佩蘭乙醇提取物對(duì)結(jié)腸癌RKO細(xì)胞的抑制作用研究

姜念 宋長(zhǎng)偉 魏凌凱

【摘 要】 目的：研究佩蘭乙醇提取物對(duì)結(jié)腸癌RKO細(xì)胞的體外抗腫瘤作用。方法：SRB法檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率；倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化；免疫印跡法檢測(cè)結(jié)腸癌RKO細(xì)胞中Bcl-2蛋白、Cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果：佩蘭乙醇提取物在3μg/ mL時(shí)對(duì)結(jié)腸癌RKO細(xì)胞已具有抑制生長(zhǎng)作用，而且隨著濃度的增加其抑制率也逐漸升高，到20μg/ mL濃度時(shí)表現(xiàn)為完全抑制。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示佩蘭乙醇提取物處理后結(jié)腸癌RKO細(xì)胞后，細(xì)胞明顯皺縮變圓。免疫印跡法檢測(cè)到佩蘭乙醇提取物能降低結(jié)腸癌RKO細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)、增加Cleaved caspase-3的表達(dá)。結(jié)論：佩蘭乙醇提取物對(duì)結(jié)腸癌RKO細(xì)胞具有抑制生長(zhǎng)、促進(jìn)凋亡的作用。

【關(guān)鍵詞】 佩蘭乙醇提取物；結(jié)腸癌；RKO細(xì)胞；凋亡；Bcl-2；Cleaved caspase-3

【中圖分類號(hào)】R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2018）16-0032-04

Abstract：Objective To study the anti-tumor effects of ethanol extract from Eupatorium fortunei Turcz on colon cancer RKO cells in vitro. Methods The growth inhibition rate of cells was measured with SRB assay. The changes of cell morphology were observed by inverted microscope. The expression of Bcl-2 protein and Cleaved Caspase-3 protein in colon cancer RKO cells were detected by Western blot. Results The growth of RKO cells were inhibited of ethanol extract from Eupatorium fortunei Turcz at the concentration of 3μg/mL. Its inhibitory rate gradually increased with increasing concentration， and it completely inhibited at the concentration of 20μg/mL. The morphological observation showed that the RKO cells were significantly shrunken and round after the treatment with ethanol extract of Eupatorium fortunei Turcz. The result of Western blotting showed that the expression of Bcl-2 was decreased and the Cleaved caspase-3 was increased after the RKO cells were treated with ethanol extract of Eupatorium fortunei Turcz. Conclusion Theethanol extract of Eupatorium fortunei Turcz can inhibit the growth and promote apoptosis of RKO cells.

Keywords： Ethanol Extract from Eupatorium Fortunei Turcz；Colon Cancer；RKO Cells；Apoptosis；Bcl-2；Cleaved Caspase-3

結(jié)腸癌是發(fā)病率較高的消化道惡性腫瘤之一，其年發(fā)病率和死亡率在逐漸升高。近年來(lái)針對(duì)腫瘤的綜合治療水平在不斷提升，但并不能有效遏制結(jié)腸癌的進(jìn)展過(guò)程，結(jié)腸癌的死亡率仍居高不下。結(jié)腸癌的防治關(guān)鍵之一在于尋求有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物，探究潛在的天然產(chǎn)物作用對(duì)結(jié)腸癌的防治具有重要意義[1]。佩蘭為菊科澤蘭屬植物佩蘭Eupatorium fortunei Turez的地上部分，又名香草、小澤蘭、大澤蘭、雞骨香，主產(chǎn)于華東、華南和西南等地區(qū)，味微苦，性寒，具有清熱解暑、芳香化濕、健胃開胃、殺蟲抑菌等功效[2]?，F(xiàn)代藥理研究證明，佩蘭提取物具有抑菌、抗炎、降脂等作用[3-5]，但其抗腫瘤活性方面的研究報(bào)道很少，其抗腫瘤機(jī)制也不明[6-7]。本研究擬通過(guò)開展佩蘭乙醇提取物體外抑制結(jié)腸癌RKO細(xì)胞增殖進(jìn)行初步研究，以期為后期發(fā)現(xiàn)佩蘭抗癌活性單體化合物奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 3131型CO2培養(yǎng)箱、Multiskanspectrum全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）、NikonYS100熒光顯微鏡（日本Nikon公司）、化學(xué)發(fā)光儀（美國(guó)伯樂(lè)公司）。

