藻藍(lán)蛋白和松花粉的復(fù)合物對(duì)腸道微生物的影響

謝園園，秦松，石麗花，朱立猛，王桐，尹利端，李文軍，*

（1.中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所，山東煙臺(tái)264003；2.煙臺(tái)新時(shí)代健康產(chǎn)業(yè)有限公司，山東煙臺(tái)264006）

藻藍(lán)蛋白（phycocyanin，PC）是一種存在于紅藻和藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi)的光合輔助色素，能高效捕獲光能[1]。它既是一種蛋白質(zhì)，又是一種極好的天然食用色素，同時(shí)又是良好的保健食品，亦可用于制藥行業(yè)，具有抗腫瘤，抗炎，抗氧化等多種生物學(xué)功能，同時(shí)能夠提高淋巴細(xì)胞活性，增強(qiáng)人體免疫力[2]。松花粉是我國(guó)傳統(tǒng)的食藥用佳品，含有近百種酶和多種活性氨基酸，且配比合理，有“微型營(yíng)養(yǎng)庫”之稱[3]。服用松花粉，可以促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)，增進(jìn)食欲，幫助消化，對(duì)胃腸功能紊亂癥有明顯調(diào)節(jié)作用[4]。

人體消化道由動(dòng)態(tài)和高度復(fù)雜的微生物群落組成。這些微生物主要由細(xì)菌組成，總數(shù)超過1014個(gè)細(xì)胞和數(shù)千個(gè)個(gè)體菌株[5]。腸道中的厭氧微生物種類超過1 000種，數(shù)量是人體細(xì)胞的10倍，其所包含的基因約是人體基因的100多倍，腸道已被認(rèn)為是人體的一個(gè)重要的“微生物器官”[6-8]。腸道菌群在營(yíng)養(yǎng)代謝，病原體抗性和免疫系統(tǒng)發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用，腸道菌群失調(diào)會(huì)導(dǎo)致宿主疾病的發(fā)生[9]。研究表明高濃度蛋白質(zhì)能促進(jìn)腸道細(xì)菌的生長(zhǎng)，相反，腸道中細(xì)菌可利用未消化的蛋白質(zhì)，然后將這些膳食營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行微生物發(fā)酵，產(chǎn)生代謝產(chǎn)物如短鏈脂肪酸（short chain fatty acid，SCFA），SCFAs作為結(jié)腸上皮細(xì)胞的燃料并誘導(dǎo)腸細(xì)胞增殖，對(duì)人體健康有益[10]。

正常情況下，人體腸道菌群的組成和結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，然而，這種平衡在一定條件下會(huì)被打破，導(dǎo)致宿主疾病[11]。影響腸道菌群多樣性的因素有很多，飲食、抗生素的使用基因型等均會(huì)對(duì)腸道菌群的多樣性產(chǎn)生一定的影響[12]，而飲食是影響腸道菌群多樣性的主要原因。藻藍(lán)蛋白和松花粉均是常見的營(yíng)養(yǎng)保健品，其中含有的蛋白和多糖等營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)腸道健康具有廣泛的作用。因此，本文應(yīng)用藻藍(lán)蛋白和松花粉的復(fù)配產(chǎn)物，以C57BL/6小鼠為研究對(duì)象，探究藻藍(lán)蛋白和松花粉的復(fù)配產(chǎn)物對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，為藻藍(lán)蛋白和松花粉的應(yīng)用提供更多基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

QIAamp DNA stool mini kit、凝膠提取試劑盒：Qiagen公司，德國(guó)；TruSeq DNA無PCR反應(yīng)制備試劑盒：Illumina 公司，USA；PrimeScriptTMRT regent Kit、熒光定量PCR引物 SYBR Premix Ex Taq：TaKaRa。

藻藍(lán)蛋白：福清市新大澤螺旋藻有限公司；破壁松花粉：煙臺(tái)新時(shí)代健康產(chǎn)業(yè)有限公司。

ABI GeneAmp@9700 PCR系統(tǒng)：北京賽百奧科技有限公司；Qubit 2.0熒光計(jì)：Thermo Scientific公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及樣本采集

