的延長，表達量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢（圖2A）。

表1 熒光定量PCR擴增的引物Table 1 The primers of genes used for quantitative real-time PCR analysis

用多因素方差分析草魚幼魚經(jīng)不同劑量MC-LR脅迫不同時間后肝臟中CAT基因表達的變化，結(jié)果表明，MC-LR不同誘導(dǎo)時間（24、48 h和72 h）對CAT基因表達無顯著影響（F=1.095，P=0.343），而不同的誘導(dǎo)劑量對其表達有顯著影響（F=52.069，P=0.000），作用時間和誘導(dǎo)劑量之間無交互作用（F=1.132，P=0.354）。LSD分析結(jié)果表明，CAT基因的表達量在MC-LR脅迫的第24、48 h和72 h，兩個劑量組草魚幼魚肝胰臟CAT的表達量均顯著低于對照組（P＜0.05）。低劑量組CAT表達量呈現(xiàn)先下降后升高趨勢，高劑量組CAT表達量呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，在72 h后，高劑量組草魚幼魚肝胰臟中CAT基因的相對表達量僅為0.02（圖2B）。

圖1 MC-LR對草魚幼魚肝胰臟SOD和CAT活性的影響Figure 1 The effects of MC-LR on the enzymatic activities of SOD and CAT in the hepatopancreas of grass carp

圖2 MC-LR對草魚幼魚肝胰臟中抗氧化基因表達水平的影響Figure 2 The effects of MC-LR on the expression of antioxidative genes in hepatopancreas of grass carp

多因素方差分析統(tǒng)計草魚幼魚肝胰臟中GPx基因表達變化的結(jié)果表明，MC-LR誘導(dǎo)不同時間（24、48 h和72 h）對GPx基因表達無顯著影響（F=2.676，P=0.080），不同的誘導(dǎo)劑量對其活性有顯著影響（F=401.271，P＜0.001），作用時間和誘導(dǎo)劑量之間無交互作用（F=1.248，P=0.304）。LSD分析結(jié)果表明，GPx基因表達量的變化如圖2C所示，在兩個劑量組中，GPx在MC-LR脅迫不同時間后，表達量均顯著下降（P＜0.05）。低劑量組中草魚幼魚肝胰臟GPx的表達變化呈現(xiàn)先降低后升高趨勢，表達量在脅迫48 h時，抑制程度最低，相對表達量為0.13；高劑量組中GPx的表達變化呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，在72 h時，其相對表達量為0.07（圖2C）。

草魚幼魚肝胰臟中GR基因表達量變化的統(tǒng)計分析結(jié)果表明，MC-LR誘導(dǎo)不同時間（24、48 h和72 h）對GR基因表達無顯著影響（F=2.787，P=0.072），不同的誘導(dǎo)劑量對其表達有顯著影響（F=7.707，P=0.001），作用時間和誘導(dǎo)劑量之間無交互作用（F=2.192，P=0.085）。GR基因表達量的變化如圖2D所示，GR基因的表達量在低劑量組呈現(xiàn)先升高，后降低再升高的趨勢，在24 h，其表達量上調(diào)至2.46倍，存在顯著差異（P＜0.05），隨后下降，但在72 h，其表達量又上調(diào)至1.95倍，與對照組相比，差異不顯著（P＞0.05）；而高劑量組草魚幼魚肝胰臟GR基因呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，但在72 h，其相對表達量仍被抑制，GR基因在3個時間段的相對表達量差異均顯著（P＞0.05）。

2.3 MC-LR對草魚幼魚肝臟抗氧化酶活性與基因表達的相關(guān)性分析

對抗氧化酶活性與基因表達相關(guān)性進行分析，結(jié)果表明，不同處理組中，SOD活性與其基因表達的相關(guān)系數(shù)r=-0.261（P=0.056），在α=0.01下線性關(guān)系不顯著；CAT活性與其基因表達的相關(guān)系數(shù)r=-0.085（P=0.541），在α=0.01下線性關(guān)系也不顯著（表2）。

