兩步酶法在小鼠睪丸支持細(xì)胞分離與培養(yǎng)過程中的研究

南濤 張奎原 張虎 駱衡 徐述雄 宋大龍 羅光恒 孫兆林 胡建新

【摘 要】 目的：探討兩步酶法分離小鼠睪丸支持細(xì)胞以及在體外培養(yǎng)、純化、鑒定過程中的優(yōu)越性。方法：選取7～8d雄性昆明小鼠，用膠原酶Ⅳ及胰蛋白酶兩步酶法分離小鼠睪丸組織獲得支持細(xì)胞，利用細(xì)胞差速貼壁特性純化支持細(xì)胞，利用倒置顯微鏡、PI染色、特異性抗體標(biāo)記的方法從多個(gè)維度鑒定小鼠睪丸支持細(xì)胞。結(jié)果：培養(yǎng)72 h后支持細(xì)胞呈片狀平鋪于培養(yǎng)皿底層，相互接觸，連接成片。用波形蛋白特異性鑒定證實(shí)本實(shí)驗(yàn)分離所獲得的小鼠睪丸支持細(xì)胞。經(jīng)過PI染色提示這些支持細(xì)胞為具有活性的支持細(xì)胞。結(jié)論：本研究提示兩部酶法是一種簡(jiǎn)便且高效的分離小鼠睪丸支持細(xì)胞的有效方法，值得推廣。

【關(guān)鍵詞】 兩部酶法；細(xì)胞分離；睪丸支持細(xì)胞；研究

【中圖分類號(hào)】R-332 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2018）06-0041-04

Abstract：Objective To investigate the advantages of the two step enzyme method to Isolated mouse Sertoli cells and culture in vitro，purify and identify.Methods Selection the KunMing male mice which born 7-8 days，using collagenase IV and trypsin to digestive testis tissue to get the sertoli cell and spermatogonium.Purification of Sertoli cells using differential adherent characteristics of the two cells.Sertoli cells were identified in several ways by using inverted microscopy， PI staining， and specific antibody labeling.Results After 72 hours of culture，The Sertoli cell spread at the bottom of the culture dish in？patches，and there are no obvious spermatogonial stem cells here whice looks like round.The PI staining indicated that these Sertoli cells are active.Vimentin specific identification proved that the isolated Testis Sertoli cells were obtained in this study.To verify what we got from the seperation experiment were the sustentacular cells of mouse testicles through vimentin specificity identification.Conclusion This research suggests the two enzymes is a simple and efficient method for separating Sertoli cells from mouse testis，the method is worth to be spread.

Keywords：Two Step Enzyme Method；Cell Separation；Sertoli Cells；Research

小鼠睪丸支持細(xì)胞是存在于小鼠睪丸生精上皮內(nèi)的一種非生殖細(xì)胞，對(duì)生殖細(xì)胞具有支持營養(yǎng)作用[1]，每個(gè)支持細(xì)胞都營養(yǎng)著一定數(shù)目的生殖細(xì)胞[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)其可通過旁分泌途徑分泌多種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，如膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)營養(yǎng)因子GDNF、表皮生長(zhǎng)因子EGF、轉(zhuǎn)化因子等，維持精原細(xì)胞周圍微環(huán)境為其提供營養(yǎng)支持并調(diào)控其增值及分化[4-6]。因此分離出高純度的支持細(xì)胞對(duì)研究精原細(xì)胞的增值并分化成為精子的過程具有重要意義。研究精子在體內(nèi)的發(fā)生機(jī)制及其影響因素，必須模擬其真實(shí)的體內(nèi)環(huán)境，分離高純度的支持細(xì)胞是其必要條件。以往國內(nèi)實(shí)驗(yàn)分離過程較為繁瑣，純度不高，本實(shí)驗(yàn)在文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上改良分離方法，就如何簡(jiǎn)便高效率的分離小鼠睪丸支持細(xì)胞并進(jìn)行純化和鑒定做出初步探討，為今后進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 動(dòng)物 出生7～8 d的雄性昆明小白鼠，由貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱（薩默飛世爾科技有限公司）；clean work station潔凈操作臺(tái)（薩默飛世爾科技有限公司）；BECKMAN-COULTER臺(tái)式離心機(jī)；Nikon倒置顯微鏡；Axiocam-Mrc倒置熒光顯微鏡；電子天平（梅特勒托利儀器有限公司）；一抗波形蛋白（Proteintech公司）；二抗FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG（Proteintech公司）；膠原酶Ⅳ（北京索萊寶科技有限公司）；胰蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司）；胎牛血清（北京索萊寶科技有限公司）；DMEM/F-12培養(yǎng)基（Sigma公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 原代小鼠睪丸支持細(xì)胞的分離 取出生7～8d的雄性昆明小鼠15只，脫頸處死，泡置75%酒精5 min，消毒。于超凈工作臺(tái)內(nèi)，分離小鼠雙側(cè)睪丸，放入盛有PBS的培養(yǎng)皿中，并于培養(yǎng)皿中鈍性分離白膜。用吸管將睪丸轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，用PBS吹打洗滌3遍，充分去除白膜及睪丸周圍組織，去除上清。剪碎睪丸組織，加入10倍體積0.2%膠原酶Ⅳ，37 ℃水浴鍋消化10 min。加入5～10mLPBS輕輕吹打1～2 min，600 r/min離心2min，棄上清，重復(fù)2次。加入10倍體積的0.25%胰蛋白酶（無EDTA），于37 ℃水浴鍋消化20 min，期間每3min搖晃吹打一次，使得睪丸組織充分接觸胰酶。加入等量含10%胎牛血清DMEM/F-12培養(yǎng)基終止消化，200目細(xì)胞篩過濾懸液。濾液于1000 r/min離心6 min，棄上清，加入10倍體積含10%胎牛血清DMEM/F-12培養(yǎng)基充分吹洗，重復(fù)3次。細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度5×105個(gè)/mL接種于的含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基中，放置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 原代小鼠睪丸支持細(xì)胞的純化 原代細(xì)胞培養(yǎng)6 h后取出，輕輕搖晃培養(yǎng)皿，將未貼壁及貼壁不牢固的精原細(xì)胞游離，吸取丟棄培養(yǎng)液及游離的精原細(xì)胞。加入新的培養(yǎng)液。分別于12 h、18 h、24 h重復(fù)上述操作。培養(yǎng)至48h，0.25%胰蛋白酶（無EDTA）2 mL加入培養(yǎng)皿中，快速搖勻消化15 s，棄掉胰酶及消化下的剩余精原細(xì)胞。加入培養(yǎng)基搖晃清洗3遍后繼續(xù)至于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72h后重復(fù)上述步驟1次。

