植物miRNA在中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用

楊康 藺曼 刑韶芳 樸香蘭

【摘 要】 中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究是中藥現(xiàn)代化的重要組成部分，也是制約中藥質(zhì)量控制、制劑開發(fā)及臨床應(yīng)用的瓶頸。中藥中有效成分分為蛋白質(zhì)、核酸等初級(jí)代謝產(chǎn)物以及黃酮、皂苷等次級(jí)代謝產(chǎn)物兩大類。目前對(duì)于中藥物質(zhì)基礎(chǔ)的研究主要集中在次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究上，而忽視了對(duì)核酸、蛋白質(zhì)等初級(jí)代謝產(chǎn)物的活性研究。近期研究表明，中藥的植物miRNA可以被穩(wěn)定吸收進(jìn)入體內(nèi)而發(fā)揮其特異性的藥理作用。外源性植物miRNA為中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供一種新的研究思路和方法。

【關(guān)鍵詞】 miRNA；中藥物質(zhì)基礎(chǔ)；初級(jí)代謝產(chǎn)物

【中圖分類號(hào)】R284.2 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2018）03-0004-03

Abstract：The studies of the constituents of traditional Chinese medicine are important part of the modernization of traditional Chinese medicine. They are also the problem restricting the quality control， development of agents and clinical application of traditional Chinese medicine. The effective constituents of traditional Chinese medicine are composed by the primary metabolites including protein， nucleic acid and the secondary metabolites including flavonoid， saponin. Many research of the constituents oftraditional Chinese medicine is focus on the second metabolites. However， the studies of effect of the primary metabolite， such as nucleic acid and protein， are ignore. Recent studies have shown that the plant miRNA in traditional Chinese medicine can be absorbed into the body and play its specific pharmacological role. Exogenous plant miRNA will provide a new research idea and method for the study on the constituents of traditional Chinese medicine.

Keywords：microRNA； Constituent of Traditional Chinese Medicine； Primary Metabolite

中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究是闡明中藥的藥效物質(zhì)、藥理活性、作用機(jī)制和臨床療效的先決條件，也是直接影響中藥單味藥物和復(fù)方制劑開發(fā)、藥物炮制工藝、劑型改進(jìn)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定的重要基礎(chǔ)，也是中藥現(xiàn)代化的重要研究內(nèi)容和組成部分。中藥物質(zhì)基礎(chǔ)和藥效的研究已經(jīng)有近80年的歷史，目前，中藥單味藥和復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)，并且取得了很大的成就，如我國著名中藥研究者屠呦呦從中藥青蒿中提取到抗瘧疾作用成分青蒿素，并獲得了2015年的諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，研究者在青蒿素的基礎(chǔ)之上合成雙氫青蒿素等近百種青蒿素衍生物，治療和挽救了無數(shù)瘧疾患者的生命[1]。

中藥中含有的有效成分具有種類多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，同時(shí)相互之間又有協(xié)同或拮抗作用，構(gòu)成中藥的多成分、多途徑、多靶點(diǎn)的復(fù)雜體系，給中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究帶來了巨大的困難和挑戰(zhàn)。再加上中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究濃厚的化學(xué)背景，從而促使大部分研究者把目光集中在對(duì)黃酮、皂苷等次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究上，而忽略了對(duì)核酸、蛋白質(zhì)等初級(jí)代謝產(chǎn)物作用的研究。雖然初級(jí)代謝產(chǎn)物大多為大分子物質(zhì)，在消化道中被分解成為最小的基本單位被集體吸收利用，但部分小分子初級(jí)代謝產(chǎn)物可以以整體性形式被穩(wěn)定地吸收進(jìn)入體內(nèi)并發(fā)揮其藥理作用，這給中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了新的研究思路和方法。

1 中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究存在的問題

中藥物質(zhì)基礎(chǔ)的研究思路與方法源于西方重視因果關(guān)系的哲學(xué)思想體系和對(duì)于植物化學(xué)研究，即對(duì)中藥中有效成分進(jìn)行提取、分離、結(jié)構(gòu)鑒定、活性篩選等步驟進(jìn)行物質(zhì)基礎(chǔ)研究以闡明其作用。中藥研究采取此類研究方法對(duì)中藥的化學(xué)成分和生物活性進(jìn)行研究，揭示了一大批中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)，取得了重要的研究成果，如中國中醫(yī)科學(xué)院的屠呦呦教授等發(fā)現(xiàn)青蒿素是青蒿中抗瘧的主要有效成分、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院陳克恢教授發(fā)現(xiàn)麻黃堿是麻黃利尿調(diào)節(jié)血壓的主要有效成分[1-2]。目前對(duì)于中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究主要集中于中藥的次級(jí)代謝產(chǎn)物，雖然能夠在很大程度上說明大部分中藥的藥物作用基礎(chǔ)，但是僅從次級(jí)代謝產(chǎn)物藥理作用分析的角度仍然難以對(duì)部分中藥的藥物作用物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行合理解釋。

