優(yōu)化HPLC測定黑皮雞樅菌中氨基酸含量樣品處理的條件

李艷

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050018；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北石家莊050018）

黑皮雞樅菌（Termitomyces spp.）屬于擔(dān)子菌綱，傘菌目，側(cè)耳科，雞樅菌屬，是珍貴的野生食用菌，全世界約有25種，我國有19種，主要生長在云南、四川、貴州等地[1]。自然界中雞樅菌只能生長在白蟻巢穴上，白蟻菌圃中含有豐富的氨基酸等營養(yǎng)活性物質(zhì)[2-3]，與白蟻共生的野生雞樅菌同樣營養(yǎng)豐富，尤其蛋白質(zhì)的含量較高，蛋白質(zhì)中含有豐富的氨基酸，其中人體必需的8種氨基酸種類齊全[4-5]。同時，與白蟻的復(fù)雜共生關(guān)系使人工栽培的雞樅菌與野生雞樅菌存在或多或少的差異。近年，雞樅菌的人工栽培技術(shù)趨于成熟，研究人工栽培雞樅菌中氨基酸的組成對于評價人工栽培雞樅菌技術(shù)具有重要的指導(dǎo)意義。

氨基酸是雞樅菌中重要的營養(yǎng)物質(zhì)，目前對食用菌中氨基酸的測定主要通過對樣品進(jìn)行酸水解處理，再通過氨基酸分析儀檢測[1-2，6]。在酸性水解中，HCl是最通用的水解劑，但是酸水解過程中會不同程度的破壞半胱氨酸、絲氨酸和酪氨酸，并完全破壞色氨酸[7-8]。氨基酸分析儀檢測存在成本高，專屬性強(qiáng)，普及率低等問題對實際操作造成諸多不便[9-10]。本研究通過正交試驗優(yōu)化酸水解條件[11]，結(jié)合堿水解[12]和過甲酸氧化法[9]，對河北省靈壽縣和北京地區(qū)栽培的黑皮雞樅菌進(jìn)行水解處理，采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定和分析兩個地區(qū)產(chǎn)黑皮雞樅菌中不同部位的氨基酸組成，為黑皮雞樅菌選擇性進(jìn)行深加工產(chǎn)品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

新鮮黑皮雞樅菌（Termitomyces spp.）：分別由河北靈濟(jì)食用菌有限公司和北京金珠滿江農(nóng)業(yè)有限公司提供。將雞樅菌子實體的菌傘、菌柄分離后分別切成細(xì)絲狀，置于鼓風(fēng)干燥箱中55℃干燥至恒重，粉碎，過40目篩，備用。

天門冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、羥基脯氨酸（Hyp）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酰胺（Gln）、絲氨酸（Ser）、精氨酸（Arg）、甘氨酸（Gly）、蘇氨酸（Thr）、脯氨酸（Pro）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、胱氨酸（Cys-S）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）、組氨酸（His）、半胱氨酸（Cys）、賴氨酸（Lys）和酪氨酸（Tyr）：美國 sigma公司，純度均≥98%；色譜級甲醇和乙腈：湖北杜文化工科技有限公司；2，4-二硝基氟苯：艾科化學(xué)試劑公司；磷酸二氫鉀、無水乙酸鈉、冰乙酸、三乙胺、硼砂、硼酸、氫氧化鈉均為分析純；試驗用水為娃哈哈純凈水。

1.2 儀器

DWF-100型電動植物粉碎機(jī)：河北省黃驊縣科研機(jī)械廠；101-0AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；Waters 2695高效液相色譜儀配有Wa ters 2695分離單元，2996型二極管陣列檢測器：沃特斯科技（上海）有限公司；Hypersil ODS2色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：大連依利特分析儀器有限公司。

2 方法

2.1 主要溶液的配制

pH 9.0硼酸緩沖溶液：配制0.05 mol/L的硼砂溶液和0.2 mol/L的硼酸溶液，按照體積比4∶1混合均勻。

pH 7.0磷酸緩沖溶液：稱取1.7 g磷酸二氫鉀固體，加水溶解，轉(zhuǎn)入500 mL容量瓶中，加入72.75 mL的0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液，定容后搖勻。

