野生黨參蘆頭與參尾的質(zhì)量評價研究

李瑞燕，來麗娜，楊雪，王軍霖

（長治醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，山西長治046000）

黨參是桔梗科植物黨參的根，入藥時，洗凈泥沙后潤透去蘆、切片或切段[1]。古代以山西上黨地區(qū)出產(chǎn)的黨參為上品，具有補中益氣、健脾益肺的功能，可用于治療脾肺氣虛、食少倦怠、咳嗽虛喘、氣血不足、面色萎黃、心悸氣短、津傷口渴，內(nèi)熱消渴[2]。蘆身擅長補氣血，而蘆頭則補氣之力稍小，有涌吐風(fēng)痰的作用，因此“自古參蘆不入藥”，恐系古人誤以為參蘆有催吐作用[3]。而國內(nèi)學(xué)者對人參蘆頭的研究發(fā)現(xiàn)涌吐、耗氣的記載缺乏理論依據(jù)，化學(xué)成分與主根相似，臨床也有與主根相同的補益作用[4]。黨參，作為特大宗藥食兩用品種，長期以來人們也是遵從藥典將黨參去蘆頭使用。而前期研究報道甘肅產(chǎn)黨參蘆頭中參炔苷含量不低于參體中的含量，和參尾中的含量也并無太大差異[5]。秦蕾[6]也報道黨參根和蘆頭所含化學(xué)成分相似，含量有所差異，證明了黨參蘆頭具有保健及營養(yǎng)價值，闡明了將黨參去蘆頭使用會造成黨參資源的極大浪費。

因此，本試驗擬首次通過研究潞城產(chǎn)多年野生黨參蘆頭與參尾的特征圖譜，同時對其中所含的多種活性成分的含量進行分析比較，旨在全面綜合評價黨參蘆頭和參尾的質(zhì)量，為指導(dǎo)黨參蘆頭和參尾合理有效的利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

多年野生黨參藥材采自山西省潞城市北莊村。洗凈曬干，切下蘆頭和參尾，采用3點法取樣，隨機分成3批。黨參藥材均由長治醫(yī)學(xué)院生藥教研室史琳婧老師鑒定，野生黨參蘆頭和參尾外觀見圖1。

圖1 野生黨參蘆頭和參尾外觀圖Fig.1 Appearance of rhizomes and sterns of wild Radix Codonopsis

黨參炔苷對照品（HPLC≥98%，批號：111732-201607）、5-羥甲基糠醛對照品（HPLC≥98%，批號：111626-201610）、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（批號：111978-201501）：中國食品藥品檢定研究院；D-無水葡萄糖：上海源葉生物科技有限公司；試驗用水為雙蒸水：由長治醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系綜合實驗室自制；乙腈、甲醇：色譜純；其他試劑均為市售分析純。

Agilent 1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）系統(tǒng)（配備 Agilent G1311四元液相泵、手動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器）：美國安捷倫公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；BSA124S電子天平、FW80型高速萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；AS-20500A超聲波清洗器：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；精密移液器：上海榮泰生化工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（4.6mm×250 mm，5 μm），檢測波長：220 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃；流動相為乙腈（A）-0.5%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，10%A；10 min～40 min，10%～30%A；40 min～60 min，30%～50%A；60 min～70 min，50%～90%A；70 min～80 min，90%A）；進樣量：20 μL。

1.2.2 對照品溶液的制備

精密稱定黨參炔苷對照品12.3 mg，加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移并定容至10 mL容量瓶中，搖勻，制成質(zhì)量濃度為1.23 mg/mL的黨參炔苷對照品儲備液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.3 供試品溶液的制備

取過80目篩的野生黨參蘆頭和參尾粉末各約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇25 mL，超聲輔助（40 kHz，500 W）提取 30 min，放冷過濾，藥渣重復(fù)提取1次，過濾，用甲醇少量多次潤洗錐形瓶，合并濾液，旋蒸濃縮，浸膏再用甲醇超聲溶解，定容至5 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液備用。

1.2.4 方法學(xué)驗證

1.2.4.1 空白溶劑的考察

取甲醇溶劑，在“1.2.1”項下色譜條件進樣，結(jié)果表明空白溶劑無干擾。

1.2.4.2 精密度試驗

取“1.2.3”項下制備的黨參參尾供試品溶液，按“1.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，以黨參炔苷峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果各共有峰相對保留時間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）小于 0.95%，相對峰面積的RSD小于2.32%，表明儀器的精密度良好。