2.3 小鼠支持細(xì)胞的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 小鼠支持細(xì)胞培養(yǎng)6h開始貼壁，12h呈條梭型，24h胞體出現(xiàn)突觸，48h細(xì)胞進(jìn)一步鋪展呈片狀。而精原干細(xì)胞則呈現(xiàn)圓形隨著培養(yǎng)連接呈圓形串珠樣，以此可初步鑒別。

2.3.2 小鼠睪丸支持細(xì)胞的免疫學(xué)鑒定 取培養(yǎng)2周支持細(xì)胞做鑒定，PBS洗滌2遍，3 min/遍。加入4%多聚甲醛固定20 min后PBS洗滌3遍，3 min/遍。加入4 mL的0.1%Tween-20（PBST）于培養(yǎng)皿10 min透化細(xì)胞，PBS洗滌2遍，3 min/遍。加入含5%BSA的PBST（封閉液）封閉細(xì)胞45 min。用一抗封閉液按1∶200稀釋一抗并加入培養(yǎng)皿，4 ℃冰箱過夜。二抗稀釋液洗滌細(xì)胞3遍，5 min/遍。用二抗封閉液按1∶200稀釋二抗并加入培養(yǎng)皿，37 ℃度培養(yǎng)箱放置90 min。PBS洗滌細(xì)胞3遍，加入DAP試劑覆蓋細(xì)胞表面1 min，PBS洗滌3次。熒光顯微鏡觀察。

3 結(jié)果

3.1 倒置顯微鏡觀察 初步分離的細(xì)胞為精原細(xì)胞及支持細(xì)胞混合懸液，由于兩種細(xì)胞均呈現(xiàn)游離狀態(tài)，顯微鏡觀察均呈現(xiàn)圓形，無法鑒別，培養(yǎng)6h左右開始貼壁生長(zhǎng)，呈規(guī)則小圓形，精原細(xì)胞呈現(xiàn)游離狀態(tài)，形狀仍為規(guī)則圓形（圖1）。培養(yǎng)12h后，支持細(xì)胞進(jìn)一步貼壁，呈現(xiàn)梭型，部分殘存精原干細(xì)胞呈圓形。培養(yǎng)24h后，可見支持細(xì)胞部分伸出突觸，細(xì)胞間仍有空隙（圖2）。培養(yǎng)72h，可見支持細(xì)胞平鋪于培養(yǎng)皿底部，呈片狀，伸出3～5個(gè)突觸，細(xì)胞之間相互接觸。可見細(xì)胞核位于胞體中部或稍偏位（圖3）。

3.2 DAPI染色 DAPI是一種可以穿透細(xì)胞膜與細(xì)胞核中DNA結(jié)合的熒光染料。對(duì)支持細(xì)胞PI染色，在熒光顯微鏡下可見細(xì)胞核呈藍(lán)色，散在分布，細(xì)胞核的位置及支持細(xì)胞的位置所在（圖4）。