衍生試劑的配制：準(zhǔn)確量取0.5 mL的2，4-二硝基氟苯，用乙腈定容至50 mL。

氨基酸標(biāo)品的制備：稱取0.05 g氨基酸標(biāo)品用pH 9.0硼酸緩沖溶液定容至10 mL，得到5 mg/mL氨基酸標(biāo)品母液。取氨基酸標(biāo)品母液各0.5 mL于25 mL容量瓶中，用pH 9.0硼酸緩沖溶液定容，得到100 μg/mL氨基酸對照品混標(biāo)溶液。

過甲酸溶液：將30%的過氧化氫與88%甲酸按照體積比1∶9均勻混合，于室溫下放置1 h后置于冰水浴中冷卻30 min，用時現(xiàn)配。

2.2 樣品處理

對于不同種類的氨基酸，試驗中采用3種水解方法對其進(jìn)行預(yù)處理，其中酸水解法適用于大部分氨基酸的水解，堿水解法適用于色氨酸分析，而過甲酸氧化法則適用于胱氨酸測定。

2.2.1 酸水解法

參考GB/T 5009.124-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測定》中樣品的處理方法，在以HCl濃度（mol/L）、HCl加入量（mL）、水解溫度（℃）、水解時間（h）為影響因素的最佳單因素試驗數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，設(shè)計L9（34）正交試驗。因素水平表見表1。

表1 酸水解正交試驗因素水平表Table 1 Table of acid hydrolysis orthogonal test factor level

2.2.2 堿水解法

精確稱取黑皮雞樅菌粉25 mg（精確到0.000 1 g），置于10 mL水解管內(nèi)，加入5 mol/L NaOH溶液6 mL，氮吹儀吹氮氣15 min后迅速封管；放入烘箱中110℃水解24 h；將水解后樣品從水解管中轉(zhuǎn)入蒸發(fā)皿中，并用水多次洗滌水解瓶，洗液一并轉(zhuǎn)入蒸發(fā)皿，80℃水浴蒸干；用pH 9.0硼酸緩沖溶液分別多次洗滌蒸發(fā)皿，洗液轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，pH 9.0硼酸緩沖溶液定容；用0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

2.2.3 過甲酸氧化法

過甲酸氧化法借鑒于淑新等在高效液相色譜-柱前衍生化法測定飼料中的含硫氨基酸中應(yīng)用的方法[9]。

2.3 氨基酸柱前衍生法

采用2，4-二硝基氟苯為柱前衍生試劑。取0.5 mL氨基酸混標(biāo)溶液至5 mL棕色容量瓶中，分別加入NaHCO3緩沖溶液和2，4-二硝基氟苯各0.5 mL，放入60℃水浴中，暗處反應(yīng)60 min。取出后避光冷卻至室溫，用pH 7.0磷酸緩沖溶液定容至5.0 mL，靜置15 min，取 10 μL 進(jìn)樣分析[13]。

2.4 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS2色譜柱250 mm×4.6 mm，5μm；流動相A：稱取3.56g無水乙酸鈉，溶于1 000 mL水中，加入0.1%三乙胺，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH 6.4。流動相 B：50%乙腈水；流速：1 mL/min；檢測波長：360 nm；柱溫：23 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；梯度洗脫程序：0～20 min，30%～36%B；20 min～26 min，36%～55%B；26 min～41 min，55%～65%；41 min～46 min，65%～90%B；46 min～48 min，90%～98%B；48 min～54 min，98%～30%B[13]。

2.5 數(shù)據(jù)處理

色譜分析采用儀器自帶Waters-Empower軟件。所有線性方程、重復(fù)性和準(zhǔn)確性試驗數(shù)據(jù)均由Excel 2010計算得出。正交試驗數(shù)據(jù)采用Minitab 15進(jìn)行方差分析。所有試驗進(jìn)行3組平行。

3 結(jié)果與分析

3.1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

取氨基酸對照品混標(biāo)溶液，配制成10、20、50、80、100μg/mL的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液，各水平進(jìn)行3次重復(fù)，以峰面積為縱坐標(biāo)，以氨基酸濃度為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，R2均大于0.999，氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程見表2。

表2 氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Table 2 The standard curve equation of amino acids

3.2 酸水解優(yōu)化結(jié)果

按照2.2.1中的方法進(jìn)行試驗，正交試驗結(jié)果和方差分析分別見表3和表4。

表3 黑皮雞樅菌酸水解正交試驗結(jié)果Table 3 Results of acid hydrolysis orthogonal test in Termitomyces spp.

