膀胱癌中缺氧誘導因子-1α和血管內(nèi)皮生長因子與P53基因表達相關(guān)性的初探

王秀巖,范海濤,張 明,馮樹強,李然偉

(吉林大學第二醫(yī)院 泌尿外科，吉林 長春130041)

雖然膀胱惡性腫瘤的診斷手段和治療方法在不斷改進提高，但其術(shù)后復發(fā)率仍然很高。據(jù)資料統(tǒng)計，膀胱癌的術(shù)后復發(fā)率高達50%-70%[1]。其發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的各個階段均有賴于新生血管的形成。研究證實有多種因子參與了實體腫瘤血管生成的全過程，其中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)被認為是目前已知活性最強，特異性最高的新生血管生成誘導因子。新的研究結(jié)果表明，在很多促進VEGF表達水平上調(diào)的因子中，缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)起中樞開關(guān)的作用[2]。另有報道稱，VEGF和HIF-1α表達與P53基因突變存在一定關(guān)系，P53可能參與了腫瘤新生血管生成[3]。但也有報道認為P53與VEGF和HIF-1α表達無關(guān)[4]。見于上述因素，特別是有關(guān)腫瘤中VEGF，HIF-1α和P53基因表達相關(guān)性的研究截至目前鮮有報道，故本研究初步探索這三種蛋白在膀胱癌患者組織細胞中的表達狀況，旨在改善分子靶向藥物治療膀胱癌的療效，從而提高患者的生活質(zhì)量和術(shù)后5年生存率。

1 資料與方法

1.1一般資料回顧性分析我科2010年1月至2016年12 月收治的196例經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)(TURBT)和開放術(shù)治療的膀胱癌患者，其中男性152例，女性42例，年齡31-82歲，平均年齡55.7歲。細胞病理分級：G1期118例，G2期54例，G3期24例。臨床病理分期：非肌層浸潤腫瘤114例，肌層浸潤腫瘤82例。

1.2方法和判定標準對篩選收集的庫存組織標本經(jīng)常規(guī)脫蠟水化并經(jīng)微波爐法修復抗原后備用。采用SABC免疫組化法。利用人單克隆抗體[VEGF單抗(Clone14 -12 4,ABCAM,5 μg/ml),HIF-1α單抗(Clone8911 5，R&D system,25 μg/ml)及P53單抗(DO-7,DAKO,1∶5)],即用型HIGH-SABC(免疫試劑盒)具體操作步驟參照VEGF抗體，HIF-1α抗體及P53抗體和即用型HIGH-SABC免疫試劑盒說明書。PBS代替一抗做陰性對照，陽性對照為瘤細胞膜或瘤細胞漿或瘤細胞核陽性染色。Tris緩沖鹽溶液，沖洗3次，每次5 min，然后DAB顯色，流水沖洗，蘇木精復染，鹽酸酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片，光鏡觀察。光鏡下見 VEGF和HIF-1α胞漿或胞膜呈現(xiàn)棕黃色顆粒而胞核無著色者為陽性(圖1,2)，P53胞核著色而胞漿和胞膜無著色為陽性(圖3)。每一組切片由兩位觀察者各自隨機選取2個視野，共約500個瘤細胞，計數(shù)陽性細胞的百分率。顯微鏡下隨機選擇5個視野，每個視野計數(shù)不少于200個細胞，計算陽性細胞的百分比。VEGF，HIF-1α和P53蛋白表達陽性標志為每個視野的著色細胞數(shù)分別在20% 左右。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，所有數(shù)據(jù)均以平均值表示。使用χ2檢驗和Fisher’s精確檢驗進行統(tǒng)計分析對比，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1膀胱癌患者中VEGF、HIF-1α和P53

表達及其與臨床病理特征的關(guān)系 在196例膀胱癌患者標本的組織細胞中，VEGF、HIF-1α和 P53 的陽性表達率分別為70.5 %,57.2% 和49.3%，其表達與性別和年齡沒有相關(guān)性。但與臨床分期和細胞分級有密切關(guān)系，即肌層浸潤膀胱癌中VEGF、HIF-1α及P53陽性表達率高于非肌層浸潤者(P<0.05)，細胞分化差的中級別和高級別中的上述三種基因陽性表達率與細胞分化好的低級別比較，其差異也具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表1。

附表1 196例膀胱癌患者中VEGF、HIF-1α和P53表達與病理特征之間的關(guān)系

2.2膀胱癌患者中VEGF和HIF-1α表達情

如表2所示，除腫瘤血管內(nèi)皮細胞外，瘤細胞中也存在VEGF和HIF-1α陽性共表達現(xiàn)象。以VEGF表達與否將患者分為兩組，觀察HIF-1α表達情況。結(jié)果顯示在136例VEGF表達陽性和60例無表達的患者中，其陽性表達率分別為67.1% (90/136)和33.3%(20/60),兩者間的表達差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)