6～8周齡，無特定病原體的雄性C57BL/6小鼠18只，均由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供，體重（20±2）g，所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于綠葉制藥有限公司動(dòng)物房，控制恒溫（23±2）℃，恒濕（50%～60%），12 h/12 h的光照/黑暗循環(huán)，飼養(yǎng)期間自由攝食、攝水，實(shí)驗(yàn)開始前，所有動(dòng)物均在此環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為2組（每組9只）：對(duì)照組（蒸餾水）、1.5 g/kg松花粉+50 mg/kg藻藍(lán)蛋白組，通過灌胃的方式干預(yù)4周，對(duì)照組用相同體積的蒸餾水進(jìn)行灌胃。

在實(shí)驗(yàn)開始前一天及實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)收集糞便樣品，取樣時(shí)，將小鼠單獨(dú)放置在經(jīng)過滅菌的籠子里，每只小鼠收集100 mg～150 mg新鮮的糞便于凍存管中，收集完將樣品立即保存在-80℃冰箱中，用于檢測(cè)16S rRNA V3和V4高變區(qū)腸道菌群的變化，并于實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，腹腔注射200 mg/kg的戊巴比妥鈉，將小鼠進(jìn)行安樂死。

1.3 基因組DNA的提取

根據(jù)QIAamp DNA stool mini kit的說明書提取糞便樣品的總基因組DNA。在1%瓊脂糖凝膠上監(jiān)測(cè)DNA濃度和純度。根據(jù)濃度，用無菌水稀釋DNA至1 ng/μL。

1.4 16S rRNA V3和V4區(qū)PCR擴(kuò)增

選擇16S rRNA的V3和V4高變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，使用帶 Barcode 的特異性引物：338F，5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’進(jìn)行擴(kuò)增。所有PCR反應(yīng)均使用高保真PCR主混合物（New England Biolabs）進(jìn)行。

1.5 PCR產(chǎn)物定量和鑒定

將等體積的1倍上樣緩沖液與PCR產(chǎn)物混合，并在2%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。在400 bp～450 bp之間選擇帶有明亮主帶的樣品用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

1.6 PCR產(chǎn)物混合和純化

PCR產(chǎn)物以等密度比混合。然后，用Qiagen凝膠提取試劑盒純化混合物PCR產(chǎn)物。

1.7 文庫準(zhǔn)備和測(cè)序

按照制造商的建議和索引代碼，使用TruSeq DNA無PCR反應(yīng)制備試劑盒產(chǎn)生測(cè)序文庫。在Qubit 2.0熒光計(jì)和Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)上評(píng)估文庫質(zhì)量。最后，在IlluminaHiSeq2500平臺(tái)上對(duì)文庫進(jìn)行測(cè)序，并產(chǎn)生250 bp的配對(duì)末端讀數(shù)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

為了使信息分析結(jié)果更準(zhǔn)確可靠，首先對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，過濾，得到有效的數(shù)據(jù)。雙鏈測(cè)序的片段經(jīng)FLASH拼接，OTU聚類和物種分類以97%的相似度閾值進(jìn)行分析。根據(jù)OTU聚類的結(jié)果，一方面用RDP分類器對(duì)每個(gè)OTU的代表序列進(jìn)行注釋，得到相應(yīng)的物種信息和物種豐度分布。同時(shí)利用QIIME軟件對(duì)序列進(jìn)行分析，利用Perl語言和R語言軟件對(duì)α和β的多樣性進(jìn)行分析，得到樣本中物種豐富度和均勻度的信息、不同樣品或分組間的共有和特有OTUs信息等。另一方面，基于UniFrac距離，采用主坐標(biāo)分析對(duì)樣本進(jìn)行加權(quán)，并對(duì)樣本進(jìn)行聚類，以獲得不同樣本和群體的群落結(jié)構(gòu)差異。

通過單因素方差分析（Tukey檢驗(yàn)）來判斷不同組之間的差異。上述統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS19.0軟件進(jìn)行，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 α多樣性分析

