甜菊單倍體的離體誘導(dǎo)初探

楊永恒，張永俠，徐曉洋，孫玉明，張 婷，原海燕，黃蘇珍

（江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所，江蘇南京210014）

單倍體 （Haploid）是指含有配子染色體數(shù)目的個(gè)體。對(duì)單倍體進(jìn)行加倍可在一個(gè)世代內(nèi)獲得遺傳上100%純合的雙單倍體（Doubled haploid,DH），雙單倍體不存在等位基因位點(diǎn)的顯隱性作用，隱性基因控制的性狀能夠獲得充分體現(xiàn)，因此可極大降低篩選育種材料時(shí)的誤選概率[1]。此外，單倍體和雙單倍體還可為突變體篩選、轉(zhuǎn)基因研究、基因功能鑒定、遺傳群體構(gòu)建、細(xì)胞學(xué)研究等提供理想材料。單倍體作為重要的遺傳材料和研究對(duì)象，是當(dāng)前植物研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)[2]。

甜菊（Stevia rebaudiana Bertoni）又名甜葉菊，為原產(chǎn)南美洲的菊科多年生草本植物。其植物體（主要是葉片）獨(dú)有的甜菊糖苷（Steviol glycosides）因具有高甜度、低熱量的特性[3]和降血糖[4-5]、降血壓[6-8]等藥用價(jià)值而備受關(guān)注。我國(guó)自1976年引種甜菊以來(lái)就開(kāi)始了全國(guó)范圍的推廣種植，目前已經(jīng)成為世界第一的甜菊種植大國(guó)和甜菊糖苷原料出口大國(guó)[9]。隨著甜菊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，甜菊遺傳育種研究越顯得重要和迫切。由于進(jìn)行甜菊單倍體培養(yǎng)有助于快速純化育種材料，加快育種進(jìn)程，克服其自交不親和障礙，提高育種效率，因此人工誘導(dǎo)甜菊單倍體發(fā)生勢(shì)在必行。但目前相關(guān)研究很少，僅有Flachsland等1996年通過(guò)甜菊花藥培養(yǎng)獲得再生植株的報(bào)道，且其細(xì)胞學(xué)分析發(fā)現(xiàn)再生植株均為二倍體（2n=22）[10]，而通過(guò)未受精胚珠進(jìn)行雌核發(fā)育誘導(dǎo)的研究尚無(wú)報(bào)道。為此，本研究對(duì)甜菊花藥和未受精胚珠分別進(jìn)行離體培養(yǎng)誘導(dǎo)單倍體，以期獲得單倍體植株，為甜菊育種及遺傳學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以本課題組自育的高甜菊苷（Stevioside）和高萊鮑迪苷A（R-A）‘中山6號(hào)’為材料。試驗(yàn)材料栽種于江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所甜菊種質(zhì)資源圃，于2015年7—10月甜菊花期采集頭狀花序作為外植體。

1.2 方法

1.2.1 甜菊花形態(tài)及花藥發(fā)育時(shí)期觀(guān)察 于晴天上午8～12時(shí)采集甜菊頭狀花序，立即置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中送回實(shí)驗(yàn)室，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩；ㄐ螒B(tài)觀(guān)察：剝?nèi)☆^狀花序中小花，觀(guān)察開(kāi)花前不同天數(shù)的花序外觀(guān)及其對(duì)應(yīng)小花的形態(tài)?；ㄋ幇l(fā)育時(shí)期觀(guān)察：從小花中剝?nèi)』ㄋ?，用改良石炭酸品紅染色5～8 min后，壓片，顯微鏡觀(guān)察花藥及花粉形態(tài)。