1.2.4.3 重復(fù)性試驗

取過80目篩的野生黨參參尾粉末適量，按“1.2.3”項下方法平行制備黨參參尾供試品溶液6份，按“1.2.1”項下色譜條件進樣測定，以黨參炔苷峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果各共有峰相對保留時間RSD小于0.61%，相對峰面積的RSD小于1.78%，表明該方法重復(fù)性良好。

1.2.4.4 穩(wěn)定性試驗

按“1.2.3”項下方法制備黨參參尾供試品溶液，分別在室溫下放置 0、2、4、8、12、24 h 后按“1.2.1”項下色譜條件進樣測定，以黨參炔苷峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果各共有峰相對保留時間RSD小于1.24%，相對峰面積的RSD小于2.95%，表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.2.5 多糖含量的測定

1.2.5.1 葡萄糖對照品溶液的制備

取事先在105℃下干燥至恒重的D-無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，加適量水溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，即得476 μg/mL的溶液。

1.2.5.2 供試品溶液的制備

取黨參蘆頭和參尾粉末（過80目篩）各約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加80%乙醇50 mL，超聲（40 kHz，500 W）提取 30 min，抽濾，棄去濾液，殘渣及濾紙揮干乙醇后加蒸餾水80mL，超聲輔助提取30min，濾過，再加蒸餾水80 mL重復(fù)超聲輔助提取1次，過濾，殘渣及濾紙用水洗滌，洗液并入2次濾液定容至200 mL的容量瓶中，搖勻備用。

1.2.5.3 線性關(guān)系考察

精密吸取葡萄糖對照品溶液（476 μg/mL）0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mL，分別加水稀釋定容至 2.0 mL，然后分別精密加入5%苯酚1.0 mL，搖勻，再垂直快速精密加入濃硫酸5.0 mL，混勻，置沸水浴中加熱15 min，然后冷卻至室溫。在490 nm處測定吸光度值[7]。以一系列不同濃度（μg/mL）的葡萄糖對照品溶液為橫坐標(biāo)X，以吸光度值為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5.4 方法學(xué)驗證

參照本文作者已發(fā)表文獻[7]的方法進行試驗，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性RSD值均小于3%，加樣回收率試驗測得加樣回收率平均值為99.96%，RSD值為0.85%，均符合試驗要求。

1.2.6 黨參炔苷、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和5-羥甲基糠醛的含量同時測定

1.2.6.1 混合對照品溶液的制備

分別精密稱定黨參炔苷對照品12.3 mg，5-羥甲基糠醛對照品12.4 mg，蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品26.9 mg，加甲醇溶解定容至10 mL，搖勻，分別制成質(zhì)量濃度為1.23 mg/mL的黨參炔苷對照品儲備液、1.24 mg/mL的5-羥甲基糠醛對照品和2.69 mg/mL蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品儲備液。用移液槍分別取3種對照品儲備液800、800、200 μL置于同一5 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得混合對照品溶液。

1.2.6.2 供試品溶液的制備同“1.2.3”項下方法

1.2.6.3 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對照品溶液0.2、0.6、0.8、1.5 mL分別加甲醇定容至5 mL容量瓶中備用。平行取“1.2.6.1”項下原混合對照品溶液，5份溶液分別用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按“1.2.1”項下色譜條件，測定黨參炔苷、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和5-羥甲基糠醛峰面積的積分值。以一系列不同濃度（μg/mL）的混合對照品溶液為橫坐標(biāo)X，以峰面積為縱坐標(biāo)Y進行線性回歸，即得三者回歸方程、線性關(guān)系（r）及線性范圍，結(jié)果見表2。

1.2.6.4 儀器精密度試驗

取混合對照品溶液，按“1.2.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，結(jié)果黨參炔苷、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和5-羥甲基糠醛峰面積RSD分別為0.68%、1.21%、1.04%（n=6），表明儀器精密度良好。

1.2.6.5 重復(fù)性試驗

取黨參參尾粉末（過80目篩）適量，按“1.2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“1.2.1”項下色譜條件進樣分析，計算供試品中3種活性成分的含量，結(jié)果黨參炔苷、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和5-羥甲基糠醛RSD分別為1.80%、1.46%、1.75%（n=6）。表明本方法重復(fù)性良好。

