TNF-α基因多態(tài)性及缺氧對(duì)激素誘導(dǎo)性股骨頭壞死的影響分析

薛 亮,白東昱

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院 關(guān)節(jié)外科,陜西 延安716000)

股骨頭壞死是由多種因素因子的病理過程，涉及到血供的損傷以及骨細(xì)胞的壞死，且一般認(rèn)為本病不可逆，臨床上可分為創(chuàng)傷性股骨頭壞死和非創(chuàng)傷性股骨頭壞死[1]。激素性股骨頭壞死(SONFH)屬于非創(chuàng)傷性股骨頭壞死，通常是由于腎上腺激素的長(zhǎng)期和過量使用所致，但其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚[2]。為了探討腫瘤壞死因子(TNF)-α基因多態(tài)性及缺氧對(duì)激素誘導(dǎo)性股骨頭壞死的影響，本次研究對(duì)我院在2013年1月-2015年1月期間收治的100例激素性股骨頭壞死患者進(jìn)行了病例對(duì)照研究，現(xiàn)將相關(guān)內(nèi)容報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 資料來源

選取2013年1月-2015年1月期間我院收治的100例激素性股骨頭壞死患者作為病例組，所有患者均依照國際骨循環(huán)研究會(huì)制定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[3]被確診為激素性股骨頭壞死。同時(shí)選取同期我院體檢的100例健康人群作為對(duì)照組。被納入本次研究的所有研究對(duì)象均為漢族，其中對(duì)照組男性患者64例，女性患者36例；病例組男性患者67例，女性患者33例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)討論會(huì)通過，所有患者均知情同意，并簽署了知情同意書。

1.2 研究方法

所有研究對(duì)象均被抽取20 ml靜脈血，加EDTA-NA2抗凝劑，并采用淋巴細(xì)胞分離液分析有核細(xì)胞，然后用基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。采用Primer 5軟件設(shè)計(jì)氨基酸標(biāo)記的等位基因特異性寡核苷酸(ASO)探針，的引物的5'端都標(biāo)記有生物素。將探針分別固定到硝酸纖維素膜上，將PCR特異性擴(kuò)增產(chǎn)物與之雜交，然后將濾膜放入10%的EDC(1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)，用蒸餾水洗滌幾次并在濾紙上干燥，室溫下，放入顯色液中10-15分鐘，藍(lán)紫色的斑點(diǎn)被記錄為陽性，經(jīng)顯色反應(yīng)后記錄結(jié)果。比較兩組患者TNF-α基因型。

rs1800629的引物為： 5’-GAAGTTAGAAGGAAACAGACCACAG-3’，

反向： 5’-TGTGGTCTGTTTCCTTCTAACTTCC-3’，

rs1799964的引物為： 5’-AGAAGATGAAGGAAAAGTCAGGGTC-3’

反向： 5’-GACCCTGACTTTTCCTTCATCTTCT-3’

rs1800630的引物為： 5’-TGTAGCGGCTCTGAGGAATGGGTTA-3’

反向： 5’-CCTGTAACCCATTCCTCAGAGCCGC-3’。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用χ2檢驗(yàn)分析Hardy-Weinberg平衡(HWE)和兩組間的環(huán)境因素差異，根據(jù)兩組間方差是否均衡采用t檢驗(yàn)或t’檢驗(yàn)來分析兩組間的年齡差異，SNP和環(huán)境因素對(duì)SONFH易感性的功能分析采用Logistic回歸分析。以P值<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者基線及人口學(xué)特征分析

對(duì)激素性股骨頭壞死的危險(xiǎn)因素進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，病例組患者的有缺氧史的比例(67%)明顯高于對(duì)照組(42%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表1。

表1 兩組患者激素性股骨頭壞死危險(xiǎn)因素比較

2.2 兩組患者TNF-α基因多態(tài)性與患病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系分析

TNF-α基因多態(tài)性包括rs1800629，rs1799964和rs1800630。病例組患者rs1800629的AA基因型比例(17.0%)明顯高于對(duì)照組患者(5.0%)，病例組患者rs1800630的AA基因型(33.0%)明顯高于對(duì)照組患者(4.0%)。Logistic回歸分析顯示， rs1800629的AA基因型較GG基因型有更高的患激素性股骨頭壞死的風(fēng)險(xiǎn)(OR=3.89(1.32-10.44))；rs1800630的AA基因型較CC基因型有更高的患激素性骨頭壞死的風(fēng)險(xiǎn)(OR=7.72(3.21-29.85))。詳見表2。

