Pigm特異性選擇標記的開發(fā)及其在粳稻穗頸瘟抗性育種中的利用

曾生元 李闖 杜燦燦 孫立亭 景德道 林添資 余波 錢華飛 姚維成 周義文 龔紅兵

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特異性選擇標記的開發(fā)及其在粳稻穗頸瘟抗性育種中的利用

曾生元 李闖 杜燦燦 孫立亭 景德道 林添資 余波 錢華飛 姚維成 周義文 龔紅兵*

(江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學研究所，江蘇 句容 212400；*通訊聯(lián)系人，E-mail: 1179809265@qq.com)

【目的】是一個廣譜的稻瘟病抗性基因，源自持久抗性品種谷梅4號，與、、、和等互為復等位基因但抗譜存在差異。為了更好地在分子輔助選擇育種中利用基因開發(fā)與特異性標記具有重要意義?！痉椒ā吭谝延形墨I報道定位結果的基礎上，通過隨機測序獲得了一段谷梅4號基因組的特異序列，并據(jù)此開發(fā)了一組用于篩選基因的分子標記，進一步選取江淮稻區(qū)3個不同生態(tài)型代表性粳稻品種作為受體，利用分子標記輔助選擇結合對抗性基因的背景檢測將基因?qū)胧荏w品種?！窘Y果】Pigm-4標記位于基因簇內(nèi)部，與抗病功能元件緊密連鎖，對不同類型的品種檢測發(fā)現(xiàn)該標記特異性強，且利用該標記可將與、、、以及區(qū)分開來。對受體親本稻瘟病抗性基因的檢測和接種結果分析發(fā)現(xiàn)江淮稻區(qū)粳稻品種雖然攜帶了、、、中的2~3個基因，但是對強毒力的稻瘟病小種抗性普遍不強，而3種代表性粳稻背景下導入基因均可顯著提高其對穗頸瘟的抗性水平?！窘Y論】可以作為抗稻瘟病粳稻育種的有利基因資源加以利用，而Pigm-4是分子標記輔助篩選的優(yōu)異標記。

；特異分子標記；粳稻；穗頸瘟；抗性

水稻的全生育期均有可能受稻瘟病為害，但是穗(頸)瘟直接導致水稻減產(chǎn)且無法補救，對水稻的為害更為嚴重[1-2]。大多廣譜稻瘟病抗性資源來自秈稻或者野生稻，而粳稻中普遍缺乏抗稻瘟病優(yōu)異種質(zhì)(國家水稻數(shù)據(jù)中心，http://www.ricedata.cn /gene/gene_pi.htm)。氣候條件適宜時，粳稻極易暴發(fā)稻瘟病。例如，2014年和2015年江淮稻區(qū)的大多粳稻品種均受不同程度穗頸瘟為害[3]。

培育抗病品種是防治稻瘟病最經(jīng)濟有效的手段。傳統(tǒng)的水稻稻瘟病抗性育種是通過抗性鑒定(一般采用接種或發(fā)病區(qū)鑒定等方式)對植株進行表型選擇，工作量大，耗費時間長，且易受環(huán)境條件的限制，鑒定結果的誤差較大，選擇效率較低。通過分子標記輔助選擇抗病基因則可有效減少上述不利因素，是培育抗病品種的有效途徑之一[4]。但是，由于稻瘟病菌具有高度多樣性、變異性的特點，一些抗譜窄的抗性基因則易在較短時間內(nèi)喪失抗性。因此，聚合抗譜廣、抗性持久的抗病基因選育抗病品種，是抗稻瘟病育種的關鍵策略[5]。

是從持久抗稻瘟病品種谷梅4號中鑒定到的一個廣譜抗稻瘟病基因(簇)，與、、、、和等基因位于同一基因家族或互為復等位基因，但不同基因間的抗譜差異明顯[6-11]。江蘇、安徽、湖北、廣東、海南等不同地區(qū)稻瘟病代表性小種接種鑒定結果表明，基因?qū)σ陨系疚敛∩硇》N的抗性頻率最高可達91.9%，抗譜在75%左右，的抗譜較、、更廣，且粳稻中幾乎不存在基因[12-13]。由于與等基因(在粳稻中有一定比例的分布)位于同一基因簇，要實現(xiàn)對的利用就需要將與等其他不同復等位基因區(qū)分開來，從而將特異地導入至受體品種之中。目前用于檢測基因的常用標記包括功能標記M26205、M80362以及InDe1標記S29742等[10, 14-17]。但是，M26205是顯性標記，不能區(qū)分純合與雜合。