1.2.6.6 穩(wěn)定性試驗

取“1.2.3”項下制備的一份黨參參尾供試品溶液，分別在 0、2、4、8、12、24h 按“1.2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，結(jié)果黨參炔苷、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和5-羥甲基糠醛峰面積RSD分別為1.30%、0.95%、1.12%（n=5），表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.2.6.7 加樣回收率試驗

取已知含量的野生黨參參尾粉末各約1.0 g，共6份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入相當(dāng)于樣品含量100%的3種對照品，按“1.2.3”項下方法用甲醇25 mL超聲輔助提取2次，濾液濃縮得浸膏，然后用甲醇定容至10 mL得供試品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液按“1.2.1”項下色譜條件測定，計算各成分的加樣回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC特征圖譜的建立與分析

取過80目篩的野生黨參蘆頭和參尾粉末各適量，按“1.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“1.2.1”項下色譜條件進樣測定，得HPLC特征圖譜，比較各樣品HPLC圖譜中共有峰的數(shù)目，結(jié)果見圖2。采用國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2008版）”軟件，用中位數(shù)法多點校正，分別計算野生黨參蘆頭和參尾與生成的對照圖譜的相似度，結(jié)果見表1。

由圖2可以看出，黨參蘆頭和參尾的HPLC特征圖譜主要特征峰相同，通過對樣品各個峰進行比對分析，發(fā)現(xiàn)了10個共有峰；經(jīng)與混合對照品圖譜比對，其中1號峰為5-羥甲基糠醛，8號峰為黨參炔苷，10號峰為蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ。由表1相似度評價結(jié)果可知，黨參蘆頭和參尾特征圖譜相似度為0.904，說明黨參蘆頭和參尾的主要化學(xué)成分差異不大。

圖2 混合對照、黨參蘆頭及參尾的HPLC特征圖譜Fig.2 HPLC specific chromatograms of mixed contrast、rhizomes and sterns of Radix Codonopsis

表1 黨參蘆頭和參尾HPLC特征圖譜相似度評價結(jié)果Table 1 Similarities evaluation of rhizomes and sterns of Radix Codonopsis by HPLC specific chromatograms

2.2 線性回歸方程

黨參蘆頭和參尾中各成分的回歸方程、線性關(guān)系（r）及線性范圍，結(jié)果見表2。

表2 各成分的線性回歸方程Table 2 Equation of linear regression of four components

2.3 3種成分的加樣回收率試驗結(jié)果

3種成分的加樣回收率試驗結(jié)果見表3。

表3 3種成分的加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）Table 3 The results of recovery test of three components（n=6）

續(xù)表3 3種成分的加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）Continue table 3 The results of recovery test of three components（n=6）

2.4 樣品含量測定

取黨參蘆頭和參尾粉末（過80目篩）各適量，分別按照“1.2.3”和“1.2.5.2”項下方法制備供試品溶液，測定并計算黨參蘆頭和參尾中各成分的含量，結(jié)果見表4。

表4 黨參蘆頭和參尾各成分的含量Table 4 Contents determination of four components in rhizomes and sterns of Radix Codonopsis mg/g

3 討論

3.1 前處理方法考察[8]

本研究前期比較了不同提取溶劑（甲醇和乙醇）、提取方法（超聲和回流），結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲輔助提取和回流提取無明顯差異，考慮到超聲輔助提取操作簡便且耗時短，所以選用超聲操作；選用甲醇作為提取溶劑時，能盡可能完全地提取出藥材中所含的有效成分；選用甲醇作為溶劑進行超聲輔助提取獲得的供試品溶液采用HPLC法進行測定，發(fā)現(xiàn)色譜峰信息較豐富、峰面積較大。

3.2 色譜條件選擇

篩選了流動相體系（乙腈-水[9-10]、甲醇-水[11-12]、乙腈-0.1%磷酸溶液[13-14]、乙腈-0.5%磷酸溶液）采用HPLC進行測定，發(fā)現(xiàn)采用乙腈-0.5%磷酸溶液作為流動相時峰個數(shù)較多、色譜峰峰分離度較好；不同檢測波長（220、256、267 nm）下獲取數(shù)據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)選用波長256、267 nm處蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ吸收很小，而在220 nm時黨參炔苷、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ及5-羥甲基糠醛三者均有較大吸收，且樣品的HPLC圖譜峰形較好、不與其他色譜峰發(fā)生重疊，多數(shù)成分在220 nm處均有較好的響應(yīng)，故最終確定選用流動相為乙腈-0.5%磷酸溶液、檢測波長在220 nm處進行檢測。

