菌酶聯(lián)合制備豬血抗氧化低聚肽

安攀宇，肖嵐，何佩蕓，謝巧，黎蘋(píng)，黃曉紅

（四川旅游學(xué)院食品學(xué)院，四川成都610100）

豬血是豬屠宰行業(yè)的副產(chǎn)物，我國(guó)作為世界養(yǎng)豬大國(guó)，豬血資源豐富，但開(kāi)發(fā)利用較落后[1]，不僅浪費(fèi)了生物資源也造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，因此開(kāi)發(fā)利用豬血蛋白資源受到了廣泛重視。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外利用豬血制備抗氧化肽的研究較多，如張鳳英等[2]采用不同的蛋白酶對(duì)豬血紅蛋白進(jìn)行酶解，得出中性蛋白酶酶解豬血紅蛋白得到的產(chǎn)物抗氧化活性最好，還原力為0.432。唐雯倩等[3]利用超聲波輔助胰蛋白酶水解豬血血紅蛋白制備抗氧化肽，DPPH·最高清除率為75.78%?？鬃挎璠4]以豬血紅蛋白為原料，研究7種蛋白酶水解制備抗氧化肽的工藝，胃蛋白酶的水解度和還原力最佳，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化所得酶解液的還原力為2.665。本試驗(yàn)擬將枯草芽孢桿菌發(fā)酵法和堿性蛋白酶酶解法結(jié)合，建立一個(gè)優(yōu)化的菌酶聯(lián)合制備豬血抗氧化肽的方案，選取7種體外抗氧化活性指標(biāo)（·OH清除率、·O2-清除率，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力、還原力、ABTS＋·清除率、DPPH·清除率、總抗氧化力）綜合評(píng)價(jià)枯草芽孢桿菌發(fā)酵、堿性蛋白酶水解、分子量大小對(duì)豬血抗氧化低聚肽活性的影響，篩選出豬血抗氧化低聚肽的最佳制備方法，以期獲得活性較高的豬血抗氧化低聚肽，為其在食品添加劑、醫(yī)療、保健用品等的開(kāi)發(fā)利用上提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬血：成都伍田食品有限公司；枯草芽孢桿菌（SICC.197.）：四川省微生物資源平臺(tái)菌種保藏中心；堿性蛋白酶（酶活力為85.61 U/g）：上海Kayon公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

挑取活化后的枯草芽孢桿菌，接入裝有50 mL液體培養(yǎng)基[5]的錐形瓶中，放在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為35℃，轉(zhuǎn)速135 r/min，培養(yǎng)12 h，得到種子培養(yǎng)液（1×109cfu/mL）。

1.2 儀器與設(shè)備

HHS-8S電子恒溫不銹鋼水浴鍋：上海光地儀器設(shè)備有限公司；UV Power紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京萊伯泰科儀器有限公司；H2050R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司；QYC-2102C恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FD-1冷凍干燥機(jī)：北京德天佑科技發(fā)展有限公司；GZ-150-S生化培養(yǎng)箱：韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司；GM-0.33隔膜真空泵：天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；超濾管（截留分子量分別為5 000、1 000 Da）：德國(guó)Sartorius公司。

1.3 試驗(yàn)方法[6]

1.3.1 枯草芽孢桿菌發(fā)酵豬血工藝的優(yōu)化

1.3.1.1 單因素試驗(yàn)

選取發(fā)酵時(shí)間、底物濃度、枯草芽孢桿菌接種量3個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1）發(fā)酵時(shí)間的確定：在250 mL錐形瓶中配置濃度為70 g/L的豬血液100 mL，121℃，高壓滅菌20 min，接入1∶40（體積比）的種子液，35℃135 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng) 48、60、72、84、96 h。

2）底物濃度的確定：在250 mL錐形瓶中分別配置濃度 30、50、70、90、110 g/L 的豬血液 100 mL，121 ℃，高壓滅菌20 min，接入1∶40（體積比）的種子液，35℃，135 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 h。

3）接種量的確定：在250 mL錐形瓶中配置濃度為70 g/L的豬血血液100 mL，121℃，高壓滅菌20 min，按體積比分別接入 1∶100，1∶50，3∶100，1∶25，1∶20 的種子液，35℃，135 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 h。

1.3.1.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以·OH清除率作為響應(yīng)值，對(duì)豬血液態(tài)發(fā)酵中的發(fā)酵底物濃度、發(fā)酵時(shí)間、枯草芽孢桿菌接種量3個(gè)因素進(jìn)行三因素三水平的Box-Behnken Design（BBD）響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，得出制備豬血抗氧化低聚肽的最佳發(fā)酵工藝。