本研究通過短序列測定，獲得了谷梅4號基因組的一段特異序列，并據(jù)此成功開發(fā)了谷梅4號基因組特異的分子標記，進一步通過對背景抗性基因的篩選、分子標記輔助選擇結合田間選育，將導入攜帶不同抗稻瘟病基因的不同類型粳稻品種之中，探討了在培育抗稻穗頸瘟粳稻新品系中的利用價值。

1 材料與方法

1.1 水稻材料

本研究所用的水稻材料包括、、、、及的供體品種75-1-127、C101A51、Toride 1、Fukunishiki、IR65482及谷梅4號；受體品種武運2674(遲熟中粳稻)、武運粳27(中熟中粳稻)、鎮(zhèn)稻18(早熟晚粳稻)和秈、粳、秈粳中間型及其他類型代表性品種271份。其中，、、、、的供體品種由江蘇省里下河地區(qū)揚州農(nóng)業(yè)科學研究所提供，谷梅4號引自中國水稻研究所；用于特異性檢測的271份品種材料由揚州大學嚴長杰教授課題組提供。

1.2 引物設計與序列測定

根據(jù)Deng等[6]的定位結果，在http://www.ncbi. nlm.nih.gov/網(wǎng)站上獲取水稻品種日本晴第6染色體10 360 000―10 440 000 bp序列，利用軟件Primer 5.0軟件，設計10對預計產(chǎn)物在500~1200 bp的擴增標記(表2)，這些標記均勻分布，間隔10 kb左右。分別以谷梅4號和日本晴、9311為模板擴增，產(chǎn)物測序，再根據(jù)序列比對結果開發(fā)特異性分子標記。

1.3 DNA提取、PCR擴增及電泳分析

用設計開發(fā)的Pigm-4標記對271份水稻代表性品種進行多態(tài)性檢測，采用SDS法提取水稻葉片的DNA。

參照龔紅兵等[18]的方法進行PCR，反應總體積為10 μL，包括DNA 1.5 μL，2 mmol/L上下游引物各0.5 μL，10×緩沖液(GENERAY) 1.2 μL, 12 mmol/L dNTP 0.3 μL，1000 UDNA聚合酶(GENERAY) 0.1 μL，加ddH2O補足至10 μL。PCR擴增條件為94℃下預變性5 min；94℃下變性30 s，55℃~60℃退火30 s(溫度因引物不同而異)，72℃下延伸30 s左右(根據(jù)預期產(chǎn)物長度，按1 kb/min調(diào)整延伸時間)，擴增32個循環(huán)；72℃下延伸5 min，4℃下保溫。產(chǎn)物經(jīng)8%垂直平板聚丙烯酰胺凝膠電泳，0.1%硝酸銀染色后觀測。

1.4 水稻穗頸瘟抗性鑒定與評價

水稻穗頸瘟抗性鑒定試驗于鎮(zhèn)江市農(nóng)業(yè)科學研究所行香基地進行。5月20日播種，于6月20日移栽，單本栽插，每區(qū)5行，每行12株，株行距13.3 cm×25.0 cm。2次重復，常規(guī)水肥管理。

于水稻孕穗期，選用分別來自廣東省、湖北省、海南省、浙江省和江蘇省的致病頻率較高的5個代表性菌株GD18-3(B1，致病頻率65.6%)、ES9-5-1(B15，致病頻率75.0%)和HN1.1(C1，致病頻率59.4％)、ZJ13-4(A15，致病頻率63.3％)和XH8.4.4(G1，致病頻率37.5％)接種。這5個菌株均引自揚州市農(nóng)業(yè)科學研究所。擴大培養(yǎng)后等比例混合這5個菌株的孢子液。分別選擇每個株系的第2行，用注射器將接種液緩緩注入稻苞內(nèi)，每穗注射1 mL，每重復接種10穗，并對接種的稻穗作好標記。參照國際水稻研究所分級標準(IRRI, 2002)調(diào)查穗頸瘟抗性級別[19]。

表1 代表性品種在Pigm-4座位的帶型

Table 1. Typical varieties and their genotype in Pigm-4 locus.