1.2 材料 佩蘭采自四川，由遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心宋長(zhǎng)偉博士鑒定，標(biāo)本存放在醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心樣品保存室。RPMI-1640培養(yǎng)基（Hyclone公司）；胎牛血清（BI公司）；PBS粉末（BBI Life sciences公司）；SRB（Sigma公司）；Hoechst 33342染料（碧云天公司）；Bcl-2、Cleaved-caspase-3抗體（CST公司）。

1.3 結(jié)腸癌細(xì)胞株 人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞購(gòu)于上海吉?jiǎng)P公司。

2 方法

2.1 乙醇回流提取法獲得佩蘭乙醇提取物 稱取100g佩蘭粉碎成粗粉，用75%乙醇浸泡2h，回流提取3次，合并濾液減壓蒸餾得到佩蘭提取物浸膏。

2.2 SRB法檢測(cè)佩蘭乙醇提取物對(duì)結(jié)腸癌RKO細(xì)胞增殖抑制的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞，以2×104個(gè)細(xì)胞/孔的濃度接種于兩塊96孔板，一塊為對(duì)照板（T0），一塊為實(shí)驗(yàn)板；CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，對(duì)照板（T0）取出進(jìn)行SRB染色，在530nm波長(zhǎng)下測(cè)定 OD值。染色流程如下：棄掉培養(yǎng)基，加入10% TCA固定液4℃條件下固定2h；蒸餾水洗滌3次后自然晾干，每孔加入100μL的4mg/ mL的 SRB溶液，室溫下染色15min；棄上清，1%的醋酸沖洗5次、甩干，每孔加入100μL的10mM Tris溶液。利用DMSO溶解佩蘭乙醇提取物后，用培養(yǎng)液稀釋成不同濃度（3μg/mL、6μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL）的藥液，且DMSO的終濃度不能超過(guò)0.5%。實(shí)驗(yàn)板中加入上述配制好的不同濃度的藥液作為實(shí)驗(yàn)組（T），并設(shè)對(duì)照組（C）（加入200μL培養(yǎng)基），每組5個(gè)復(fù)孔，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后進(jìn)行 SRB染色并測(cè)量OD值，按以下公式計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率。

腫瘤生長(zhǎng)抑制率（%）=[1-OD（T）-OD（T0）OD（C）-OD（T0）]×100%

2.3 倒置顯微鏡觀察佩蘭乙醇提取物對(duì)RKO細(xì)胞形態(tài)的影響 細(xì)胞接種于兩塊96孔板（2×104個(gè)/孔），方法同2.1。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（加入200μL培養(yǎng)基）和實(shí)驗(yàn)組（佩蘭乙醇提取物組終濃度為 5μg/ mL、7.5μg/ mL、10μg/ mL）。細(xì)胞加藥培養(yǎng)48h后，倒置顯微鏡下觀察 RKO細(xì)胞形態(tài)的變化。

2.4 Western blot 檢測(cè)Bcl-2和Cleaved caspase-3的表達(dá) RKO細(xì)胞以 5×105 個(gè)/孔接種于 6 孔板中，培養(yǎng)24h 后，實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組（加入200μL培養(yǎng)基）、佩蘭乙醇提取物組（終濃度為5μg/mL、7.5μg/mL、10μg/mL），培養(yǎng)48h；提取細(xì)胞總蛋白，BCA測(cè)定蛋白樣品濃度，根據(jù)上樣量20μg與5×蛋白上樣緩沖液混合，沸水煮沸10min 使之變性。取樣品做 SDS-PAGE，全濕式電轉(zhuǎn)法將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上； 封閉液封閉 1.5h，分別加入一抗β-actin抗體、Bcl-2抗體、Cleaved caspase-3抗體，4℃孵育過(guò)夜，二抗（1∶1000）室溫孵育2h；ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)目的蛋白，在凝膠成像系統(tǒng)上測(cè)量灰度值并計(jì)算Bcl-2蛋白與Cleaved caspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)。