1.3.2 酶解豬血發(fā)酵液工藝的優(yōu)化

1.3.2.1 單因素試驗(yàn)

將最優(yōu)條件下制備的豬血發(fā)酵解液于6 000 r/min離心15 min得上清液，研究酶解溫度、酶解時(shí)間、pH值、酶底比對(duì)上清液多肽含量的影響。

1）酶解溫度：100 mL 發(fā)酵上清液分別為 45、50、55、60、65℃，pH 9.5，酶底比為250 U/g的條件下酶解3 h。

2）酶解時(shí)間：100 mL發(fā)酵上清液在55℃，pH9.5，酶底比為 250 U/g的條件下分別酶解 1、2、3、4、5 h。

3）pH值：100 mL發(fā)酵上清液在55℃，pH值分別為 9.0、9.5、10.0、10.5、11.0，酶底比為 250 U/g條件下酶解3 h。

4）酶底比：100mL發(fā)酵上清液在 55℃，pH9.5，酶底比分別為 50、150、250、350、450 U/g的條件下酶解 3 h。

1.3.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以酶解時(shí)間、pH值、酶解溫度、酶底比為影響因素，多肽含量為響應(yīng)值，通過(guò)四因素三水平的Box-Behnken Design（BBD）響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化酶解工藝。

1.3.3 超濾制備豬血肽

酶解后的發(fā)酵液于4℃，6 000 r/min高速離心20 min，取其上清液，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，去除菌體及殘?jiān)徊捎媒亓舴肿恿繛?、1 kDa的超濾離心管對(duì)膜過(guò)濾液進(jìn)行分離（4 000 r/min，10 min），收集各超濾組分冷凍干燥，測(cè)定其抗氧化指標(biāo)的IC50。

1.3.4 相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

1.3.4.1 多肽含量的測(cè)定

參照陳昌琳[7]的方法，使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定上清液蛋白質(zhì)含量，計(jì)為上清液中多肽含量。

1.3.4.2 體外抗氧化活性的測(cè)定

·OH清除率測(cè)定參照TIAN F等[8]的方法、·O2-清除能力測(cè)定參照殷微微等[9]的方法，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力測(cè)定參照Chen Naifu等[10]方法、還原力測(cè)定參照劉昭明等[11]的方法、ABTS＋·清除率測(cè)定參照潘瑤等的[12]方法、DPPH·清除率測(cè)定參照朱夕波等[13]的方法、總抗氧化力測(cè)定參照YANG M等[14]的方法。

1.3.4.3 半抑制濃度（IC50）值的測(cè)定

將凍干樣品稀釋成不同濃度（試驗(yàn)點(diǎn)≥5），分別測(cè)定其·OH清除率、·O2-清除率、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力、還原力、ABTS＋·清除率、DPPH·清除率、總抗氧化力。以樣品濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，繪制成圓滑曲線(xiàn)，根據(jù)曲線(xiàn)計(jì)算IC50值。

2 結(jié)果分析

2.1 枯草芽孢桿菌發(fā)酵豬血工藝優(yōu)化的結(jié)果

2.1.1 枯草芽孢桿菌發(fā)酵豬血單因素試驗(yàn)結(jié)果

發(fā)酵時(shí)間、底物濃度和接種量對(duì)·OH清除率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 發(fā)酵時(shí)間、底物濃度和接種量對(duì)·OH清除率的影響Fig.1 The effect of fermentation time，substrate concentration and inoculumssize on·OH scavenging rate

發(fā)酵時(shí)間對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵上清液·OH清除率的影響，如圖1A所示，發(fā)酵上清液·OH清除率呈先升高后下降趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為60 h時(shí)達(dá)到最高值60.22%，與·OH清除率最低值差異顯著（p＜0.01）。底物濃度對(duì)發(fā)酵上清液·OH清除率的影響如圖1B所示，發(fā)酵上清液·OH清除率隨底物濃度的增加先上升后下降，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0 g/L時(shí)達(dá)到最高值61.58%，底物濃度對(duì)·OH清除率影響顯著（p＜0.05）。接種量對(duì)上清液·OH清除率的影響如圖1C所示，發(fā)酵上清液·OH清除率隨接種量增加顯著提高（p＜0.05），在接種量達(dá)到3∶100（體積比）時(shí)達(dá)到最高值64.49%，之后再增加接種量，·OH清除率下降。

2.1.2 枯草芽孢桿菌發(fā)酵豬血響應(yīng)面試驗(yàn)

