龍眼提取物對(duì)H₂O₂致PC1₂細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

李紅艷 倪雪嬌 陳曉霞 賈思禹 宋婷

【摘 要】 目的：通過(guò)比較龍眼不同提取物的神經(jīng)保護(hù)作用，探討龍眼各部位的藥效價(jià)值。方法：以H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，以龍眼不同部位（肉、殼、核）提取物和龍眼肉不同極性（水、正丁醇、乙酸乙酯）提取物進(jìn)行干預(yù)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果：正常組細(xì)胞貼壁良好，軸突明顯，易成簇生長(zhǎng)；模型組細(xì)胞形態(tài)不規(guī)整，突起腫脹破裂，有脫壁漂浮現(xiàn)象；給藥組細(xì)胞形態(tài)趨于正常，結(jié)構(gòu)較完整。龍眼不同部位中以龍眼肉提取物促進(jìn)增殖最明顯；龍眼肉不同極性提取物中，以乙酸乙酯提取物促進(jìn)增殖最顯著，其對(duì)細(xì)胞中晚期凋亡及壞死有明顯抑制作用。結(jié)論：龍眼提取物具有神經(jīng)保護(hù)作用，抑制細(xì)胞中晚期凋亡與壞死是其可能的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。

【關(guān)鍵詞】 龍眼；不同部位；不同極性；增殖；凋亡

【中圖分類號(hào)】R-33 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2018）02-0048-04

Abstract：Objective The neuroprotective effects of different extracts from longan were studied to explore the pharmacodynamics of various parts of longan. Methods PC12 cells were induced by H2O2， the different parts of longan （longan meat， shell， nuclear） and longan meat with different polar solvents （water， n-butanol， ethyl acetate） extract were acting on the injured PC12 cells， the morphology of the cells was observed by inverted microscope， MTT assay was used to detect cell proliferation， flow cytometry was used to detect apoptosis. Results Normal cells adhere to a good， axillary obvious， easy clusters of growth； The cell morphology of H2O2 injury is irregular， the proliferation is slow， the swelling and rupture of the protrusion， The morphology of each group was normal， with protrusions and more complete structure. Longan different parts of the longan meat to promote the most obvious proliferation； Longan meat in different polar extracts， with ethyl acetate extract to promote the most significant proliferationm and it on cells in the late apoptosis and necrosis were significantly inhibited. Conclusion Longan extract has neuroprotective effect， inhibit the cell apoptosis and necrosis is the possible neuroprotective mechanism.

Keywords：Longan； Different parts； Different polarity； Proliferation； Apoptosis

龍眼俗名桂圓，其假種皮龍眼肉具有補(bǔ)益心脾、養(yǎng)血安神[1]等功效，并有改善記憶[2]、抗氧化[3]等作用。目前龍眼中僅龍眼肉作為藥用部位，對(duì)龍眼殼、核等并無(wú)有效的開(kāi)發(fā)利用。據(jù)報(bào)道，龍眼殼、核具有抗氧化、抗腫瘤[4-7]等作用，實(shí)驗(yàn)者認(rèn)為其大量廢棄不僅給炮制加工帶來(lái)不便，同時(shí)造成了資源的浪費(fèi)與環(huán)境的污染。本研究擬通過(guò)探討龍眼不同提取物的神經(jīng)保護(hù)作用，為龍眼的炮制加工及擴(kuò)大應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 龍眼購(gòu)自大連金鴻潤(rùn)食品發(fā)展有限公司，經(jīng)王添敏副教授鑒定為無(wú)患子科植物龍眼（Dimocarpus longan Lour.）的干燥成熟果實(shí)；PC12細(xì)胞（高分化），遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室提供；DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco）；胰蛋白酶、雙抗、Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒均購(gòu)自Genview；NU-4750型二氧化碳培養(yǎng)箱（Nuaire）。