2.5 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)以“x±s”表示，采用 SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 佩蘭乙醇提取物對(duì)結(jié)腸癌RKO細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的影響 由圖1可知，佩蘭乙醇提取物濃度為3μg/mL時(shí)已對(duì)RKO細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用；隨著佩蘭乙醇提取物濃度的增加，RKO細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率增加；當(dāng)濃度為25μg/ mL時(shí)，RKO細(xì)胞的生長(zhǎng)完全被抑制。

3.2 佩蘭乙醇提取物對(duì)RKO細(xì)胞形態(tài)的影響 與對(duì)照組比較，佩蘭乙醇提取物終濃度為5μg/mL、7.5μg/mL、10μg/m作用48h后，實(shí)驗(yàn)組RKO細(xì)胞數(shù)量逐漸減少、細(xì)胞明顯皺縮變圓。如圖2所示。

3.3 佩蘭乙醇提取物對(duì)RKO凋亡過(guò)程中Bcl-2、Cleaved-caspase-3蛋白的變化 與對(duì)照組相比，當(dāng)佩蘭乙醇提取物濃度從5μg/mL至10μg/mL，均能使Bcl-2蛋白的相表達(dá)量降低，降低程度隨著佩蘭乙醇提取物濃度的增加而增加；同時(shí)Cleavedcaspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量呈濃度依賴性增加。當(dāng)佩蘭乙醇提取物濃度10μg/mL時(shí)，Bcl-2和Cleavedcaspase-3蛋白與對(duì)照組相比有顯著差異。如圖3～4所示。

4 討論

我國(guó)2015年癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示結(jié)直腸癌病例在全部惡性腫瘤中均位居5，其中新發(fā)病例37.6萬(wàn)，死亡病例19.1萬(wàn)，已成為嚴(yán)重危害中國(guó)人健康的疾病[8]?；熑耘f是臨床治療結(jié)直腸癌的主要手段之一，尋求有效抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物對(duì)腫瘤的防治具有重大的意義。佩蘭始載于《本草再新》，《神農(nóng)本草經(jīng)》列佩蘭于上品；1983年國(guó)外學(xué)者在佩蘭中發(fā)現(xiàn)了相對(duì)含量較高的揮發(fā)油、倍半萜烯類、萜醇類和黃酮類物質(zhì)[6]；藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)證明佩蘭中的倍半萜內(nèi)酯及黃酮類在體外實(shí)驗(yàn)中均具有抗癌活性；1993年李美麗等[7]報(bào)道了菊科佩蘭屬植物含有雙稠吡咯啶生物堿，該生物總堿在體外試驗(yàn)中表現(xiàn)出一定的抗腫瘤活性。目前，對(duì)佩蘭其他抗腫瘤活性成分及其機(jī)制的研究鮮見(jiàn)報(bào)道；為進(jìn)一步明確佩蘭的抗腫瘤效果與機(jī)制，本研究以乙醇回流提取法獲得佩蘭乙醇提取物并作用于結(jié)腸癌RKO細(xì)胞，觀察佩蘭乙醇提取物對(duì)RKO細(xì)胞的抑制效應(yīng)。結(jié)果顯示佩蘭乙醇提取物對(duì)RKO細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，抑制效果隨著濃度增加而升高；倒置顯微鏡觀察顯示佩蘭乙醇提取物作用于RKO細(xì)胞后，細(xì)胞核發(fā)生皺縮或裂解等細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變；與細(xì)胞凋亡相關(guān)的抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)呈劑量依賴性降低，而活化形式的促凋亡蛋白Cleaved-caspase-3的表達(dá)則呈劑量依賴性降低。以上結(jié)果提示佩蘭乙醇提取物呈濃度依賴性地促進(jìn)RKO細(xì)胞的凋亡。