利用Design Expert軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。對(duì)該模型進(jìn)行方差分析見(jiàn)表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Design and results of response surface test

表2 方差與顯著性分析Table 2 Analysis of variance and significance test

如表2所示，所選模型的Prob＞F值0.000 9（＜0.01），即為不同處理組間差異極顯著，說(shuō)明用回歸方程描述各因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系時(shí)，其應(yīng)變量與全體自變量之間的線(xiàn)性關(guān)系顯著，即該試驗(yàn)方法可靠。該模型中，A、B、C、AB、AC、B2、C2對(duì)發(fā)酵上清液·OH 清除率影響顯著，即底物濃度、發(fā)酵時(shí)間、接種量、底物濃度和發(fā)酵時(shí)間的交互作用以及底物濃度和接種量的交互作用對(duì)發(fā)酵上清液的·OH清除率有顯著影響。且影響程度大小為，接種量＞底物濃度＞發(fā)酵時(shí)間。

該模型失擬項(xiàng)的Prob＞F值為0.684 7（＞0.05），即失擬項(xiàng)差異不顯著，說(shuō)明該方程對(duì)試驗(yàn)擬合情況好，試驗(yàn)誤差小。該模型擬合度R2=0.949 9，校正擬合度R2=0.885 4表示該模型能夠解釋·OH清除率有94.99%的變化來(lái)源于所選變量，說(shuō)明該模型適合用于研究底物濃度、發(fā)酵時(shí)間和接種量3個(gè)因素的變化對(duì)豬血發(fā)酵上清液·OH清除率的影響和預(yù)測(cè)分析。僅總變異約12%不能用此模型來(lái)解釋?zhuān)材芎侠淼卣f(shuō)明校正擬合度R2=0.885 4的變化。信噪比為10.320，大于4，回歸方程擬合度和可信度較高。對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析，以發(fā)酵上清液·OH清除率為響應(yīng)值（Y），得到各因素對(duì)響應(yīng)置的二次多項(xiàng)回歸方程為：

由方程預(yù)測(cè)得到最佳發(fā)酵條件是底物濃度59.07 g/L，發(fā)酵時(shí)間 56.4 h，接種量3.22∶100（體積比），此時(shí)·OH清除率為78.94%。根據(jù)所得的分析數(shù)據(jù)進(jìn)行3組重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，此條件下得到豬血發(fā)酵上清液·OH清除率為77.48%，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，偏差不大，證明預(yù)測(cè)結(jié)果合理可靠。

通過(guò)回歸方程所作出響應(yīng)面曲面圖及等高線(xiàn)見(jiàn)圖2和圖3。

圖2 底物濃度與發(fā)酵時(shí)間交互作用對(duì)·OH清除率影響的響應(yīng)曲面圖及等高線(xiàn)圖Fig.2 Response surface map and contour map of the interaction of substrate concentration and fermentation time on·OH scavenging rate

可直觀(guān)反映底物濃度與發(fā)酵時(shí)間交互作用以及底物濃度與接種量對(duì)發(fā)酵上清液·OH清除率的影響，且響應(yīng)面曲面坡度較陡，說(shuō)明交互作用對(duì)響應(yīng)值影響較顯著，與表2結(jié)果一致。

如圖3所示，兩因素之間的影響基本呈拋物線(xiàn)型關(guān)系，且均有一個(gè)極大值點(diǎn)。從圖2和圖3中可以看出，隨著底物濃度的增大，豬血發(fā)酵上清液中的·OH清除率逐漸增大；隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，·OH清除率呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢(shì)。分析其原因，可能是因?yàn)殡S著發(fā)酵延長(zhǎng)，由于底物消耗殆盡，因此產(chǎn)生的豬血抗氧化肽含量達(dá)到極值后不再增加反而開(kāi)始降低，因此對(duì)于·OH清除率也呈現(xiàn)出相同趨勢(shì)。等高線(xiàn)呈圓形說(shuō)明兩因素交互作用不顯著，呈橢圓或者馬鞍形則表明交互作用顯著，該結(jié)果均與回歸模型方差分析表一致。

圖3 底物濃度與接種量交互作用對(duì)·OH清除率影響的響應(yīng)曲面圖及等高線(xiàn)圖Fig.3 Response surface map and contour map of the interaction of substrate concentration and inoculum concentration on·OH scavenging rate

