紅姑娘莖葉總黃酮提取及體外抗氧化活性研究

姜秀娟，吳威，張雅婷，孫娜，曹柏營

（1.吉林工程技術(shù)師范學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林長春130052；2.長春職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物技術(shù)分院，吉林長春130033）

紅姑娘（Physalis alkekengi）屬多年生茄科植物，別名酸漿、燈籠草[1-3]。紅姑娘藥食兼用，即可生食，又可入藥[4]，在《本草綱目》中記載了紅姑娘有止咳、名目和清熱解毒等功效[5]。紅姑娘含有豐富的黃酮類化合物[6-7]，植物黃酮類化合物是一種天然強抗氧化劑，不但對自由基的清除能力強，而且有降血壓、降血糖、抗腫瘤和抑菌等作用[8-11]。因此，植物黃酮化合物已經(jīng)成為近幾年關(guān)注的熱點。

紅姑娘主要產(chǎn)于東北地區(qū)，特別是長白山的紅姑娘品質(zhì)甚好，但紅姑娘的開發(fā)利用率很低[12]。國內(nèi)對紅姑娘的研究大部分集中在紅姑娘酸奶、飲料以及果酒等方面[13-16]，關(guān)于附加值較高的植物黃酮類化合物的文獻報道較少，未見紅姑娘莖葉黃酮化合物的研究報道，以長白山野生紅姑娘莖葉為原料，研究總黃酮提取的最佳工藝，評價精制后的總黃酮的抗氧化活性，為紅姑娘資源的精深加工及長白山野生資源的開發(fā)利用提供重要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紅姑娘莖葉：采自長白山山區(qū)，自然晾干，試驗前用烘箱（60℃～70℃）干燥后粉碎、過80目篩子備用。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

UV-2102C型紫外可見光分光光度計：深圳市凱銘杰儀器設(shè)備有限公司；AL104型分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HH-4型數(shù)顯控溫水浴鍋：江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所；CS-700Y型多功能粉碎機：永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司；ZD-2自動電位滴定儀：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；RE-52C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；ALPHA 1-4 LD PLUS型真空冷凍干燥機：德國Marin Christ公司。

1.2.2 試劑

DPPH：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；蘆丁標準品：中國食品藥品檢定研究院；AB-8型大孔吸附樹脂：天津允開樹脂科技有限公司；硝酸鋁、亞硝酸鈉、三羥甲基氨基甲烷[Tris（Hydroxymethyl）aminomethane，Tris]、氯化鐵、鄰苯三酚、乙醇、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯甲烷、冰醋酸、硫代硫酸鈉等均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的繪制

用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法測定總黃酮含量，以蘆丁標準品繪制標準曲線[17]。標準曲線方程為：y=6.406 x+0.009（R2=0.999），蘆丁標樣濃度范圍為0.006 4 mg/mL～0.044 8 mg/mL。標準曲線見圖1。

圖1 標準曲線Fig.1 Standard curve line

1.3.2 紅姑娘莖葉總黃酮得率的測定

參照1.3.1中的標準曲線測定野生紅姑娘莖葉總黃酮得率，總黃酮得率計算公式為：

式中：A為吸光度值；M為樣品的質(zhì)量，g；V為定容終體積，mL。

1.3.3 紅姑娘莖葉總黃酮提取工藝優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以影響野生紅姑娘莖葉總黃酮得率的主要因素，即提取溫度、提取時間、料液比、乙醇濃度為輸入變量，以總黃酮的得率為試驗指標，進行Box-Behnken中心組合設(shè)計試驗。試驗因素水平編碼見表1。

表1 因素水平編碼表Table 1 The levels of experimental factors

1.3.4 紅姑娘莖葉總黃酮的精制

采用AB-8大孔樹脂對野生紅姑娘莖葉黃酮進行純化精制，然后將處理過的樹脂放入層析柱中（φ6.0cm×80cm），洗脫流速為2 mL/min，洗脫劑為70%乙醇水溶液，合并洗脫液減壓蒸餾，凍干備用。

1.3.5 紅姑娘莖葉總黃酮的體外抗氧化活性測定

將精制紅姑娘莖葉總黃酮作為試驗原料，測定其體外抗氧化活性，其中對DPPH·的清除作用，參考林海楨[18]的測定方法；對O2-·的清除作用，參考鄭亞美[19]的試驗方法；總還原能力的測定，參考王彥平[20]的試驗方法；對·OH的清除作用，參考范艷麗[21]的試驗方法。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