細(xì)胞凋亡受多條信號(hào)通路調(diào)控，眾多關(guān)鍵蛋白在凋亡中發(fā)揮重要作用；其中Bcl-2基因被稱為“存活基因”，其基因產(chǎn)物Bcl-2蛋白具有抑制細(xì)胞丟失、阻止細(xì)胞凋亡的作用[10] ；Bcl-2基因激活與大腸癌分化、轉(zhuǎn)移有關(guān)，可作為大腸癌預(yù)后的指標(biāo)之一[11]。激活的Caspase-3蛋白是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，具有剪切管家蛋白和DNA片段的功能，是參與凋亡途徑的關(guān)鍵效應(yīng)分子。本研究發(fā)現(xiàn)佩蘭乙醇提取物可以使RKO細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)降低，而活化的Caspase-3蛋白表達(dá)增加；佩蘭乙醇提取物可能通過(guò)抑制了Bcl-2蛋白的表達(dá)、促進(jìn)活化的Caspase-3蛋白的表達(dá)而達(dá)到促細(xì)胞凋亡作用。

綜上所述，佩蘭乙醇提取物可以抑制RKO細(xì)胞生長(zhǎng)，通過(guò)抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)和促進(jìn)caspase-3蛋白的活化而促使RKO細(xì)胞發(fā)生凋亡；具體何種成分發(fā)揮了該功效需要進(jìn)一步通過(guò)天然藥物化學(xué)的分離技術(shù)輔以活性追蹤的手段捕捉活性單體化合物。

參考文獻(xiàn)

[1]繆冬映.苦參堿對(duì)結(jié)腸癌 SW480 細(xì)胞凋亡的影響[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)， 2018， 4（33）： 517-520.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[ M ]. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015： 216-217.

[3]劉杰，金巖.佩蘭揮發(fā)油的提取與 GC-MS 分析及其抑菌活性研究[J].河北農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011， 15（3） ： 150-154.

[4]孫紹美，宋玉梅，劉儉，等.佩蘭揮發(fā)油藥理作用的研究[J].西北藥學(xué)雜志， 1995， 10（1） ： 24-26.

[5]胡秀，蘭艷，宮麗，等.佩蘭提取物降脂活性的實(shí)驗(yàn)研究[J].科學(xué)技術(shù)與工程， 2015 （26）： 128-130.

[6]Herdriks H. pyrrolizidine alkalobis flavonoids and volatile compounds in the genus Eu. Patorium. E Cannabium ancjent drug with new perspective[J]. Pkarm Weekbl ， 1983， 5（6）：28l-286.

[7]李美麗， 趙香蘭. 日本佩蘭生物總堿抗癌活性的研究[J]. 癌癥， 1993， 12（3） ： 203-206.

[8]Chen W，Zheng R， Baade PD， et al. Cancer statisticsin china 2015[J].CA Cancer J CLin， 2016， 66（2）：115-132.

[9]徐明昊，張悅，孫明華，等.通過(guò)奧沙利鉑抑制 PI3K/Akt 通路以增強(qiáng) TRAIL 誘導(dǎo)結(jié)腸癌RKO細(xì)胞凋亡敏感性的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)， 2013， 16（23）：2113-2116.

[10]張濤，陳玉，王小平，等.基于 PI3K /Akt 通路探討健脾清熱活血方含藥血清對(duì)人結(jié)腸癌 SW480 細(xì)胞增殖、凋亡、周期及 P-β-catenin 表達(dá)的影響[J]. 中藥材， 2016， 39（7） ： 1618 -1622.

[11]董曉彤，黃瑩，李巍，等.Caspase-3、Bcl-2的表達(dá)在結(jié)腸癌診斷中的臨床意義[J].世界華人消化雜志， 2013， 21（30）： 3281-3285.

（收稿日期：2018-06-27 編輯：程鵬飛）