2.2 酶解豬血發(fā)酵液工藝優(yōu)化的結(jié)果

2.2.1 酶解豬血發(fā)酵液?jiǎn)我蛩卦囼?yàn)結(jié)果

酶解溫度、酶解時(shí)間、pH值和酶底比對(duì)多肽含量的影響見(jiàn)圖4。

圖4 酶解溫度、酶解時(shí)間、pH值和酶底比對(duì)多肽含量的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature、enzymatic hydrolysis time、pH and enzyme/substrate on polypeptide content

由圖4A可知，多肽含量隨溫度的增高呈先上升后下降趨勢(shì)，當(dāng)溫度達(dá)到65℃時(shí)，多肽含量最高2.92mg/mL，溫度對(duì)多肽含量的影響不顯著（p>0.05）。由圖4B可知，隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)多肽含量增加，酶解時(shí)間3 h時(shí)，多肽含量最高，為3.01 mg/mL，之后隨酶解時(shí)間延長(zhǎng)，多肽含量降低，酶解時(shí)間對(duì)多肽含量的影響不顯著（p>0.05）。由圖4C可知，隨著pH值升高多肽含量呈先上升后下降趨勢(shì)，pH值為9.5時(shí)，多肽含量最高，為3.01 mg/mL，pH值對(duì)多肽含量的影響不顯著（p>0.05）。由圖4D可知，多肽含量隨酶底比增加而快速增加，酶底比為350 U/g時(shí)，多肽含量達(dá)到最高3.42 mg/mL，隨后降低，酶底比對(duì)多肽含量的影響不顯著（p>0.05）。

2.2.2 酶解豬血發(fā)酵液響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用四因素三水平對(duì)酶解液多肽含量進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface test

續(xù)表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Continue table 3 Design and results of response surface test

表4 方差與顯著性分析Table 4 Analysis of varlance and significance test

如表4所示，所選模型的Prob＞F值＜0.0001，即為不同處理組間差異極顯著，說(shuō)明用回歸方程描述各因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系時(shí)，其應(yīng)變量與全體自變量之間的線(xiàn)性關(guān)系顯著，即該試驗(yàn)方法可靠。該模型中，A、D、AC、BD、A2、B2、C2和 D2對(duì)多肽含量影響顯著，即酶解時(shí)間、酶底比、酶解時(shí)間與酶解溫度、pH值與酶底比的交互作用對(duì)酶解液的多肽含量有顯著影響。

該模型失擬項(xiàng)的Prob＞F值為0.079 4（＞0.05），即失擬項(xiàng)差異不顯著，說(shuō)明該方程對(duì)試驗(yàn)擬合情況好，試驗(yàn)誤差小。該模型擬合度R2=0.975 3，校正擬合度R2=0.950 5表示該模型能夠解釋·OH清除率有97.53%的變化來(lái)源于所選變量，說(shuō)明該模型適合用于研究酶解時(shí)間、酶底比、酶解溫度以及pH值4個(gè)因素的變化對(duì)豬血酶解液的多肽含量的影響和預(yù)測(cè)分析。僅總變異約5%不能用此模型來(lái)解釋?zhuān)材芎侠淼卣f(shuō)明校正擬合度R2=0.950 5的變化。信噪比20.568，大于4，回歸方程擬合度和可信度較高。

對(duì)表4中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析，以豬血酶解液的多肽含量響應(yīng)值（Y），得到各因素對(duì)響應(yīng)值的二次多項(xiàng)回歸方程為：

通過(guò)多肽含量模型的二元多次回歸方程所作的響應(yīng)面曲面圖見(jiàn)圖5、圖6，分別表示酶解時(shí)間與酶解溫度及pH值與酶底比交互作用對(duì)酶解液多肽含量的影響。響應(yīng)曲面坡度較大，說(shuō)明響應(yīng)值對(duì)于處理?xiàng)l件較敏感，與表4結(jié)果一致。

圖5 酶解時(shí)間和酶解溫度交互作用對(duì)多肽含量影響的響應(yīng)曲面圖及等高線(xiàn)圖Fig.5 Response surface map and contour map of the interaction of enzyme Time and enzyme temperature on polypeptide content

圖6 pH值和酶底比交互作用對(duì)多肽含量影響的響應(yīng)曲面圖及等高線(xiàn)圖Fig.6 Response surface map and contour map of the interaction of pH and enzyme/substateon polypeptide content

如圖5所示，兩因素之間的影響基本呈拋物線(xiàn)型關(guān)系，且均有一個(gè)極大值點(diǎn)。從圖中可以看出，多肽含量隨著酶解溫度的升高和酶解時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。這可能是由于酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，溫度升高使多肽水解成氨基酸，導(dǎo)致酶解液多肽含量降低。由圖6可知，多肽含量隨著酶底比和pH值增大而呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)榈鞍酌赶鄬?duì)濃度較高時(shí)，過(guò)堿性環(huán)境對(duì)蛋白酶活性抑制作用不明顯。

