改良LAMP檢測雞肉中單增李斯特氏菌的研究

馮顯顯，楊倩，張先舟，馬曉燕，李英軍，張偉，，*，王建昌，陳啟躍

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理工學(xué)院，河北滄州061100；3.河北出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，河北石家莊050051；4.北京金諾美生物技術(shù)有限公司，北京100176）

單核細胞增生性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，L.monocytogenes）簡稱單增李斯特氏菌，是一種重要的食源性致病菌[1]，被世界衛(wèi)生組織（WHO）列為第四大重要食源性致病菌（大腸桿菌O157、沙門氏菌、志賀氏菌）[2]。該菌能夠污染食品并引起嚴重的人畜共患疾病[3]，如腸胃炎、流產(chǎn)、腦膜炎、敗血癥等[4]，死亡率高達20%～30%[5-6]。單增李斯特氏菌的生存能力極強，在-4℃～45℃溫度范圍內(nèi)，pH值4～9，或者高鹽（14%及以上）等惡劣環(huán)境條件下均能生存[7-9]。因此，建立一種高效、靈敏的快速檢測單增李斯特氏菌的方法迫在眉睫。

傳統(tǒng)培養(yǎng)方法是目前公認的檢測單增李斯特氏菌的標準方法，需要4 d～7 d時間，耗時耗力[10-11]。近幾年，檢測單增李斯特氏菌的分子生物學(xué)方法發(fā)展迅速，例如聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法[12-13]和環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）方法[14-15]等。PCR 方法檢測單增李斯特氏菌的特異性良好，但需要昂貴的PCR儀器，檢測過程復(fù)雜，不容易在基層推廣[16]。

LAMP方法是2000年由日本的Notomi等研究出的一種核酸等溫擴增方法[17]，需要4～6條引物在Bst DNA聚合酶的作用下反應(yīng)約30 min～60 min，即可完成DNA的快速擴增[18]。與PCR相比，LAMP方法不需要昂貴的儀器，在恒溫加熱器中就可以進行反應(yīng)[19]。hlyA基因編碼李斯特氏菌溶血素O（主要致病因子），是單增李斯特氏菌比較保守的毒力基因，應(yīng)用比較廣泛[12，20-21]。本研究是在LAMP方法的基礎(chǔ)上，通過添加熒光染料SYBER Green I達到實時監(jiān)測和結(jié)果可視化目的，針對hlyA基因，建立了一種改良LAMP技術(shù)檢測單增李斯特氏菌的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株

試驗所使用的菌株如表1所示。

表1 試驗菌株Table 1 The strains used in the study

續(xù)表1 試驗菌株Continue table 1 The strains used in the study

1.1.2 樣品與試劑

Bst DNA聚合酶（Bst DNA ploymerase）、硫酸鎂（MgSO4）、四種脫氧核糖核苷三磷酸混合液（dNTPs）、細菌基因組DNA提取試劑盒：大連寶生物有限公司；2×EasyTaqRPCRSuperMix：全式金生物有限公司；熒光染料SYBERGreenI：北京天恩澤基因有限公司；試驗中所有培養(yǎng)菌的培養(yǎng)基均購自北京陸橋有限責任公司。

試驗所用雞肉樣品：保定大型超市。

1.1.3 主要儀器

ESE Quant TS95實時熒光監(jiān)測儀：Qia Gen Hilden，Germany；T-Gradient Thermoblock PCR擴增儀：Biometra，Germany；JY04S-3E凝膠成像系統(tǒng)：北京君意電泳；DYY-10C型電泳儀：北京市六一儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計

根據(jù)單增李斯特氏菌的hlyA基因在NCBI中的已知序列，利用Primer premier 5.0設(shè)計PCR引物，通過在線引物設(shè)計軟件設(shè)計LAMP引物。PCR和改良LAMP引物由華大基因有限公司設(shè)計，如表2所示。

表2 引物Table 2 The sequences of primers

1.2.2 細菌的培養(yǎng)及基因組DNA的提取

所有細菌均由適宜的培養(yǎng)基和適宜的溫度進行培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的細菌按照基因組DNA提取試劑盒的說明書進行DNA的提取。

1.2.3 反應(yīng)體系

PCR最適反應(yīng)體系為：2×Easy TaqRPCR SuperMix 11 μL，引物各 0.4 μmol/L DNA 模板 1 μL，無菌蒸餾水補足體積到 25 μL。

改良LAMP最適反應(yīng)體系為：內(nèi)引物BIP和FIP各 0.8 μmol/L，外引物 F3 和 B3 各 0.2 μmol/L，環(huán)引物LF 和 LB 各 0.4 μmol/L，dNTPs 1 mmol/L，Bst DNA 聚合酶 320 U，MgSO45 mmol/L，10×Bst DNA 聚合酶緩沖液2.5 μL，DNA 模板 1 μL，SYBR Green I熒光染料（1∶300稀釋）1 μL，無菌蒸餾水補足體積到25 μL。最佳反應(yīng)溫度為65℃。