1.5 受體親本稻瘟病抗性背景分析

對武運2674、武運粳27、鎮(zhèn)稻18等3個受體親本進行稻瘟病抗性基因的檢測，檢測的基因包括、、、、、、、、，其中，、、、、、的特異性檢測標記引自Wu等[12]，的特異性標記引自華麗霞等[20]，的特異性標記引自Costanzo等[5]，的特異性標記引自孫立亭等[21]。這些標記的具體信息列于表3。

表2 本研究用于測序和檢測Pigm基因的相關標記

表3 檢測抗稻瘟病基因的引物信息

1.6 導入系材料的構建與Pigm基因的效應分析

從2014年正季開始，以武運2674與谷梅4號雜交、回交；2014年冬季以武運粳27、鎮(zhèn)稻18為母本，與谷梅4號雜交，之后連續(xù)回交，回交后代均利用Pigm-4標記配合使用Pigm-2標記檢測，至2017年正季，分別回交至BC5F1、BC4F1代，對部分目標單株、株系進行接種和病圃鑒定。

2 結果與分析

2.1 特異連鎖標記的獲得與驗證

對10對隨機引物的測序結果分析表明在第4對產(chǎn)物中谷梅4號的DNA序列與粳稻日本晴相比，谷梅4號缺失73 bp，而與9311相比缺失了44 bp(圖1)。根據(jù)此差異，我們設計了InDel標記Pigm-4(表2)。

根據(jù)測序結果比對差異，我們在上游獲得了一段秈粳特異序列差異，并據(jù)此設計了InDel標記Pigm-2(表1)。

進一步利用Sepigm-4標記分別對攜帶、、、-、的供體品種75-1-127、C101A51、Toride1、Fukunishiki、IR65482進行擴增，測序比對發(fā)現(xiàn)各親本序列均與谷梅4號不同(圖1)。通過Pigm-4標記檢測不同類型的271份代表性品種，其中僅一份未知來源的秈稻材料可擴增出與谷梅4號一致的帶型，從而說明Pigm-4具有很強的特異性(表1、圖2)。

圖1 谷梅4號序列與相關親本的部分序列比對結果

Fig. 1. Sequence alignment of differentalleles amplified with Sepigm-4.

表4 3個受體親本所包含的抗稻瘟病基因型及抗性等級

+: 表示攜帶目標基因; -：不攜帶目標基因；HS―高感; S―中感。

+, With target gene; -, Without target gene; HS, High sensibility; MS, Medium sensibility.

A圖1~18泳道分別為親本谷梅4號、IR65482、C101A51、75-1-127、Toride 1、Fukunishiki、武運2674/谷梅4號BC3F3純系、9311、鎮(zhèn)恢82、鎮(zhèn)恢832、成恢177、成恢727、秀水519、武運2674、武運粳27、鎮(zhèn)稻88、鎮(zhèn)稻18及鎮(zhèn)糯19；B圖1、2泳道分別為武運2674、谷梅4號，3~18泳道為武運2674/谷梅4號部分BC3F2單株。

In Fig. A, Lanes 1 to 18 represent Gumei 4, IR65482, C101A51, 75-1-127, Toride 1, Fukunishiki, BC3F3homozygous lines of Wuyun 2674/Gumei 4, 9311, Zhenhui 82, Zhenhui 832, Chenghui 177, Chenghui 727, Xiushui 519, Wuyun 2674, Wuyunjing 27, Zhendao 88, Zhendao 18, and Zhennuo 19, repectively.

In Fig. B, 1, Wuyun 2674; 2, Gumei 4; Lanes 3 to 18 represent some BC3F2individuals derived from Wuyun 2674/ Gumei 4.

圖2 Pigm-4在部分親本間(A)及分離群體(B)的檢測結果

Fig. 2. Diversity detection of Pigm-4 marker in relevant parents and segregation population.

2.2 受體親本的稻瘟病抗性基因

利用特異性標記對武運2674、武運粳27、鎮(zhèn)稻18等3個受體進行檢測。發(fā)現(xiàn)武運2674含、這兩個抗性基因；武運粳27含、兩個抗性基因，鎮(zhèn)稻18含、、等3個抗性基因(表4)。

對3個受體親本進行穗頸瘟接種鑒定，武運2674、武運粳27及鎮(zhèn)稻18的抗性等級分別為9級(高感)、7級(高感)和5級(中感)，暗示+基因型組合對南方強毒力(高致病頻率)的稻瘟病小種幾乎不存在抗性，+的基因型組合僅減輕部分傷害，盡管提高了水稻的穗頸瘟抗性，但仍難以有效抵抗南方強毒力稻瘟病菌小種(表4)。