由方程預(yù)測(cè)得到最佳酶解條件是酶解時(shí)間3.16 h，pH 9.48，酶解溫度59.68℃，酶底比387.73 U/g，此時(shí)多肽含量為5.473 3 mg/mL。根據(jù)所得的分析數(shù)據(jù)進(jìn)行3組重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，此條件下得到豬血酶解液中多肽含量為5.481 4 mg/mL，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，偏差不大，證明預(yù)測(cè)結(jié)果合理可靠。

2.3 不同分子量段豬血抗氧化肽體外抗氧化活性比較

豬血抗氧化肽粗提液經(jīng)5、1 kDa超濾離心管超濾分級(jí)后，各分子量段抗氧化肽活性測(cè)定結(jié)果如表7所示。

表7 不同分子量抗氧化肽體外抗氧化活性的IC50值Table 7 IC50values of antioxidative peptides in different molecular weight

由表7可知，不同分子量段的豬血肽均具有抗氧化的能力，然而對(duì)不同的抗氧化指標(biāo)表現(xiàn)出不同的抗氧化能力；不同分子量段豬血肽的同一抗氧化指標(biāo)也不相同，分子量在0～1 kDa的肽段的抗氧化指標(biāo)的IC50最小，說(shuō)明高活性的豬血抗氧化肽分子量集中在1 kDa以下。

3 結(jié)論與討論

3.1 討論

目前，酶解法和發(fā)酵法制備活性多肽的工藝比較流行[5]。從本質(zhì)上講，兩種方法都是利用蛋白酶的酶解作用產(chǎn)生目的肽段，但又各有不足。采用菌酶聯(lián)合制備方式，可降低商業(yè)酶的使用量[6]，同時(shí)彌補(bǔ)微生物發(fā)酵水解程度低的不足。本試驗(yàn)采用菌酶聯(lián)合制備豬血抗氧化低聚肽，可使發(fā)酵液多肽含量從2.31 mg/mL顯著提高到5.48 mg/mL[1]。

抗氧化肽的抗氧化活性由其相對(duì)分子質(zhì)量、肽段的氨基酸組成序列和空間構(gòu)造決定。分離純化單一的抗氧化活性肽不僅成本較高，且產(chǎn)量較低，有研究證明低聚肽內(nèi)部可能發(fā)生協(xié)同效應(yīng)[15]，因此，本試驗(yàn)研究了不同分子量段的豬血低聚肽的抗氧化活性，結(jié)果證明0～1 kDa豬血低聚肽的抗氧化活性?xún)?yōu)于其他分子量段的豬血低聚肽，這與杜欣[6]研究結(jié)果相似，可能是因?yàn)橹挥挟?dāng)肽達(dá)到適當(dāng)?shù)姆肿恿繒r(shí)，這些供氫基團(tuán)才能得到最大的暴露與自由基作用而發(fā)揮抗氧化作用[16]，但具體的作用機(jī)制與抗氧化活性的關(guān)系還有待在后續(xù)研究中進(jìn)一步探討。

3.2 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化得到菌酶聯(lián)合制備豬血抗氧化低聚肽的最優(yōu)工藝條件為：底物濃度59.0 g/L，發(fā)酵時(shí)間 56.5 h，接種量 3.22∶100（體積比）此時(shí)多肽含量為2.31 mg/mL，·OH清除率為78.94%；酶解時(shí)間 3.0 h、pH 9.5、酶解溫度 60 ℃、酶底比 390 U/g[2]，此條件下制備得到酶解液多肽含量5.48 mg/mL，多肽含量較單一發(fā)酵提高2.39倍，·OH清除率為93.62%。

采用超濾法分離得到分子量為0～1 kDa、1 kDa～5 kDa和0～5 kDa的豬血抗氧化低聚肽，采用·OH清除率、·O2-清除能力，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力、還原力、ABTS＋·清除率、DPPH·清除率、總抗氧化力7種體外抗氧化指標(biāo)比較3種不同分子量段的豬血低聚肽的抗氧化活性，結(jié)果表明：3種不同分子量段抗氧化肽活性大小為 0～1 kDa＞ 0～5 kDa＞ 1 kDa～5 kDa，說(shuō)明高活性的豬血抗氧化肽分子量集中在1 kDa以下。