1.2.4 特異性分析

本試驗利用7株單增李斯特氏菌菌株和24株非單增李斯特氏菌菌株對改良LAMP引物的特異性進行研究。提取31株菌株的基因組DNA，使用改良LAMP方法對31株菌株進行檢測，驗證引物的特異性。

1.2.5 靈敏度分析

將單增李斯特氏菌標準菌株（CICC 21633）經(jīng)過夜培養(yǎng)后，取1 mL過夜培養(yǎng)的菌液提取基因組DNA，并用滅菌的生理鹽水進行10倍梯度稀釋，分別使用PCR方法和改良LAMP方法對不同梯度濃度的基因組DNA進行檢測，確定改良LAMP的靈敏度。

1.2.6 檢出限分析

將25 g未感染單增李斯特氏菌的雞肉樣品與225 mL無菌LB1培養(yǎng)基進行混合并均質(zhì)，將均質(zhì)后的勻漿分裝于試管，每管9 mL，將1 mL過夜培養(yǎng)的單增李斯特氏菌標準菌株（CICC 21633）接種到9 mL分裝好的雞肉樣品勻漿中，同時用9 mL分裝好的勻漿進行10倍梯度稀釋，直接提取每個稀釋度的基因組DNA。將提取的基因組DNA進行PCR和改良LAMP檢測，確定方法的檢出限。

1.2.7 實際樣品檢測

本研究于保定市各大商場和農(nóng)貿(mào)市場共采集66份雞肉樣品對改良LAMP方法進行評價。將66份樣品按照GB4789.30-2016《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》的方法進行分離鑒定，同時提取雞肉樣品基因組DNA，進行改良LAMP方法檢測，并計算改良LAMP方法的敏感性、特異性和符合率。所用公式如下所示：

敏感性=真陽性數(shù)/（真陽性數(shù)+假陰性數(shù)）×100%特異性=真陰性數(shù)/（真陰性數(shù)+假陽性數(shù)）×100%符合率=（真陽性數(shù)+真陰性數(shù)）/被檢總數(shù)×100%以上公式中，真陽性數(shù)代表國家標準和改良LAMP方法檢測結(jié)果同時為陽性的樣品數(shù)，真陰性數(shù)代表國家標準和改良LAMP方法檢測結(jié)果同時為陰性的樣品數(shù)，假陽性數(shù)代表國家標準檢測結(jié)果為陰性而改良LAMP方法檢測結(jié)果為陽性的樣品數(shù)，假陰性代表國家標準檢測結(jié)果為陽性而改良LAMP方法檢測結(jié)果為陰性的樣品數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性分析

本研究對7株單增李斯特氏菌和24株非單增李斯特氏菌進行特異性檢測，結(jié)果如圖1。

圖1 改良LAMP的特異性試驗Fig.1 The specificity assay of the improved LAMP

如圖1所示，7株單增李斯特氏菌均有明顯的熒光信號強度，顯示陽性結(jié)果（圖1A）；24株非單增李斯特氏菌均無明顯的熒光信號強度，顯示陰性結(jié)果（圖1B～圖1E）。結(jié)果表明改良LAMP方法具有良好的特異性。

2.2 靈敏度分析

提取基因組DNA的質(zhì)量濃度經(jīng)測定為5.4×107fg/μL，依次梯度稀釋，利用PCR和改良LAMP方法進行檢測，結(jié)果見圖2。

圖2 改良LAMP和PCR的靈敏度檢測Fig.2 The sensitivities of the improved LAMP and PCR

檢測結(jié)果如圖2所示，當基因組DNA濃度為5.4×107fg/μL～5.4×100fg/μL 時，熒光曲線有明顯的起峰現(xiàn)象（圖2A），肉眼觀察熒光顏色為綠色（圖2B），呈陽性結(jié)果；當基因組DNA濃度為5.4×10-1fg/μL時，改良LAMP方法未觀察到陽性結(jié)果。因此，改良LAMP方法檢測單增李斯特氏菌的靈敏度為5.4×100fg/μL。如圖2C所示，當基因組DNA濃度為5.4×107fg/μL～5.4×102fg/μL時，PCR結(jié)果為陽性；當基因組DNA濃度為5.4×101fg/μL～5.4×10-1fg/μL 時，PCR 結(jié)果為陰性。因此，PCR方法的靈敏度為5.4×102fg/μL。結(jié)果表明，改良LAMP方法是PCR方法靈敏度的100倍。