2.3 Pigm基因改良粳稻穗頸瘟的效果

分別以武運2674、武運粳27、鎮(zhèn)稻18為母本，與谷梅4號雜交、回交，利用兩翼標記Pigm-4及Pigm-2檢測，三個親本分別回交到BC5F1、BC4F1及BC4F1，對武運2674/谷梅4號衍生的BC5F1共計151個單株進行檢測，發(fā)現(xiàn)利用Pigm-2標記檢測到的基因型為、的個體分別是89、62株，而Pigm-4標記檢測到的基因型為、的個體分別是92、59株，有5個交換單株(即兩個標記基因型不一致的單株)，對武運粳27/谷梅4號BC4F1代93個單株進行檢測，發(fā)現(xiàn)Pigm-2標記檢測到的基因型為、的個體分別是43、50株，而Pigm-4標記有、的個體分別是41、52株，也有5個交換單株；對鎮(zhèn)稻18/谷梅4號衍生的BC4F1代共計67個單株進行檢測，發(fā)現(xiàn)Pigm-2、Pigm-4標記檢測到的基因型為、的個體均為35及32株，但有4個交換單株(表5、圖3)。

表5 Pigm-2及Pigm-4檢測不同回交群體的基因型情況

之后對兩個標記均為雜合帶型的160個目標單株(3個群體分別是88、39、33株)的、、、等4個基因進行檢測，88個武運2674/谷梅4號衍生的BC5F1單株均攜帶了純合的、基因；武運粳27/谷梅4號BC4F1單株中攜帶、、、的有37個，有2個單株未檢測到，鎮(zhèn)稻18/谷梅4號BC4F1單株中基因型為、、、的單株有31個，也有2個單株未檢測到。所以除雜合外，其余抗性基因與受體親本一致的單株共有156個。

分別對攜帶雜合體的160個目標單株及區(qū)段內(nèi)發(fā)生交換，但是其余抗性基因與受體親本一致的14個單株接種鑒定(其中有2個單株因青枯病無法調(diào)查抗性等級)。結果顯示導入基因的不同受體親本的品系均能顯著提高其對南方強毒力小種的穗頸瘟抗性(圖3)。但在兩個側翼標記存在交換的12個單株中，8個Pigm-2位點純隱性而Pigm-4位點雜合單株的抗病比例達到87.5%，而另外4株相反基因型單株的抗性頻率為50%(圖4)，表明2個標記距目標基因還有一定的距離，但是Pigm-4離目標基因更近。

圖3 導入系內(nèi)不同類型交換單株的抗性

Fig. 3. Resistant level of the recombination individuals between Pigm-2 with Pigm-4 of introgression lines.

3 討論

座位是一個含有9個NBS-LRR元件的基因簇，迄今至少已發(fā)現(xiàn)了、、、-、6、、等8個復等位基因，其中、被認為是起主要作用，是，而則在位置上產(chǎn)生了4次復制。Deng等[22]成功實現(xiàn)了對的克隆，研究表明包含13個元件的基因簇，這可能也是較-等其他等位基因抗譜更廣的主要原因，且受()與()共同作用，維持水稻抗性與產(chǎn)量的平衡，其中，表現(xiàn)出表觀遺傳的特征，在不同部位表達量有顯著差異。通過比對發(fā)現(xiàn)本研究標記Pigm-4位于啟動子區(qū)，谷梅4號Pigm-4標記所在區(qū)段的序列與、、、-的供體親本及絕大多數(shù)水稻品種均不相同，表現(xiàn)出谷梅4號基因組特異的現(xiàn)象，對于谷梅4號是如何進化得到這些特異序列，以及它與其抗性的維持是否存在一定的相關性，還有待深入研究。

參照日本晴基因組，基因位于水稻第6染色體10 036 773―10 042 226 bp內(nèi)。在第6染色體短臂上鑒定和分離了多個重要農(nóng)藝性狀相關基因，如品質(zhì)基因[23]、[24]，生育期基因[25]、[26]，廣親和基因S[27]及其他基因，它們之間存在一定的互相連鎖關系，如控制抽穗期的主效基因就位于9 336 376―9 338 569 bp處，與連鎖。所以，要在導入廣譜抗稻瘟病基因的同時保留受體親本優(yōu)良性狀，就需要經(jīng)過多次的回交篩選，而用于篩選的標記與目標基因越為緊密，目標基因不丟失及導入不良連鎖片段的可能性就越小。本研究利用的兩個標記與目標基因緊密連鎖，且其中Pigm-4具有基因組特異性，Pigm-2位于上游2 kb處，二者配合可以確保將基因簇同時導入受體。

1－武運2674；2－武運2674(Pib+Pi54+Pigm)；3－武運粳27；4－武運粳27(Pi54+Pita+Pigm)；5－武運粳27(Pita+Pigm)；6－鎮(zhèn)稻18；7－鎮(zhèn)稻18(Pib+Pi54+Pb1+Pigm)；8－鎮(zhèn)稻18(Pib+Pi54+Pigm)。

Fig. 4. Resistance level of different combination patterns of R genes.