表2 兩組患者TNF-α基因多態(tài)性比較

2.3 激素性股骨頭壞死患者缺氧史與TNF-α基因變異相關(guān)性分析

采用Logistic回歸分析激素性股骨頭壞死患者缺氧史與TNF-α基因變異相關(guān)性分析?？梢钥闯?，以無缺氧史并且rs1800629未發(fā)生突變?yōu)閷?duì)照，無缺氧史但有rs1800629突變的研究對(duì)象有更高的患激素性股骨頭壞死風(fēng)險(xiǎn)(OR=2.69(1.24-3.96))；有缺氧史并且有rs1800629突變的研究對(duì)象患激素性股骨頭壞死風(fēng)險(xiǎn)最高(OR=5.43(1.50-9.56))。以TNF-α的rs1800630位點(diǎn)未變異并且未經(jīng)歷過缺氧為對(duì)照，可以發(fā)現(xiàn)患者TNF-α的rs1800630為變異基因型并經(jīng)歷了缺氧狀態(tài)，那么其患激素性股骨頭壞死風(fēng)險(xiǎn)更高(OR=4.74(1.82-6.83))。詳見表3。

表3 激素性股骨頭壞死患者TNF-α基因變異與缺氧相關(guān)性分析

3 討論

約40%的患者在使用糖皮質(zhì)激素后發(fā)生股骨頭不可逆的壞死，甚至早期即可出現(xiàn)股骨頭塌陷[4]，糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致股骨頭壞死的機(jī)制尚不完全清楚，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)超過劑量激素可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，從而減少骨細(xì)胞的數(shù)量，導(dǎo)致骨細(xì)胞的凋亡壞死，甚至破壞骨結(jié)構(gòu)[5]。近年來，廣泛存在于人體組織上的疾病的遺傳多態(tài)性的影響引起關(guān)注，并有許多研究涉及SNP和股骨頭壞死相關(guān)性[6]。然而，很少有研究著眼于TNF-α的基因多態(tài)性和SONFH易感性的關(guān)聯(lián)。此外，SONFH還受到環(huán)境因素的影響，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)年齡在患者的股骨頭壞死發(fā)生中起到了一定作用，有研究發(fā)現(xiàn)低氧能增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的細(xì)胞凋亡[7,8]。

對(duì)于激素性股骨頭壞死，多數(shù)專家認(rèn)為主要是引起骨細(xì)胞凋亡。TNF-α屬于TNF受體家族，參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，TNF-α基因作為重要的炎癥因子，被認(rèn)為與破骨細(xì)胞增殖和成熟相關(guān)聯(lián)。有研究發(fā)現(xiàn)TNF-α能夠抑制膠原蛋白，堿性磷酸酶活性和骨鈣素的合成，且TNF-α的多態(tài)性也與SONFH發(fā)作風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)TNF-α多態(tài)性rs1800629和rs1800630與SONFH發(fā)生顯著相關(guān)。激素性股骨頭壞死患者與健康對(duì)照組比較，具有更高比例的缺氧史。 rs1800629的突變基因型可能會(huì)增加其激素性股骨頭壞死的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。如果患者TNF-α多態(tài)性rs1800630為變異基因型經(jīng)歷了缺氧狀態(tài)，其SONFH的風(fēng)險(xiǎn)增加4倍以上。有學(xué)者認(rèn)為血流減少可能是激素性股骨頭壞死的病理因素之一[9]。激素可通過引起脂肪代謝障礙，造成相關(guān)動(dòng)脈阻塞，導(dǎo)致股骨頭缺血壞死。此外，糖皮質(zhì)激素可通過誘導(dǎo)膽固醇沉積，降低組織液流動(dòng)性和細(xì)胞膜通透性，從而造成骨細(xì)胞死亡[10]。有學(xué)者認(rèn)為激素性股骨頭壞死屬于股骨頭缺血性壞死[11]，在缺血缺氧情況下，p38促分裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)途徑激活，可促進(jìn)低氧誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡。在生理或病理情況下，骨組織和細(xì)胞缺氧經(jīng)常存在，低氧狀態(tài)下，激活低氧反應(yīng)通路，通過誘導(dǎo)低氧誘導(dǎo)因子集聚，隨之激活相關(guān)基因，參與調(diào)控糖酵解、血管形成和血管擴(kuò)張等，可引起；成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中大量NO生成，抑制骨的修復(fù)和重建造成，對(duì)已受損的骨細(xì)胞造成進(jìn)一步損傷，產(chǎn)生大量凋亡細(xì)胞[11,12]。

糖皮質(zhì)激素抑制成骨細(xì)胞的產(chǎn)生，促使成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞凋亡[13]。低氧對(duì)骨組織細(xì)胞也會(huì)產(chǎn)生直接影響。近年來，低氧和糖皮質(zhì)激素介導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)之間的相互影響已日益引起人們的關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)，低氧可造成機(jī)體內(nèi)糖皮質(zhì)激素釋放，低氧可上調(diào)人近端腎小管上皮細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體，增加糖皮質(zhì)激素的敏感性[14]。在股骨頭局部微環(huán)境中，糖皮質(zhì)激素和低氧之間相互作用，并對(duì)成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞產(chǎn)生影響[15]。本研究是以醫(yī)院為基礎(chǔ)的病例對(duì)照研究，收集的病例來源單一，且病例數(shù)僅為100例，具有一定的局限性，后續(xù)研究還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量以及樣本來源，以進(jìn)一步探討TNF-α基因多態(tài)性及缺氧在激素誘導(dǎo)性股骨頭壞死發(fā)生過程中可能存在相互作用以及其中的機(jī)制。