3.3 結(jié)果分析

黨參含有多糖類、植物甾醇類、萜類、生物堿類、苯丙素苷類等多種化學(xué)成分，其中多糖類所占比例最大[15]，是其有效成分之一，也是評價黨參質(zhì)量優(yōu)劣的主要指標(biāo)。因此本研究采用經(jīng)典的苯酚-硫酸法測定黨參中多糖的含量，發(fā)現(xiàn)潞城產(chǎn)多年黨參蘆頭和參尾中均主要含有多糖類成分，在參尾中多糖的含量是蘆頭的近100倍。

王崢濤從不同產(chǎn)地黨參屬19種黨參及一個變種素花黨參中首次分離得到倍半萜內(nèi)酯類化合物蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ，其具有很好的抗炎活性，并指出是否含有蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ可作為潞黨參的一個重要的鑒別和質(zhì)量評價手段[16-17]；5-羥甲基糠醛具有抗心肌缺血、抗氧化、增進血紅細胞變性等藥理活性[18]，鄒利研究發(fā)現(xiàn)米炒黨參飲片后5-羥甲基糠含量增加，從而對胃腸平滑肌的興奮性收縮起到調(diào)控的作用，是黨參健脾功效增強的物質(zhì)基礎(chǔ)之一[19]；此外2015版藥典僅將黨參炔苷（薄層鑒別）作為黨參指標(biāo)性成分，但是在一些代用品和摻偽品中也能檢測到黨參炔苷。因此黨參炔苷只能作為黨參的一般化學(xué)標(biāo)示物，而不能作為特征化學(xué)標(biāo)示物單獨用于黨參的鑒定[20]。綜合考慮，反映黨參的整體質(zhì)量需要研究其所含的化學(xué)組成分。因此，本研究對以上3種活性成分（黨參炔苷、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和5-羥甲基糠醛）的含量進行同時測定以全面綜合評價黨參的整體水平，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在蘆頭中蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和5-羥甲基糠醛的含量遠低于參尾，具有顯著性差異（P＜0.05）；在黨參蘆頭和參尾中黨參炔苷的含量較為接近。這與趙曉華[5]報道的甘肅產(chǎn)黨參不同部位中黨參炔苷的含量分析一致。

目前，指紋圖譜已成為國內(nèi)外公認的鑒別中藥品種和評價中藥質(zhì)量的有效方法。它能有效地檢測和控制中藥產(chǎn)品的真實性、質(zhì)量的一致性及穩(wěn)定性[21]。因此，本研究在多指標(biāo)成分進行含量測定的同時結(jié)合中藥特征圖譜進行全面綜合的質(zhì)量評價，利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2008A版）對黨參蘆頭和參尾的特征圖譜進行了比較分析，相似度在0.90以上，主要化學(xué)特征相似，確定了10個共有峰，但共有峰的高度和峰形等細節(jié)存在些許差異。

黨參的銷量是逐年增加的，現(xiàn)在每年的銷量在30 000 t以上。蘆頭重量占主根重量的8%～15%，如果按每100克黨參去蘆頭8 g計算，那一年至少棄去黨參蘆頭2 400 t。有研究報道黨參炔苷可以保護乙醇造成的胃黏膜損傷[22]，本研究發(fā)現(xiàn)黨參蘆頭中黨參炔苷的含量和參尾中基本接近，推測蘆頭在胃黏膜保護的功效方面可能不亞于參尾，未來可以將蘆頭運用到釀酒工業(yè)中制作營養(yǎng)類保健酒。另外，蘆頭中含有的主要成分多糖具有增強機體免疫[23]、抑制腫瘤[24]、延緩衰老[25]等功效，也可以運用到保健品、化妝品等領(lǐng)域。因此，黨參帶蘆頭入藥既能極大地提高資源利用率，又能保證經(jīng)濟價值最大化。

綜上所述，本研究運用特征圖譜結(jié)合多種活性成分定量對潞城產(chǎn)野生黨參蘆頭和參尾進行了全面分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黨參蘆頭和參尾具有相似的化學(xué)特征，其中質(zhì)量標(biāo)志性成分（黨參炔苷）含量相差不大，其余3種活性成分的含量有所差異，黨參蘆頭和參尾中均主要含有多糖成分。后續(xù)除了從化學(xué)成分的角度來考察二者的異同外，還會結(jié)合藥理藥效作用對黨參蘆頭與參尾進一步進行藥效學(xué)比較研究，以全面評價蘆頭與參尾一同入藥的必要性。