1.2.2 花藥離體培養(yǎng) 采集適宜大小的甜菊頭狀花序，置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中送回實(shí)驗(yàn)室，4℃低溫處理24 h。外植體消毒：頭狀花序用紗布包裹，于流水下沖洗30 min，瀝干水分轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)，先用75%乙醇消毒30 s后，0.1%升汞浸泡3～4 min，再用無(wú)菌水清洗3～4次，然后將花序放置于鋪有無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中晾干。花藥分離與接種：用無(wú)菌小鑷子剝開(kāi)頭狀花序苞片，從花序中拔出花蕾，用解剖針刺破花蕾的花冠頂部，擠出花藥。將分離出的單個(gè)花藥用解剖針接種于培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)皿用保鮮膜封口。花藥培養(yǎng)：將接種花藥的培養(yǎng)皿置于暗處培養(yǎng)，每7天換一次新鮮培養(yǎng)基。形成愈傷組織后進(jìn)行繼代或轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基。

1.2.3 未受精胚珠離體培養(yǎng) 花序套袋：甜菊盛花期，選擇健壯植株上的花序，用鑷子去掉已經(jīng)開(kāi)放的小花，用硫酸紙袋將整個(gè)花序套住并用回形針?lè)饪??；ɡ俨杉簭奶状ㄐ蛑胁杉_(kāi)花前2天至開(kāi)花后2天的頭狀花序，置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。外植體消毒方法與花藥培養(yǎng)相同。

未受精胚珠分離與培養(yǎng)：用無(wú)菌小鑷子從頭狀花序中取出花蕾，并根據(jù)花蕾形態(tài)按開(kāi)放時(shí)間進(jìn)行分類(lèi)，再用解剖針輕輕劃開(kāi)子房壁，用針尖剝出胚珠，將分離出的單個(gè)胚珠用解剖針接種于培養(yǎng)基表面，不同時(shí)期的胚珠分開(kāi)接種，培養(yǎng)皿用保鮮膜封口，置于25℃培養(yǎng)，每7～10天換一次新鮮培養(yǎng)基。生根：待胚狀體萌發(fā)后將其移入不含激素的1/2 MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根。移栽：生根后將幼苗移入無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)土，常規(guī)養(yǎng)護(hù)。

1.2.4 再生植株倍性鑒定 染色體計(jì)數(shù)法：取2～3 mm的再生植株幼嫩根尖，經(jīng)卡諾固定液處理過(guò)夜，45%乙酸軟化后，切取根尖部分用改良石炭酸品紅染色5～10 min，覆上蓋玻片，然后用鑷子輕輕敲片，以便根尖組織散開(kāi)，在顯微鏡下觀(guān)察。選取染色體分散較好的體細(xì)胞進(jìn)行拍照，統(tǒng)計(jì)染色體數(shù)。

1.2.5 再生植株的性狀調(diào)查 于2016年2—4月在溫室中扦插繁殖親本‘中山6號(hào)’和再生植株‘15-01’、‘15-02’，5月初選植株大小一致的扦插苗同時(shí)移栽花盆，每盆1棵，每株系移栽10盆，統(tǒng)一養(yǎng)護(hù)管理，觀(guān)察和測(cè)量各植株現(xiàn)蕾期、株高、葉長(zhǎng)、葉寬等性狀。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 誘導(dǎo)率（%）=有胚狀體發(fā)生的外植體數(shù)／外植體總數(shù)×100。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel統(tǒng)計(jì)分析。

圖1 開(kāi)花前0～5天的甜菊花序和花的形態(tài)Fig.1 Morphology of stevia capitulum and flower before 5 days of flowering

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菊花形態(tài)及花粉發(fā)育時(shí)期觀(guān)察