續(xù)表3 黑皮雞樅菌酸水解正交試驗結(jié)果Continue table 3 Results of acid hydrolysis orthogonal test in Termitomyces spp.

表4 黑皮雞樅菌酸水解正交試驗方差分析表Table 4 Table of the variance analysis for acid hydrolysis orthogonal experimental in Termitomyces spp.

由表3和表4可看出，所篩選的4個試驗條件對結(jié)果的影響因素大小為HCl濃度＞HCl加入量＞水解溫度＞水解時間。其中HCl濃度和HCl加入量對于結(jié)果有極顯著影響，水解溫度、水解時間對于試驗結(jié)果影響不顯著。正交試驗中最優(yōu)組合為A2B2C2D2。正交試驗中第5組，即HCl濃度為6mol/L、HCl加量為4 mL、水解溫度120℃、水解時間20 h時測得的氨基酸總量最高，為20.1%。但是，第5組并不是最優(yōu)組合的結(jié)果，按照正交試驗中的最優(yōu)組合，即HCl濃度為6 mol/L、HCl加量為4 mL、水解溫度110℃、水解時間24 h為條件進(jìn)行驗證試驗[14]，水解后氨基酸總量達(dá)20.5%，因此確定為試驗的最優(yōu)條件，后續(xù)對不同批次黑皮雞樅菌中的氨基酸含量進(jìn)行測定時均采用該條件。

3.3 黑皮雞樅菌中氨基酸含量的測定

以優(yōu)化后的酸水解方案配合堿水解和過甲酸氧化法，對河北省靈壽縣和北京兩個產(chǎn)地栽培的黑皮雞樅菌中的氨基酸含量進(jìn)行測定，樣品分為子實體、菌傘和菌柄，結(jié)果見表5。

表5 不同地區(qū)黑皮雞樅菌菌柄、菌傘和子實體中氨基酸含量及組成Table 5 The content and composition of amino acids in pileus，stipe and sporophore of Termitomyces spp.in two different area

由表5可以看出，在兩個地區(qū)所栽培的黑皮雞樅菌中均檢測出除甘氨酸外21種氨基酸，鄒立扣[1]和施渺筱[6]分別對四川省和貴州省野生雞樅菌進(jìn)行氨基酸測定，均含有甘氨酸，這可能是人工栽培黑皮雞樅菌與野生雞樅菌存在的差異性。靈壽縣栽培的黑皮雞樅菌氨基酸總量稍低于北京地區(qū)產(chǎn)品，分別為21.51%和23.68%，說明存在地域差異。黑皮雞樅菌的不同部位氨基酸含量也存在差異，菌傘中的氨基酸含量方差分析表幾乎均高于菌柄，且菌傘中氨基酸總量均高出1.27倍左右，這與其他研究雞樅菌氨基酸測定的結(jié)果相一致[1，11]。本試驗測定的完整菌子實體指的是不將菌傘、菌柄分離，直接切成絲狀、干燥、粉碎、過篩的樣品，所測定各種氨基酸含量應(yīng)在菌傘、菌柄之間，但是表5中，菌子實體的賴氨酸、色氨酸、組氨酸等幾個氨基酸的含量略有偏差，但是均比較接近，這可能是由于樣品處理過程中的試驗誤差造成的。

續(xù)表5 不同地區(qū)黑皮雞樅菌菌柄、菌傘和子實體中氨基酸含量及組成Continue table 5 The content and composition of amino acids in pileus，stipe and sporophore of Termitomyces spp.in two different area