1.2 方法

1.2.1 龍眼不同部位的制備 干燥龍眼，分離肉、殼、核，分別稱重、粉碎，各取100.00 g，按1∶12（m[KG*9]∶v）加入去離子水微沸提取1 h，提取3次，合并濾液，60℃減壓濃縮成浸膏，即得龍眼肉、龍眼殼、龍眼核提取物，以下簡(jiǎn)稱龍眼肉、殼、核。

1.2.2 龍眼肉不同極性提取物的制備 精密稱取龍眼肉100.00 g，同上煎煮，向?yàn)V液中加入乙酸乙酯反復(fù)萃取至上層液體無(wú)色，收集合并上層溶液，得乙酸乙酯提取物；下層加入正丁醇反復(fù)萃取至上層無(wú)色，收集上、下層溶液，分別得正丁醇提取物和水提取物。60 ℃減壓濃縮成浸膏。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞，以105/mL接種于96孔板， 待細(xì)胞貼壁后，隨機(jī)分為正常組、模型組和給藥組，每組3個(gè)復(fù)孔。除正常組外，各組細(xì)胞用200 μM H2O2處理12 h，給藥組于造模12 h后加入不同濃度的受試藥物（最小濃度分別是各提取物的最低有效濃度）。繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，采用MTT法于酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定各孔吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞存活率，實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PC12細(xì)胞，鋪于6 cm培養(yǎng)皿中，隨機(jī)分為正常組、模型組和龍眼肉組（乙酸乙酯提取物1.6 mg/mL）。除正常組外，其余各組加入200 μM H2O2孵育12h，龍眼肉組于造模前加藥預(yù)處理2 h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，每組3個(gè)復(fù)孔。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。組間比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 龍眼不同部位對(duì)細(xì)胞增殖的影響 顯微鏡觀察可見(jiàn)，正常組細(xì)胞貼壁良好，軸突明顯；模型組細(xì)胞形態(tài)不規(guī)整，突起腫脹破裂，有脫壁漂浮現(xiàn)象；給藥組細(xì)胞形態(tài)趨于正常，突起損傷減輕，結(jié)構(gòu)較完整。各組代表性圖片如圖1A所示。MTT檢測(cè)結(jié)果表明，細(xì)胞存活率模型組較正常組下降；龍眼肉、殼、核組較模型組升高（P<0.05，P<0.01，圖2B-D），三者平均細(xì)胞存活率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），但濃度相差懸殊（圖2E）。綜合評(píng)價(jià)，筆者認(rèn)為龍眼肉提取物的神經(jīng)保護(hù)作用最強(qiáng)。

2.2 龍眼肉不同極性提取物對(duì)細(xì)胞增殖的影響 不同極性提取物均有神經(jīng)保護(hù)作用（圖2A-C）；相同濃度下，乙酸乙酯提取物促進(jìn)增殖最明顯（圖2D）。如圖2所示。

2.3 龍眼肉乙酸乙酯提取物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 模型組較正常組活細(xì)胞數(shù)減少，凋亡及壞死細(xì)胞數(shù)增加（P<0.05，P<0.01，圖3D-G）；龍眼肉組即龍眼肉乙酸乙酯提取物較模型組活細(xì)胞數(shù)增加，中晚期凋亡及壞死細(xì)胞減少（P<0.05，圖3D、F、G），早期凋亡細(xì)胞無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），但有降低趨勢(shì)（圖3E）。如圖3所示，

3 討論

本論研究用H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，并采用龍眼提取物進(jìn)行預(yù)處理或治療，結(jié)果表明，龍眼肉、殼、核提取物，均能提高受損細(xì)胞存活率，且以龍眼肉用量最小，龍眼殼促進(jìn)增殖作用最顯著。綜合考慮三者的量效差異，認(rèn)為龍眼肉作用效果最好；同時(shí)，龍眼中殼、核所占比重不小，二者有很強(qiáng)的作用，如果一并入藥，可減少炮制加工，并擴(kuò)大了龍眼的藥用來(lái)源。另外，根據(jù)細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果推測(cè)，抑制中晚期細(xì)胞凋亡與壞死是龍眼神經(jīng)保護(hù)作用的可能機(jī)制，值得進(jìn)一步深入研究。

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