甜菊開(kāi)花當(dāng)天（0d）至開(kāi)花前五天（－5d）的頭狀花序及花形態(tài)如圖1所示。甜菊一般由5～6朵花聚生為頭狀花序，外被5枚苞片，管狀花冠，具冠毛，下位子房。開(kāi)花前第5天 （－5d），頭狀花序長(zhǎng)0.6～0.8 cm，苞片緊閉，花淺綠色，長(zhǎng)0.05～0.08 cm，子房長(zhǎng)度為花冠的 1/6～1/5；開(kāi)花前第 4 天（－4d），頭狀花序長(zhǎng) 1.0～1.2 cm，苞片閉合，花淺綠色，長(zhǎng)0.1～0.15 cm，子房長(zhǎng)度為花冠的 1/6～1/5；開(kāi)花前第 3 天（－3d），頭狀花序長(zhǎng) 1.0～1.2 cm，苞片上端微微張開(kāi)，花長(zhǎng)0.3～0.4 cm，子房長(zhǎng)度為花冠的1/6～1/5；開(kāi)花前第2天（－2d），頭狀花序長(zhǎng)1.0～1.2 cm，苞片張開(kāi)，花長(zhǎng)為0.4～0.6 cm，與冠毛等長(zhǎng)，子房長(zhǎng)度為花冠的1/3～1/1.8；開(kāi)花前第1天（－1d），苞片張開(kāi)，花冠頂部變白，花長(zhǎng)0.5～0.7 cm，子房長(zhǎng)度為花冠的1/1.8～1/2；開(kāi)花當(dāng)天（0d），花冠白色且高于苞片，花長(zhǎng)0.8～1.0 cm，子房長(zhǎng)度約為花冠的1/2。觀(guān)察發(fā)現(xiàn)同一花序中花發(fā)育不一致，開(kāi)放時(shí)間相差1～3 d。

圖2 甜菊花粉發(fā)育過(guò)程Fig.2 The development process of stevia pollen

觀(guān)察頭狀花序及花形態(tài)的同時(shí)分離花藥，通過(guò)改良石炭酸品紅染色壓片，顯微鏡觀(guān)察小孢子發(fā)育時(shí)期（圖2），結(jié)果表明開(kāi)花前第5天（－5d）花粉母細(xì)胞開(kāi)始進(jìn)行減數(shù)分裂并在同一天內(nèi)形成四分體和單核小孢子（圖 2 A、B、C、D），開(kāi)花前第 5～4 天（－5～－4d）形成花粉壁（圖 2 E），至開(kāi)花前第 3 天（－3d）就已經(jīng)形成成熟的花粉粒（圖2 F），成熟的甜菊花粉呈圓球形，表面密布刺狀紋飾，有3條輻射對(duì)稱(chēng)的萌發(fā)溝。通過(guò)對(duì)甜菊花蕾的大小形態(tài)和小孢子發(fā)育時(shí)期的觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，開(kāi)花前第5天頭狀花序長(zhǎng)0.6～0.8 cm，苞片緊閉，花蕾長(zhǎng)度約0.08 cm時(shí)，其小孢子多數(shù)處于四分體時(shí)期或單核早期，前人研究認(rèn)為單核靠邊期（圖2，D）的花藥適于單倍體誘導(dǎo)[11]。因此甜菊花序的外觀(guān)和花蕾的大小能間接指示小孢子發(fā)育的大概時(shí)期，可作為花藥培養(yǎng)取材時(shí)期的判斷依據(jù)。

表1 甜菊花藥誘導(dǎo)單倍體的培養(yǎng)基激素配比Table 1 Concentration of hormone in medium for stevia haploid induction by anthers culture

表2 甜菊未受精胚珠誘導(dǎo)單倍體的培養(yǎng)基激素配比Table 2 Concentration of hormone in medium for stevia haploid induction by unfertilized ovules culture

2.2 花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)單倍體

在花粉觀(guān)察的基礎(chǔ)上選取長(zhǎng)度約0.08 cm的花蕾，分離花藥進(jìn)行單倍體誘導(dǎo)。以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)添加6-BA、NAA、KT等植物激素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合（表1），結(jié)果表明花藥接種在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基（培養(yǎng)基1～17）上7天即可誘導(dǎo)出愈傷，其中MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA誘導(dǎo)率最高，為80%（圖3 B、C），然而轉(zhuǎn)接分化培養(yǎng)基（培養(yǎng)基18～20）后只出現(xiàn)少量綠點(diǎn)，多次轉(zhuǎn)接后褐化死亡，未能誘導(dǎo)分化形成胚狀體及植株（圖3 D），因此花藥愈傷的誘導(dǎo)分化還需進(jìn)一步研究。