為了探究樣本量是否充足及藻藍(lán)蛋白松花粉復(fù)合物干預(yù)后腸道菌群豐富度和多樣性的變化，進(jìn)行了α多樣性分析，如圖1。

圖1 α多樣性分析Fig.1 Alpha-diversity analysis

基于Illumina Miseq平臺(tái)的的16S rRNA的V3和V4高變區(qū)測(cè)序結(jié)果顯示，通過過濾量控制和嵌合體去除后，獲得了3 052 642個(gè)有效序列，有效序列的平均長(zhǎng)度372。稀釋性曲線是采用對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與它們所能代表OTU的數(shù)目構(gòu)建曲線，當(dāng)曲線趨于平坦時(shí)，說明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量對(duì)發(fā)現(xiàn)新OTU的邊際貢獻(xiàn)很小；反之則表明繼續(xù)測(cè)序還可能產(chǎn)生較多新的OUT。測(cè)序結(jié)果表明，樣品的稀釋曲線（圖1A）已進(jìn)入平臺(tái)期，達(dá)到飽和狀態(tài)。說明在本實(shí)驗(yàn)的測(cè)序量下，測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物物種信息。ACE是用來估計(jì)群落中含有OTU數(shù)目的指數(shù)，ACE值越大，說明群落物種越豐富，Shannon是用來估算樣品中微生物的多樣性指數(shù)，Shannon值越大，說明群落多樣性越高。測(cè)序結(jié)果表明，藻藍(lán)蛋白和松花粉復(fù)配組樣品的ACE值（圖1B）和Shannon值（圖1C）均大于對(duì)照組，表明藻藍(lán)蛋白和松花粉的復(fù)配產(chǎn)物可以促進(jìn)腸道菌群的豐富度和多樣性的增加。

2.2 門水平和科水平主要菌群的變化分析

為了分析腸道菌群的整體變化，對(duì)門水平相對(duì)豐度前七個(gè)的菌群和科水平相對(duì)豐度前十的菌群進(jìn)行了比較，如圖2所示。

采用16S rRNA的V3和V4高變區(qū)的高通量測(cè)序分析C57BL/6小鼠腸道菌群的組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在門水平（圖 2A），Bacteroidetes，F(xiàn)irmicutes，Proteobacteria，Deferribacteres，Actinobacteria，Tenericutes和 Cyanobacteria是豐度最大的菌群，其中Bacteroidetes和Firmicutes是小鼠腸道里的兩大主導(dǎo)菌群，其相對(duì)豐度維持在90%左右，Parkar等[13]在研究中指出擬桿菌門和厚壁菌門是參與代謝未消化食物的主要細(xì)菌群。與對(duì)照組相比，SPC組Bacteroidetes的相對(duì)豐度增加，而Firmicutes的相對(duì)豐度降低，其他菌群未發(fā)生顯著變化。研究表明，擬桿菌門與厚壁菌門的比例與肥胖相關(guān)，肥胖患者中擬桿菌門與厚壁菌門的比值減小，在攝入藻藍(lán)蛋白和松花粉的復(fù)配產(chǎn)品之后，與對(duì)照組相比，擬桿菌門與厚壁菌門的比值增加，表明藻藍(lán)蛋白和松花粉的復(fù)配產(chǎn)品可能有助于減肥，然而小鼠的體重并未發(fā)生顯著變化，可能是干預(yù)時(shí)間太短，體重并未發(fā)生顯著變化[14-16]。在科水平（圖2B），藻藍(lán)蛋白和松花粉干預(yù)后，腸道菌群發(fā)生了顯著變化。Bacteroidales_S24-7_group，Lachnospiraceae，Lactobacilaceae，Erysipelotrichaceae，Helicobacteraceae，Prevotellaceae，Ruminococcaceae，Porphyromonadaceae，Bacteroidaceae和 Rikenellaceae是豐度最大的菌群，其中Bacteroidetes門中的Bacteroidales_S24-7_group和Firmicutes門中的Lachnospiraceae為主導(dǎo)菌群，其相對(duì)豐度大于60%。

圖2 藻藍(lán)蛋白和松花粉復(fù)配產(chǎn)物對(duì)小鼠腸道菌群組成的影響Fig.2 Effects of phycocyanin and pine pollen on the composition of intestinal microbiota

2.3 科水平單菌變化分析

為了探究藻藍(lán)蛋白和松花粉的復(fù)配物對(duì)對(duì)科水平小鼠腸道菌群組成的影響，對(duì)科水平的菌群進(jìn)行了分析，如圖3所示。

圖3 藻藍(lán)蛋白和松花粉的復(fù)配產(chǎn)物對(duì)科水平小鼠腸道菌群組成的影響Fig.3 Effects of phycocyanin and pine pollen on the composition of intestinal microbiota at family