上述試驗均重復(fù)進行3次，所得的試驗結(jié)果采取平均值±標準差來表達，采用SPSS 19.0和Duncan法對實驗數(shù)據(jù)進行分析與比較，Origin 8.5軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇濃度對紅姑娘莖葉總黃酮得率的影響

乙醇濃度對紅姑娘莖葉總黃酮得率的影響見圖2。

圖2 乙醇濃度對紅姑娘莖葉總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids from stems and leaves of Physalis alkekengi

由圖2可得，乙醇濃度在升高的同時紅姑娘莖葉總黃酮得率也隨之增加，乙醇濃度在80%時，總黃酮得率出現(xiàn)了最大值5.59 mg/g，說明此時的乙醇濃度與黃酮的極性關(guān)系非常密切，之后乙醇濃度繼續(xù)增加總黃酮得率變化不顯著（p＜0.05）。

2.1.2 提取溫度對紅姑娘莖葉總黃酮得率的影響

提取溫度對總黃酮得率的影響見圖3。

圖3 提取溫度對總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of temperature on the yield of total flavonoids from stems and leaves of Physalis alkekengi

由圖3可以看出，紅姑娘莖葉總黃酮得率隨著提取溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨向，當(dāng)提取溫度達到70℃時，總黃酮的得率達到6.18 mg/g。高溫條件下，黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化，導(dǎo)致總黃酮提取率降低。

2.1.3 提取時間對紅姑娘莖葉總黃酮得率的影響

提取時間對總黃酮得率的影響見圖4。

圖4 提取時間對總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of total flavonoids from stems and leaves of Physalis alkekengi

從圖4可得，提取時間不斷延長的同時，總黃酮得率在4 h之前呈直線上升，在4 h之后開始緩慢下降，所以在4 h時總黃酮得率最大為5.55 mg/g。如果提取時間過長，黃酮類化合物會出現(xiàn)損失，使得總黃酮得率減小。

2.1.4 料液比對紅姑娘莖葉總黃酮得率的影響

料液比對總黃酮得率的影響見圖5。

圖5 料液比對總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of liquid ratio on the yield of total flavonoids from stems and leaves of Physalis alkekengi

由圖5可得，料液比為1∶30（g/mL）時，總黃酮得率最大為5.62 mg/g，料液比的增加提高了提取液中糖和葉綠素的含量，對總黃酮得率產(chǎn)生一定的影響，導(dǎo)致總黃酮得率降低。

2.2 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)模型的建立

試驗方案及試驗結(jié)果見表2，響應(yīng)面回歸模型方差分析見表3。

表2 試驗方案及試驗結(jié)果Table 2 The experimental design and results

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

Design Expert 8.06軟件對表2中的試驗結(jié)果進行回歸分析，結(jié)果如表3所示，由此得到回歸模型方程為：Y=6.208+0.071A-0.041B-0.014C-0.034D-0.155AB-0.088AC+0.085AD+0.34BC+0.173BD-0.07CD-0.296A2-0301B2-0.299C2-0.124D2。

由表3可見，野生紅姑娘莖葉黃酮提取的響應(yīng)面模型極為顯著（p＜0.000 1），模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.962 9，通過調(diào)整負相關(guān)系數(shù)R2Adj=0.925 9，方程失擬項不顯著（p=0.062＞0.05），綜合分析表明，使用該模型可以分析和預(yù)測從紅姑娘莖葉中提取總黃酮的過程。

方差分析結(jié)果表示，一次項A，交互項AB、BC、BD，二次項 A2、B2、C2、D2都對響應(yīng)值產(chǎn)生了極為顯著的影響（p＜0.01）；其中AC、AD的交互作用也分別對響應(yīng)值產(chǎn)生了明顯影響（p＜0.05）；各試驗因素對總黃酮得率的影響順序為A＞B＞D＞C，即乙醇體積分數(shù)＞提取溫度＞料液比＞提取時間。

2.2.2 響應(yīng)曲面分析

響應(yīng)曲面和等高線見圖6。

由圖 6可得，乙醇濃度（A）和提取溫度（B）（圖6a）、乙醇濃度（A）和提取時間（C）（圖 6b）、乙醇濃度（A）和料液比（D）（圖 6c）、提取溫度（B）和提取時間（C）（圖 6d）、提取溫度（B）和料液比（D）（圖 6e）的響應(yīng)曲面圖都呈現(xiàn)中間高，兩端低的趨勢，等高線呈現(xiàn)橢圓形，表明在試驗因素水平變化范圍內(nèi)，響應(yīng)值具有最大值，試驗因素間的交互作用顯著。