2.3 檢出限分析

通過平板計數(shù)得到單增李斯特氏菌的初始濃度為3.9×108CFU/mL。將人工污染的雞肉樣品勻漿提取基因組DNA，進行檢測，結(jié)果見圖3。

如圖3所示，當菌濃度為3.9×107CFU/g～3.9×100CFU/g時，改良LAMP方法呈現(xiàn)明顯的熒光信號強度（圖3A）和綠色熒光（圖3B）；當菌濃度為3.9×10-1CFU/g時，未觀察到陽性結(jié)果。因此，改良LAMP方法的檢出限為3.9×100CFU/g。如圖3C所示，當菌濃度為3.9×107CFU/g～3.9×102CFU/g時，觀察到擴增條帶，PCR結(jié)果為陽性；當菌濃度為3.9×101CFU/g～3.9×10-1CFU/g時，未觀察到擴增條帶，PCR結(jié)果為陰性?？芍狿CR方法的檢出限為3.9×102CFU/g。結(jié)果表明改良LAMP方法的檢出限比PCR方法低100倍。

圖3 改良LAMP和PCR的檢出限Fig.3 The detection limits of the improved LAMP and PCR

2.4 實際樣品檢測結(jié)果分析

對66份雞肉樣品同時進行國家標準方法鑒定和改良LAMP方法檢測，檢測結(jié)果見表3。

表3 雞肉樣品檢測結(jié)果Table 3 The detection results of chicken samples

如表3所示，66份雞肉樣品中國家標準檢出3份陽性，改良LAMP方法較國家標準多檢出1份陽性，結(jié)果未檢出假陰性。計算得到改良LAMP方法的敏感性為100%，特異性為98.41%，符合率為98.48%。

3 結(jié)論與討論

LAMP方法利用多條引物在恒溫條件下進行擴增反應(yīng)，加快了反應(yīng)進程，具有良好的特異性和靈敏度，但仍需要進行繁瑣的電泳過程，易造成氣溶膠污染。本研究建立了一種改良LAMP方法檢測單增李斯特氏菌。在普通LAMP方法的基礎(chǔ)上結(jié)合SYBR Green I熒光染料，可以通過熒光曲線實時監(jiān)測反應(yīng)進程，或通過肉眼觀察熒光顏色來判定檢測結(jié)果。

改良LAMP方法與PCR方法相比較的優(yōu)勢體現(xiàn)在以下幾點：第一，改良LAMP方法是一個恒溫擴增反應(yīng)，不需要PCR方法的變溫過程。第二，結(jié)合SYBR Green I熒光染料，可實時監(jiān)測反應(yīng)進程或者直接肉眼觀察結(jié)果，方便快捷，避免了凝膠電泳的復(fù)雜過程。第三，省時省力。4～6條引物的使用加快了反應(yīng)的進行，大約一個小時內(nèi)就能完成反應(yīng)。第四，特異性好，靈敏度高，檢出限低。靈敏度達到5.4×100fg/μL，比PCR（5.4×102fg/μL）高 100 倍。檢出限達到 3.9×100CFU/g，比PCR（3.9×102CFU/g）低100倍。通過對雞肉樣品進行檢測，得到改良LAMP方法的敏感性為100%，特異性為98.41%，符合率為98.48%，其中假陽性結(jié)果的出現(xiàn)可能是由于雞肉樣品中存在死的或者活的不可培養(yǎng)狀態(tài)的單增李斯特氏菌導(dǎo)致的。張德福等[22]建立了一種添加擴增內(nèi)標的單增李斯特氏菌PCR檢測方法，檢出限為1.21×102CFU/mL。張體銀等[20]建立了一種LAMP方法檢測單增李斯特氏菌，檢出限為101CFU/mL。本研究建立的改良LAMP方法檢出限是以上普通LAMP結(jié)果的10倍。改良LAMP比普通LAMP更具優(yōu)勢，檢測結(jié)果更靈敏，省去了電泳過程，實現(xiàn)了結(jié)果判斷的可視化。李秀梅等[23]建立了環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)與橫向流動試紙條法快速檢測單增李斯特氏菌，靈敏度為3.6 CFU/mL，與之相比，本研究不需要進行熒光標記探針的設(shè)計，操作簡單，節(jié)省了試驗費用。楊粵[24]和劉道亮等[25]建立的改良LAMP方法是通過觀察白色沉淀判定結(jié)果，而本研究中通過熒光顏色判定結(jié)果，陰性結(jié)果和陽性結(jié)果顏色差異明顯，更容易觀察結(jié)果。因此，本研究建立的改良LAMP檢測單增李斯特氏菌的方法快速，簡便，靈敏度高，適用于基層檢測機構(gòu)。