圖3 甜菊花藥離體培養(yǎng)Fig.3 Stevia anther culture in vitro

2.3 未受精胚珠培養(yǎng)誘導(dǎo)單倍體

分離不同開(kāi)花時(shí)期花蕾的胚珠進(jìn)行離體培養(yǎng)，配置 MS+0～2.0 mg/L 6-BA+0.5～2.0 mg/L NAA+0～300 mg/L水解酪蛋白 （CH）+4%～10%蔗糖一系列誘導(dǎo)培養(yǎng)基（表 2），每種培養(yǎng)基分別接種各時(shí)期胚珠50～100個(gè)。結(jié)果表明開(kāi)花當(dāng)天（0d）的胚珠適于誘導(dǎo)培養(yǎng)，開(kāi)花前2 d（－2d）和前 1 d（－1d）的胚珠較幼嫩，接種后沒(méi)有膨大，會(huì)變黃并慢慢干癟，而開(kāi)花后 1 d（＋1d）和 2 d（＋2d）的胚珠會(huì)快速膨大，但是最終變透明空癟（表3）。培養(yǎng)基篩選結(jié)果表明MS+0.04 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA+4%蔗糖是最適培養(yǎng)基，可直接誘導(dǎo)出胚狀體，誘導(dǎo)率為1.2%。本試驗(yàn)共誘導(dǎo)出胚狀體4個(gè)，轉(zhuǎn)接不含激素的1/2 MS培養(yǎng)基后2株生根，并移栽存活，但經(jīng)根尖細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)均為二倍體（2n=22）（圖 4）。

2.4 再生植株的性狀調(diào)查

觀(guān)察發(fā)現(xiàn)兩個(gè)再生植株的現(xiàn)蕾期分別比親本‘中山6號(hào)’晚4天和8天，‘15-01’的株高小于親本，莖節(jié)數(shù)和分枝較少，莖也較細(xì)弱，但其葉片較細(xì)長(zhǎng)，葉長(zhǎng)寬比平均為7.21；而‘15-02’株高高于親本，但其莖節(jié)數(shù)和分枝少于親本，葉片長(zhǎng)寬也小于親本（表4）。兩個(gè)再生植株根尖染色體計(jì)數(shù)結(jié)果表明其均為二倍體，但形態(tài)學(xué)上兩再生植株相互間，及其與親本之間差異明顯，推測(cè)可能是單倍體自然加倍的結(jié)果，然而這一推測(cè)還有待進(jìn)一步試驗(yàn)證明。

表3 不同時(shí)期對(duì)甜菊未受精胚珠單倍體誘導(dǎo)的影響Table 3 Effect of days to bloom on haploid induction by stevia unfertilized ovules culture

圖4 甜菊未受精胚珠離體培養(yǎng)Fig.4 Stevia unfertilized ovules culture in vitro

表4 親本及再生植株的性狀統(tǒng)計(jì)Table 4 Characters of the parent and two regeneration plants

3 討論

3.1 花藥離體培養(yǎng)誘導(dǎo)單倍體發(fā)生

因?yàn)樘鹁盏幕ê突ㄋ帢O小，處于單核靠邊期的花蕾僅0.08 cm，其花藥更小，且每個(gè)頭狀花序僅5～6朵花，每朵花僅5枚花藥，同一花序中小花發(fā)育不一致，使得分離適宜時(shí)期的花藥難度很大，操作耗時(shí)。本試驗(yàn)雖然得到大量愈傷組織，但是未能誘導(dǎo)分化出再生植株。由于花藥離體培養(yǎng)誘導(dǎo)單倍體在大麥（Hordeum vulgare L.）[12]、 小麥 （Triticum aestivum L.）[13]、 玉米 （Zea mays L.）[14]、 煙草 （Nicotiana tabacum L.）[15]、 番茄（Lycopeisicvm esculenetum Mill）[16]、辣椒（Capsicum annuum L.）[17]等多種植物中已成功應(yīng)用，且研究認(rèn)為影響小孢子單倍體誘導(dǎo)效率的因素主要有：（1）材料基因型及生長(zhǎng)狀態(tài)；（2）小孢子發(fā)育時(shí)期；（3）可引發(fā)小孢子胚發(fā)生的預(yù)處理；（4）培養(yǎng)基種類(lèi)及相關(guān)添加物。因此，今后通過(guò)擴(kuò)大誘導(dǎo)材料基因型的選擇范圍，嘗試多種預(yù)處理方法，以及篩選適宜培養(yǎng)基和添加物等，有望摸索出甜菊花藥誘導(dǎo)單倍體的方法。