3 討論

3.1 MC-LR對草魚幼魚肝胰臟SOD和CAT活性的影響

從抗氧化防御系統(tǒng)的角度來研究微囊藻毒素對魚類的毒性作用機制是一個備受關(guān)注的科學(xué)問題。在正常情況下，生物體內(nèi)SOD和CAT等可以及時清除受環(huán)境脅迫時產(chǎn)生的過量活性氧，從而使活性氧的產(chǎn)生和清除保持一種動態(tài)平衡[13]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，低劑量的MC-LR對草魚幼魚肝胰臟SOD活性沒有影響，高劑量的MC-LR使草魚幼魚肝胰臟SOD活性明顯升高；而草魚幼魚肝胰臟CAT活性僅在高劑量MC-LR脅迫24 h后，其活性顯著升高，其他變化均不顯著。本實驗中酶活性的這種變化趨勢與其他學(xué)者的報道有一定相似性，如Pavagadhi等[8]發(fā)現(xiàn)低濃度MC-LR（＜5.0 μg·L-1）可誘導(dǎo)SOD活性上升，而高濃度（＞5.0 μg·L-1）使SOD活性降低。Yuan 等[19]研究報道低濃度（0.1、1 μg·L-1）的MC-LR對克氏原螯蝦（Pro?cambarus clarkii）SOD和CAT活性沒有影響，然而高濃度（10、100 μg·L-1）的MC-LR可誘導(dǎo)其SOD和CAT活性在暴露早期升高，而隨著暴露時間的延長，則降低了SOD和CAT的活性。SOD和CAT均為細胞內(nèi)重要的抗氧化酶，SOD能將超氧化物陰離子自由基（O-2·）轉(zhuǎn)化成過氧化氫（H2O2），然后在CAT的作用下轉(zhuǎn)變成H2O，當毒素量較高時，可能會引起SOD和CAT活性的消耗過快，從而導(dǎo)致其活性下降[20]。除了濃度的影響之外，朱楓等[21]認為暴露時間的差異也可引起SOD活性的變化，短時間誘導(dǎo)后，SOD為清除過多的ROS而活性快速上升，隨著時間的延長，SOD快速消耗又使其活性下降；CAT的活性同樣隨著誘導(dǎo)時間的延長，其活性下降。另外，也有學(xué)者認為在暴露的早期階段，MC-LR可促使機體抗氧化初級防御系統(tǒng)迅速做出反應(yīng)出現(xiàn)應(yīng)激性的保護，隨著MC-LR的持續(xù)作用，抗氧化酶消耗直到耗竭，從而細胞抗氧化防御系統(tǒng)功能減弱或喪失[22]。根據(jù)以上分析可知，本實驗中SOD和CAT酶活性的這種變化是機體抵御氧化損傷的一種保護機制。

表2 MC-LR脅迫后抗氧化酶活性和基因表達的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of oxidative enzymatic activities and gene expression under MC-LR stress

3.2 MC-LR對草魚幼魚肝胰臟抗氧化基因表達的影響

生物體在基因水平的響應(yīng)是生物應(yīng)對環(huán)境變化的早期響應(yīng)之一，抗氧化基因表達的改變可能在抵御MCs誘導(dǎo)的氧化毒性中起著重要的作用[23]。本研究發(fā)現(xiàn)抗氧化基因SOD、CAT和GPx在低劑量組和高劑量組中脅迫不同時間后，相對表達量均顯著下降，這與其他學(xué)者的報道比較相似，如Jayaraj等[7]研究發(fā)現(xiàn)小鼠（Mus musculus）暴露在高劑量MC-LR（76.62 μg·kg-1）中GPx基因表達被抑制，但更多研究表明，不同劑量MCs誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可使抗氧化基因表達趨勢不一致，如 Hou 等[9]報道低劑量的MC-LR（50 μg·kg-1）在暴露早期可誘導(dǎo)基因表達增加，然而高劑量MC-LR（200 μg·kg-1）可使斑馬魚肝臟中SOD和GPx基因表達下降。在鯽魚（Carassius aumtus）暴露實驗中，發(fā)現(xiàn)MC-LR可使GPx和GR基因表達下調(diào)，CAT和SOD基因表達明顯上升[24]。另外，本文對GR基因的表達研究發(fā)現(xiàn)，GR表達量的變化則與誘導(dǎo)時間和劑量有關(guān)，低劑量在暴露早期（24 h），其相對表達量顯著上調(diào)，而高劑量誘導(dǎo)早期（24 h和48 h），其表達量則下降，但差異不顯著，這與其他學(xué)者的報道不太一致，如小鼠暴露在MC-LR（38.31 μg·kg-1）中，GR基因表現(xiàn)為顯著下調(diào)，而暴露在較高濃度（76.62 μg·kg-1）MC-LR中卻明顯上調(diào)[7]。根據(jù)以上研究報道可推測抗氧化酶相關(guān)基因的表達變化與MC-LR的濃度和時間均有一定關(guān)系，此外，基因表達下降或許與MCs直接損傷抗氧化相關(guān)基因的蛋白結(jié)構(gòu)有關(guān)[25]。