在科水平，藻藍(lán)蛋白和松花粉干預(yù)4周后，小鼠的腸道菌群發(fā)生了顯著變化。藻藍(lán)蛋白和松花粉干預(yù)后，Bacteroidales_S24-7_group，Lachnospiraceae 和 Ruminococcaceae的相對(duì)豐度顯著增加，而Clostridiaceae_1，Clostridiales_vadinBB60_group 和 Coriobacteri－aceae的相對(duì)豐度顯著下降。Bacteroidales-S24-7-group是Bacteroidetes門中含量最高的細(xì)菌，在藻藍(lán)蛋白和松花粉干預(yù)4周后相對(duì)豐度顯著增加。Firmicutes門中的Ruminococcaceae在藻藍(lán)蛋白和松花粉干預(yù)后，其相對(duì)豐度也顯著增加。Bacteroidales-S24-7-group和Ruminococcaceae屬于丁酸鹽產(chǎn)生菌，丁酸鹽在人體健康中起著重要作用，可直接為腸道上皮提供能量，改善腸道消化吸收營(yíng)養(yǎng)，提高腸道免疫力[1-19]。藻藍(lán)蛋白和松花粉干預(yù)后Firmicutes中的Lachnospiraceae相對(duì)豐度顯著增加。有研究指出，Lachnospiraceae可用來預(yù)防人體結(jié)腸癌[20]。藻藍(lán)蛋白和松花粉干預(yù)后Firmicutes門中的Clostridiaceae_1和Clostridiales_vadinBB60_group的相對(duì)豐度顯著下降。Clostridiales_vadinBB60_group和Clostridiaceae_1都是梭狀芽孢桿菌，有些梭狀芽孢桿菌作為正常菌叢寄居在人或動(dòng)物腸道內(nèi)，部分梭菌對(duì)人或動(dòng)物致病，它們大多產(chǎn)生強(qiáng)烈的外毒素，其中以破傷風(fēng)梭菌和肉毒梭菌的毒力最強(qiáng)[21-22]。Actinobacteria門中的Coriobacteriaceae在藻藍(lán)蛋白和松花粉干預(yù)后，相對(duì)豐度顯著下降。Coriobacteriaceae是腸道中的正常菌群，有時(shí)也被認(rèn)為是病態(tài)菌群，因?yàn)樗鼈兊某霈F(xiàn)與菌血癥，牙周炎和陰道病等一系列病理學(xué)有關(guān)[23]。

2.4 主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis，PCoA）干預(yù)前后腸道菌群的變化

為進(jìn)一步探討藻藍(lán)蛋白和松花粉的攝入對(duì)腸道微生物組成的影響，建立了主坐標(biāo)分析（PCoA）圖，見圖4。

圖4 藻藍(lán)蛋白和松花粉干預(yù)后的PCoA分析Fig.4 PCoA analysis after phycocyanin and pine pollen intervention

主坐標(biāo)分析（PCoA）揭示了使用OTU在97%同一性閾值下的對(duì)照（CON）和藻藍(lán)蛋白松花粉復(fù)配（SPC）組的明顯聚類。主坐標(biāo)分析圖顯示在藻藍(lán)蛋白和松花粉干預(yù)之前，PCoA圖顯示小鼠的腸道微生物組彼此高度相似，而在藻藍(lán)蛋白和松花粉干預(yù)4周后，腸道微生物組發(fā)生了明顯的分離。這一結(jié)果表明藻藍(lán)蛋白和松花粉可調(diào)節(jié)小鼠腸道微生物群的組成和多樣性。

3 結(jié)論

通過灌胃藻藍(lán)蛋白和松花粉的復(fù)配物，腸道菌群發(fā)生了顯著變化。干預(yù)后，與對(duì)照組相比，藻藍(lán)蛋白與松花粉復(fù)配組腸道菌群的豐富度和多樣性顯著增加。在門水平，Bacteroidetes的相對(duì)豐度增加，而Firmicutes的相對(duì)豐度降低。在科水平，藻藍(lán)蛋白和松花粉的復(fù)配促進(jìn)了有益菌（Bacteroidales_S24-7_group，Lachnospiraceae和Ruminococcaceae）的定植，并降低條件致病菌（Clostridiaceae_1，Clostridiales_vadinBB60_group和Coriobacteriaceae）的相對(duì)豐度，這些都有益于提高人體免疫力，并降低與條件致病菌相關(guān)疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，大大促進(jìn)人體健康。因此，藻藍(lán)蛋白和松花粉的復(fù)配產(chǎn)品，可以用以改善腸道菌群，提高免疫力，減少腸道相關(guān)疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，維持人體健康。