附表2 196例膀胱癌患者中VEGF和HIF-1α表達之間的關(guān)系

2.3VEGF和HIF-1α與P53表達的相關(guān)性根據(jù)VEGF表達與否將患者分為兩組，觀察P53表達狀況。結(jié)果提示在136例VEGF陽性表達和60例無表達的患者中，P53的陽性表達率分別為56.8% (76/136) 和30%(18/ 60)。這表明VEGF和P53間的表達呈正相關(guān)，其差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。同樣以HIF-1α表達與否將患者分為兩組，觀察P53表達情況。結(jié)果顯示在110例HIF-1α陽性表達和86例無表達的患者中，P53的陽性表達率分別為61.8%(68/110)和30.2%(28/86)，顯示二者表達密切相關(guān)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表3。

附表3 196例膀胱癌患者中P53表達與VEGF和HIF-1α表達之間的關(guān)系

圖1 VEGF主要在細胞漿表達 圖2 HIF-1α主要在細胞漿表達 圖3 P53主要在細胞核表達

3 討論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，近年來，其發(fā)病率有增高和年青化的趨勢。美國癌癥協(xié)會2015年對美國腫瘤發(fā)病率及死亡率的統(tǒng)計結(jié)果表明，膀胱癌占全部腫瘤死亡原因的第6位，5年生存率在50%以下，我國癌癥協(xié)會2016年對國人腫瘤發(fā)生率及死亡率的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，膀胱癌占所有腫瘤死亡原因的第9位，5年生存率在40%左右。膀胱癌是血管依賴性的，其生長轉(zhuǎn)移離不開新生血管形成。研究證實，在腫瘤血管生成過程中，血管內(nèi)皮生長因子VEGF和缺氧誘導因子HIF-1α起著至關(guān)重要的作用[2,5]。

在目前已知的促血管形成因子中，VEGF被認為活性最強，特異性最高。雖然影響VEGF的因素很多，而HIF-1α的作用則最大，有學者甚至將其稱為VEGF的管家轉(zhuǎn)錄因子[6]。HIF-1α能與VEGF的一個增強子結(jié)合并啟動VEGF轉(zhuǎn)錄，使VEGF表達增加，進而促進腫瘤新生血管生成，加速腫瘤生長轉(zhuǎn)移[7]。本研究中我們觀察到在196例膀胱癌患者中，HIF-1α和VEGF共同陽性表達者76例，僅單獨陽性表達者，HIF-1α14例，VEGF24例，其差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)，提示兩者表達關(guān)系極為密切。

隨著研究的不斷深入，人們廣泛認為以往之所以以VEGF為靶點的抗血管生成治療腫瘤未達到人們所期待的治療效果是因為忽略了HIF-1α的信號轉(zhuǎn)錄作用。不過，也有近期研究認為對于極其復雜的腫瘤血管生成來說，它也可能受到一些原癌基因或抑癌基因調(diào)節(jié)的影響。由于野生型P53基因被證實是最重要的抑癌基因。野生型在正常組織細胞幾乎不表達，當組織細胞的微環(huán)境發(fā)生變化時，則由野生型演變?yōu)橥蛔冃瓦@種突變型P53在癌組織細胞高表達[8,9]。故本實驗同時檢測了VEGF、HIF-1α和P53這三種基因在膀胱癌中的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VEGF和HIF-1α與P53表達之間存在著不同程度的正相關(guān)性，其相關(guān)性均具有統(tǒng)計學意義(P53 vs VEGFP<0.01，P53 vs HIF-1αP<0.05)。

我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VEGF，HIF-1α和P53這三種標志物在本組196例膀胱癌患者中均呈現(xiàn)出高表達率，尤其是肌層浸潤和分化差的細胞其陽性表達率，與非肌層浸潤和分化好的細胞陽性表達率相比較，兩者差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。這表明突變型P53基因參與了腫瘤組織的新生血管形成從而在腫瘤細胞的生長轉(zhuǎn)移中扮演著不可忽略的角色。同時檢測VEGF，HIF-1α和P53蛋白對了解腫瘤惡性度、預測預后和指導后續(xù)隨訪治療更有幫助。因此在選擇分子靶向膀胱癌抗血管生成治療時，應重視雙靶位甚至多靶點的綜合治療策略[10，11]，如此才極有可能提升分子靶向用藥的基因治療膀胱癌的水平，從而為改善膀胱癌患者術(shù)后生活質(zhì)量和提高術(shù)后5年生存率帶來真正確實有效的幫助。