3.3 免疫組化鑒定 用支持細(xì)胞特異性抗體波形蛋白（一抗）標(biāo)記支持細(xì)胞，用帶有綠色熒光的FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG（二抗）特異性結(jié)合一抗，于熒光顯微鏡下觀察到支持細(xì)胞呈現(xiàn)綠的片狀，相互接觸（圖5）。細(xì)胞位置與對(duì)應(yīng)的PI染色一致?？勺C明為存活的小鼠睪丸支持細(xì)胞。

4 討論

小鼠睪丸組織內(nèi)的支持細(xì)胞，是一種具有重要功能的間質(zhì)細(xì)胞，為精子的發(fā)育提供必要的微環(huán)境[7]。研究表明支持細(xì)胞的數(shù)量影響著睪丸的大小及睪丸中所發(fā)育成熟的精子的數(shù)量及質(zhì)量[8]。平均每個(gè)小鼠睪丸中能獲得細(xì)胞在105～106個(gè)左右，其中支持細(xì)胞占大部分[9]。對(duì)支持細(xì)胞進(jìn)行高純度的分離及體外培養(yǎng)是進(jìn)一步研究精子的發(fā)生發(fā)展的必要先決條件。1周左右小鼠睪丸生精小管組織中存在大量支持細(xì)胞且增殖活躍[10]。實(shí)驗(yàn)選用出生7～8d小鼠，既保證了所獲取細(xì)胞的純度，又避免了小鼠過小帶來的取材不便等問題。目前分離與純化小鼠睪丸支持細(xì)胞的方法沒有一種較為統(tǒng)一的方法，以往報(bào)道的支持細(xì)胞分離純化方法有一步酶分離法，Percoll密度梯度分離純化法等，一步酶分離法實(shí)驗(yàn)過程較為簡(jiǎn)單，細(xì)胞存活率較高，但所得細(xì)胞純度不高且組織雜質(zhì)較多需要后續(xù)進(jìn)一步去除。Percoll密度梯度分離法可將支持細(xì)胞及精原細(xì)胞充分分離，得到高純度的兩種細(xì)胞，但高速離心的時(shí)間就需20 min左右，長(zhǎng)時(shí)間的高速離心會(huì)使得細(xì)胞受到離心力較大影響，使得分離所得細(xì)胞存活率較低，故所需的實(shí)驗(yàn)原料過多，且此種方法對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器及實(shí)驗(yàn)操作過程要求較高，實(shí)驗(yàn)步驟較復(fù)雜不適宜初學(xué)者。此外還有免疫磁株分選法及免疫熒光分選法，此兩種方法成本過高，操作繁瑣，極大地限制了其應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)采用兩步酶分離法，第一步先去除睪丸中的間質(zhì)纖維等組織，第二步消化分離支持細(xì)胞。利用小鼠睪丸支持細(xì)胞貼壁速率不同，6 h時(shí)支持細(xì)胞基本已經(jīng)完成貼壁，而精原細(xì)胞大多仍呈現(xiàn)游離狀態(tài)，此時(shí)進(jìn)行第一次換液，可以去除大部分精原細(xì)胞，為初步一次純化。此后利用差速貼壁多次換液進(jìn)一步純化。因?yàn)槎啻握鹗帗Q液，在48h時(shí)已使得精原細(xì)胞只有極少一部分不牢固的貼壁殘余，此時(shí)使用胰蛋白酶短時(shí)間快速消化并換液，使得這一部分殘余精原細(xì)胞被進(jìn)一步去除，而活力較好的支持細(xì)胞則因?yàn)橘N壁較為牢固而無法被短時(shí)間胰酶消化分離。本實(shí)驗(yàn)多次驗(yàn)證獲取的支持細(xì)胞純度可達(dá)到90%左右。相比于其他方法，此方法操作過程較為簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)成本較低，較易學(xué)習(xí)，獲取的支持細(xì)胞純度較高，可滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，可為初學(xué)者首選方案。

目前支持細(xì)胞的鑒定方法主要是形態(tài)學(xué)鑒定，采用倒置顯微鏡觀察及電鏡觀察；另一種鑒定方法是DNA免疫標(biāo)記：觀察到特征性雙核仁結(jié)構(gòu)[11-13]；還有免疫組化法鑒定。本實(shí)驗(yàn)選取形態(tài)學(xué)鑒定聯(lián)合PI染色及免疫組化鑒定的方法，先從大體形態(tài)學(xué)層面進(jìn)行初步鑒定，再選用特異性免疫標(biāo)記物波形蛋白進(jìn)行免疫鑒定[14]。結(jié)果充分證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)方法可得到純度較高、存活率較高的小鼠睪丸支持細(xì)胞，為今后進(jìn)一步研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，值得推廣。

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