不同課題組對的抗譜測定均證明該基因具有廣譜抗性，但是本研究進一步證明目前江淮稻區(qū)推廣的粳稻品種中并不存在基因型。因此，將導入到粳稻品種，可能有助于顯著改良粳稻的稻瘟病抗性。研究表明有些稻瘟病基因的抗性也會因背景不同而存在差異，如[28-29]。本研究利用分別攜帶不同抗性基因的長江中下游三種不同生態(tài)型的粳稻品種(中熟中粳、遲熟中粳、早熟晚粳)為受體，重點考查了不同粳稻背景下對提升粳稻穗頸瘟抗性的效應，結果表明，江淮稻區(qū)粳稻品種雖然攜帶了部分稻瘟病抗性基因，但是對強毒力的南方小種抗性水平普遍較低，所以一旦本地稻瘟病小種發(fā)生變化，極有可能引起當?shù)氐疚敛暮Φ谋┌l(fā)，而在不同的粳稻背景中均可有效提升其對水稻穗頸瘟的抗性等級，達到高抗水平，進一步證明可以與其他抗稻瘟病基因“兼容”，在改良粳稻稻瘟病抗性育種中加以利用。

需要指出的是，Deng等[22]研究表明基因本身對水稻的產(chǎn)量性狀也存在一定影響，即在降低千粒重同時增加結實率從而保證水稻不減產(chǎn)，不過該研究的粳稻受體品種為日本晴和意大利的原始品種Maratelli，從生產(chǎn)的角度出發(fā)，它們的農(nóng)藝性狀較當前粳稻主栽品種存在明顯差距。例如目前主推常規(guī)粳稻的結實率一般達90%以上(如本研究3個受體品種的結實率均在93%左右)，所以是否可維持主推常規(guī)粳稻品種的產(chǎn)量平衡還需進一步驗證。本研究到目前為止只回交了4~5代，要準確評價在粳稻育種中的利用價值，還需要繼續(xù)回交自交以純化背景，并進一步考查該基因?qū)ζ渌r(nóng)藝性狀的影響。

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Development of Specific Markers forin Marker-Assisted Breeding ofPanicle Blast ResistantRice

Zeng Shengyuan, Li Chuang, Du Cancan, Sun Liting, Jing Dedao, Lin Tianzi, Yu Bo, Qian Huafei,Yao Weicheng, Zhou Yiwen, Gong Hongbing*

(,,;*,:.)

【Objective】is a broad-spectrum resistance gene to rice blast, which is isolated from Gumei 4, a variety with durable resistance.is allelic to,,,,and so on, but shows different resistance spectrum. To breed resistance variety carryingwith molecular marker-assisted selection, discovering-tightly-linked markersis important.【Method】We identified a unique DNA sequence of Gumei 4 by genomic sequencing, and developed a set of specific markers tagged tobase on the sequence divergenceThen, by means of molecular-assisted selection and background gene screening,was pyramided to three representativevarieties belonging to different ecotypes from Yangtze-Huai River Area. 【Result】An InDel marker Pigm-4 which is closely linked to the functional unit ofwas developed. Pigm-4 showed distinct specificity by genotype screening of various rice varieties, and can distinguish the genotype offrom its alleles,,,and. Although receptors carry with resistant genes such as+(Wuyun 2674),+(Wuyunjing 27),++(Zhendao 18),respectively, but none of them can defense high virulence blast pathogen. Relevant introgression lines were established and inoculations of introgression lines indicate thatcan promote resistance level to rice panicle blast significnatly in differentbackgrounds. 【Conclusion】can be used as a beneficial gene source in the breeding of blast resistantrice, and Pigm-4 is an excellent marker for themolecular marker-assisted selection of.

; specific-marker;rice; panicle blast; resistance

Q755; S511.034; S435.111.4+1

A

1001-7216(2018)05-0453-09

2017-11-09;

2018-01-30。

國家重點研發(fā)計劃資助項目(2017YFD0100400)；鎮(zhèn)江市科技支撐計劃資助項目(NY2015018)；江蘇省重點研發(fā)計劃資助項目(BE2015363)；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金資助項目[CX(16)1029]。

10.16819/j.1001-7216.2018.7135