2.2.3 最優(yōu)工藝條件確定與驗證

經(jīng)響應(yīng)面軟件分析后，得到了野生紅姑娘莖葉黃酮的最佳提取工藝條件如下：乙醇濃度71.9%，提取溫度 67.1℃，提取時間 3.81 h，料液比 1 ∶27.8（g/mL），紅姑娘莖葉總黃酮得率的理論值可達到6.28 mg/g。修正后紅姑娘莖葉總黃酮提取最優(yōu)工藝如下：乙醇濃度72%，提取溫度 67℃，時間 3.8 h，料液比 1∶28（g/mL），采用最優(yōu)工藝條件重復(fù)5次驗證試驗，最終得到的野生紅姑娘莖葉總黃酮的平均得率為（6.35±0.23）mg/g，與預(yù)測理論值相接近。

2.3 紅姑娘莖葉總黃酮精制

紅姑娘莖葉黃酮的精制選用AB-8大孔樹脂柱層析法，樹脂吸附飽和后，以70%乙醇水溶液為洗脫劑，按2 mL/min的流速洗脫樹脂，每3分鐘收集一個試管，測定黃酮含量，繪制黃酮洗脫曲線如圖7所示，紅姑娘莖葉黃酮洗脫曲線中出現(xiàn)一個大峰，從48 min開始至93 min結(jié)束，因此收集48 min～93 min的黃酮洗脫液，減壓濃縮，冷凍干燥后，測定紅姑娘莖葉總黃酮純度達到（39.16±0.47）%。

圖6 響應(yīng)曲面和等高線Fig.6 Response surfaces and contour plots

圖7 紅姑娘莖葉黃酮洗脫曲線Fig.7 Desorption curve of total falvonoids from stems and leaves of Physalis alkekengi

2.4 紅姑娘莖葉總黃酮體外抗氧化活性的研究

紅姑娘莖葉總黃酮對DPPH·、超氧陰離子和羥自由基的清除作用及總還原力見圖8。

圖8 紅姑娘莖葉總黃酮對DPPH·、超氧陰離子和羥自由基的清除作用及總還原力Fig.8 DPPH·，superoxide anion,hydroxyl radical scavenging activities and reducing power of total falvonoids from stems and leaves of Physalis alkekengi

由圖8可得，隨著野生紅姑娘莖葉總黃酮濃度的增加，DPPH·清除率也隨之增加，當(dāng)總黃酮濃度達到600 μg/mL時，清除率達到100%，其DPPH·的清除率強于葡萄皮渣總黃酮[20]（400 μg/mL時清除率約70%）和無花果葉黃酮[23]（7 000 μg/mL時清除率約66.7%）；對O2-·的清除率在總黃酮濃度為800 μg/mL時達到了最大值98.57%，其清除能力強于紅樹莓籽黃酮[24]（1 600 μg/mL時清除率約80%）；對·OH的清除率在總黃酮濃度為800 μg/mL時達到了最大值91.53%，其清除能力強于八角茴香黃酮[25]（800 μg/mL時清除率約78%）；當(dāng)總黃酮濃度為400 μg/mL時，總還原能力達到最大值，并表達出較強的還原力。野生紅姑娘莖葉總黃酮對DPPH·、O2-·和·OH具有較強的清除效果，且存在一定的劑量效應(yīng)作用，雖較對照VC的抗氧化能力略弱，但作為一種天然抗氧化劑，也表現(xiàn)出較強的抗氧化活性。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面法優(yōu)化后的紅姑娘莖葉總黃酮提取最優(yōu)條件為：乙醇濃度 72%，料液比 1 ∶28（g/mL），溫度67℃，時間3.8 h，總黃酮得率最高為6.35 mg/g，純化精制后的總黃酮純度達到39.16%。體外抗氧化活性研究表明，野生紅姑娘莖葉總黃酮對DPPH·、超氧陰離子自由基和羥自由基的清除率分別達到100%、98.57%和91.53%，同時還原力也比較強。野生紅姑娘莖葉總黃酮具有較強的體外抗氧化活性，關(guān)于野生紅姑娘莖葉總黃酮的體內(nèi)抗氧化活性及機理的研究將在后續(xù)課題研究中進行探討。