3.2 未受精胚珠離體培養(yǎng)誘導(dǎo)單倍體發(fā)生

植物離體雌核發(fā)育最初主要是未授粉胚珠或子房的培養(yǎng)，但近年來(lái)有越來(lái)越多的研究者通過(guò)培養(yǎng)花蕾甚至花序來(lái)獲得雌性單倍體，目前離體雌核發(fā)育應(yīng)用得最成功的植物是甜菜（Beta vulgaris L.），其次是洋蔥（Allium cepa L.）、非洲菊（Gerbera jamesonii Bolus）、煙草等[18]。甜菊中尚未有相關(guān)報(bào)道，本研究中通過(guò)對(duì)甜菊未受精胚珠進(jìn)行離體培養(yǎng)僅誘導(dǎo)出4個(gè)胚狀體，最終得到兩個(gè)再生植株且均為二倍體。由于離體誘導(dǎo)雌性單倍體的效果受到供體植株的基因型、生理狀態(tài)、胚囊發(fā)育時(shí)期、材料預(yù)處理，培養(yǎng)基、培養(yǎng)方式、培養(yǎng)條件等一系列因素的影響[18]，因此想在甜菊中通過(guò)雌核成功誘導(dǎo)單倍體仍需要大量試驗(yàn)摸索。

3.3 單倍體培養(yǎng)再生植株的自然加倍

本研究中利用甜菊未受精胚珠離體培養(yǎng)獲得兩個(gè)再生植株，經(jīng)根尖染色體計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)均為二倍體。以往的研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)單倍體培養(yǎng)獲得的再生植株多是一個(gè)由單倍體、二倍體及多倍體構(gòu)成的混雜群體，且非單倍體率在不同作物以及不同基因型間存在顯著差異。溫鑫等接種74200個(gè)‘嘎啦’蘋(píng)果（Malus pumila‘Gala’）花藥，最終成功誘導(dǎo)形成386個(gè)胚狀體，經(jīng)分化培養(yǎng)獲得64株再生苗，移栽獲得30個(gè)成活再生株系，其中包括28個(gè)二倍體株系，1個(gè)單倍體株系和1個(gè)四倍體株系[19]。王麗花等對(duì)23個(gè)非洲菊花藥培養(yǎng)再生植株的倍性進(jìn)行分析，結(jié)果21.7%為二倍體，43.5%為單倍體，34.8%為混倍體[20]。由于兩再生植株的現(xiàn)蕾期、株高、莖粗、葉形等性狀與親本差異明顯，推測(cè)可能是單倍體自然加倍的結(jié)果。染色體自然加倍現(xiàn)象在植物單倍體培養(yǎng)中廣泛存在，Zhang和Takahata 2001年報(bào)道了45個(gè)大白菜基因型的小孢子再生植物的自然加倍情況，其中95%的基因型自然加倍率超過(guò)50%[21]。Chatelet等在花椰菜的小孢子培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)27個(gè)基因型的自發(fā)二倍體率均在55%以上[22]。染色體自然加倍現(xiàn)象同樣也發(fā)生在大孢子單倍體誘導(dǎo)研究中，李偉通過(guò)西葫蘆未受精子房離體培養(yǎng)獲得再生植株，其中二倍體植株占被檢測(cè)植株的60%[23]。盡管單倍體自然加倍現(xiàn)象普遍存在，但其機(jī)理尚不完全清楚，主要有核內(nèi)復(fù)制、細(xì)胞核融合、核內(nèi)有絲分裂等假說(shuō)[24]。