靈壽縣和北京市栽培黑皮雞樅菌中均檢測到的21種氨基酸中，包含8種人體必需氨基酸、1種嬰兒必需氨基酸和3種鮮味氨基酸。8種人體必需氨基酸的總量分別為7.77%和9.01%，分別占氨基酸總量的36.12%和38.05%；組氨酸是嬰兒必需氨基酸，其含量分別為4.54%和5.06%，達(dá)到氨基酸總量的21.11%和21.37%；3種鮮味氨基酸指谷氨酸、天冬氨酸和丙氨酸，它們的總量分別為5.19%和5.22%，分別占氨基酸總量的24.13%和22.04%。相對于已有報道的食用菌中氨基酸含量的檢測結(jié)果，無論從氨基酸種類還是含量上來說，黑皮雞樅菌都是一種具有競爭優(yōu)勢的高氨基酸營養(yǎng)價值的食用菌[15-16]。Kwang Jae Lee等[17]測定了茶樹菇及其他食用菌中的氨基酸組成與含量，由于只采用了酸水解法對樣品進(jìn)行處理，均未檢測到色氨酸和胱氨酸，并且所測定食用菌中必需氨基酸的總量均小于3%，氨基酸總量均小于6%；高燕紅等[18]對6種食用菌中氨基酸與蛋白質(zhì)進(jìn)行了分析，其中姬松茸中的氨基酸總量最高，達(dá)到25.07%，其次為冬菇，氨基酸總量為15.96%，云耳、銀耳等其他4種食用菌的氨基酸總量均在10%以下，遠(yuǎn)低于本試驗所測黑皮雞樅菌中氨基酸的總量，這充分說明這兩個地區(qū)人工栽培的黑皮雞樅菌氨基酸種類和含量豐富，營養(yǎng)價值高。

靈壽縣和北京市人工栽培的黑皮雞樅菌中粗蛋白含量分別是35.33%和42.13%，氨基酸總量分別占其粗蛋白含量的60.88%和56.21%，必需氨基酸與總氨基酸比值（essential amino acid/total amino acid，EAA/TAA）分別為36.12%、38.05%，必需氨基酸與非必需氨基酸比值（essential amino acid/nonessential amino acid，EAA/NEAA）分別為56%和61%，與聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）/世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）推薦的理想蛋白質(zhì)模式EAA/TAA為40%和EAA/NEAA為0.6接近[19]。因此，黑皮雞樅菌中氨基酸的模式與人體所需氨基酸模式相似，是一種適合人體吸收的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來源。所測黑皮雞樅菌中含量較高的氨基酸是組氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸和天冬氨酸，組氨酸在嬰兒體內(nèi)不能自己合成，是嬰兒必需氨基酸，苯丙氨酸和賴氨酸屬于人體所需8種必需氨基酸，谷氨酸和天冬氨酸是對鮮味有影響的特征氨基酸。由此可以看出，黑皮雞樅菌具有較高的營養(yǎng)價值和開發(fā)價值。

本研究采用了3種水解法檢測黑皮雞樅菌中的氨基酸，共檢測出21種氨基酸，目前研究中對雞樅菌氨基酸的檢測主要集中在以酸水解為主，用氨基酸分析儀檢測，酸水解并不能夠全面檢測出氨基酸的種類。如施渺筱等[4]在黔產(chǎn)雞樅菌中檢測出的氨基酸16種；張靈芝等[19]在云南產(chǎn)雞樅菌中檢測出17種氨基酸；鄒立扣等[1]在四川省生長的10種雞樅菌中檢測出17種氨基酸。因此，本試驗所建立的雞樅菌水解處理的方法是可行可靠的。

4 結(jié)論

研究采用了酸水解法、堿水解法和過甲酸氧化法分別對靈壽縣和北京市栽培的新鮮黑皮雞樅菌進(jìn)行3種方法水解，并對酸水解條件進(jìn)行正交試優(yōu)化，結(jié)果顯示在HCl濃度為6 mol/L、HCl加入量為4 mL、水解溫度110℃、水解時間24 h為水解條件時，能夠獲得較高的氨基酸含量。對3種方法水解后的水解液以2，4-二硝基氟苯作為柱前衍生劑進(jìn)行HPLC法檢測，共測出21種氨基酸，北京市所產(chǎn)黑皮雞樅菌氨基酸含量稍高于靈壽縣，菌傘中氨基酸含量高于菌柄中。黑皮雞樅菌氨基酸EAA/TAA、EAA/NEAA表明其蛋白質(zhì)屬于優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。通過3種水解方法結(jié)合處理樣品可以更全面的檢測雞樅菌中的氨基酸，為后續(xù)對雞樅菌乃至其他食用菌類氨基酸的研究提供了理論支撐。對子實體、菌傘和菌柄分別測定對于后續(xù)有選擇性的進(jìn)行深加工產(chǎn)品開發(fā)具有指導(dǎo)意義。