3.3 MC-LR對草魚幼魚肝胰臟抗氧化酶活性和基因表達的相關(guān)性影響

一般來說，在相同的環(huán)境毒物刺激下，SOD和CAT酶活性的變化是一致的[26]，但本研究發(fā)現(xiàn)草魚幼魚經(jīng)MC-LR誘導(dǎo)后，草魚幼魚肝胰臟中SOD和CAT酶活性變化沒有相關(guān)性，如本實驗中高劑量組肝臟中SOD在染毒48 h相對于對照組顯著上升，而CAT在染毒48 h卻顯著下降了，兩個酶活性的變化趨勢不一致，這與Shi等的報道比較相似[27]。另外，有研究報道抗氧化酶相關(guān)基因的表達與酶活性變化的相關(guān)性不大[7]，本研究也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，分析發(fā)現(xiàn)草魚幼魚經(jīng)MC-LR誘導(dǎo)后，肝胰臟中SOD和CAT酶活性與其基因表達的變化沒有相關(guān)性，然而，Xiong等[23]和Galan?ti等[28]均表明MCs誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可使抗氧化酶活性和基因表達增加，并且抗氧化酶活性和基因表達之間呈現(xiàn)正相關(guān)。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)抗氧化酶相關(guān)基因表達水平的改變會直接導(dǎo)致細胞抗氧化防御體系中抗氧化酶活性的變化，從而影響到抗氧化防御體系的效果，進一步放大了MCs引起的機體抗氧化還原系統(tǒng)的不平衡[21]。不同的試驗所用的MC-LR劑量以及脅迫時間的不同，從而導(dǎo)致抗氧化酶活性和基因表達的變化曲線呈現(xiàn)多樣性。本研究發(fā)現(xiàn)SOD和CAT活性在早期階段都是上升的，隨著脅迫時間的延長，又呈現(xiàn)下降的趨勢，而SOD、CAT和GPx基因表達在早期就被抑制了，其原因可能是MC-LR脅迫導(dǎo)致ROS過量產(chǎn)生[29]，破壞了細胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能，導(dǎo)致基因表達持續(xù)下降，也有可能是轉(zhuǎn)錄反應(yīng)比酶活性更敏感，另外，基因表達量與酶活性表現(xiàn)并不完全一致也可能與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控事件有關(guān)。綜上所述，MC-LR脅迫下草魚幼魚肝胰臟抗氧化防御酶活性及其基因表達會發(fā)生改變，但MC-LR對機體抗氧化系統(tǒng)的影響是一個復(fù)雜的過程，尤其是MC-LR對機體抗氧化酶活性與基因編碼調(diào)控之間的相互作用機制還有待更深入的研究。

4 結(jié)論

（1）在MC-LR脅迫草魚幼魚早期階段可誘導(dǎo)其肝胰臟抗氧化酶SOD和CAT活性升高，隨后活性下降，但兩者之間沒有相關(guān)性。

（2）MC-LR脅迫下，低劑量組和高劑量組草魚幼魚肝胰臟中SOD、CAT和GPx基因表達均被抑制，說明抗氧化基因?qū)ν饨绛h(huán)境較敏感，即使低劑量的MCLR也影響機體的轉(zhuǎn)錄水平。在今后進行生物標記物篩選時，尤其是在MC-LR脅迫早期階段，可從基因水平預(yù)警MC-LR的生態(tài)風險。