目前大部分的研究集中于在次級(jí)代謝產(chǎn)物，對(duì)于初級(jí)代謝產(chǎn)物是否為中藥作用物質(zhì)基礎(chǔ)的問題成為了研究的新方向。從生物化學(xué)的角度來看，外源性的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等初級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)入消化道后均被降解成為最基本的氨基酸、甘油、核苷酸等最小單位被吸入體內(nèi)，如核酸的分解過程：外源性的核酸物質(zhì)在生物體內(nèi)在多種酶的催化下，水解生成核苷等小分子物質(zhì)被吸收[3]，導(dǎo)致普遍認(rèn)為蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸經(jīng)消化吸收后就失去其生物活性。現(xiàn)有研究已發(fā)現(xiàn)外源性的植物miRNA可在人體內(nèi)穩(wěn)定存在，部分研究還發(fā)現(xiàn)一些中藥的miRNA存在一定的藥理活性。中藥所含的植物miRNA是否是中藥藥物作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，成為新的中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究關(guān)注點(diǎn)[4-6]。

2 miRNA在人體內(nèi)的存在

微小RNA（microRNA，miRNA）是由真核生物內(nèi)源性發(fā)夾結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物衍生而來的一種長19～25nt的單鏈RNA。miRNA可作為一種引導(dǎo)性分子通過堿基配對(duì)與靶mRNA結(jié)合從而在轉(zhuǎn)錄后引起靶mRNA的剪切或翻譯的抑制，從而影響蛋白質(zhì)的表達(dá)。研究表明，miRNA在不同調(diào)節(jié)途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括造血細(xì)胞的分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖以及腫瘤的形成等方面[7]，并發(fā)現(xiàn)miRNA與RNA病毒和DNA病毒在致病性及病毒與宿主的相互作用方面具有一定的作用[8-9]。目前對(duì)于miRNA的具體作用機(jī)制尚不清楚，主要由于miRNA與其靶mRNA形成一種復(fù)雜的作用網(wǎng)絡(luò)。例如，一種miRNA可以結(jié)合并調(diào)節(jié)多種mRNA，與此同時(shí)，一個(gè)mRNA可與多個(gè)miRNA結(jié)合，故其作用機(jī)制復(fù)雜多樣。miRNA的具體作用機(jī)制仍然是一個(gè)待解決的科學(xué)難題，對(duì)于miRNA的調(diào)節(jié)作用網(wǎng)絡(luò)的研究尚處于起步狀態(tài)。

外源性植物miRNA可以直接被哺乳動(dòng)物從食物中吸收，并且在血漿和組織之中。Lin Zhang等在利用Solexesa測(cè)序法發(fā)現(xiàn)中國人的血漿中發(fā)現(xiàn)了十字花科植物的miRNA---MIR156a和MIR168a的存在，推測(cè)與中國人以水稻為主食的飲食習(xí)慣有關(guān)。實(shí)驗(yàn)利用RT-PCR和Northern Blotting技術(shù)對(duì)于這兩種外源性植物miRNA的含量進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)這兩種外源性植物miRNA在人體血液中濃度很高，利用高碘酸對(duì)于血液中的外源性植物miRNA進(jìn)行了進(jìn)一步的處理測(cè)定，進(jìn)一步驗(yàn)證了這兩種miRNA在人體體內(nèi)的存在。進(jìn)一步研究miRNA的吸收過程，發(fā)現(xiàn)了miRNA是以整體形式通過被囊泡包裹吸收的形式經(jīng)小腸吸收如體內(nèi)[6]。Jonathan W. Snow等[10]進(jìn)一步驗(yàn)證了外源性植物miRNA通過腸胃吸收進(jìn)入人體，并以不同濃度存在于各個(gè)器官之中。Anna Lukasik等[11]發(fā)現(xiàn)在人類樣本中的高豐度水平的MIR168a等基因，可以通過血乳屏障在豬的母乳中檢測(cè)，并確定了其通過量的最大值。這些人體對(duì)于外源性植物miRNA吸收分布的研究為中藥miRNA作為中藥作用有效物質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮藥物作用的研究奠定了基礎(chǔ)。

3 外源性中藥miRNA的藥理作用

甘草具有調(diào)節(jié)免疫等作用，能調(diào)和百藥解百毒，更有“國老”之稱、“十方九草”之說。目前對(duì)于甘草的增強(qiáng)免疫力作用效果的物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制尚不清楚。邵紅偉等[5]利用植物miRNA提取試劑盒從甘草水提物凍干粉中提取并純化獲得甘草miRNA，利用所提取的甘草miRNA作用于健康人血中分離的外周血單核細(xì)胞（PBMC），從細(xì)胞形態(tài)變化、細(xì)胞數(shù)量鑒定細(xì)胞的增值情況以反應(yīng)甘草miRNA對(duì)免疫細(xì)胞的影響。對(duì)比了甘草miRNA與甘草水提物、甘草酸、甘草次酸的對(duì)PBMC的影響結(jié)果表明，甘草miRNA組PMBC細(xì)胞出現(xiàn)明顯的抱團(tuán)現(xiàn)象，且抱團(tuán)數(shù)量明顯增多，證明了甘草miRNA對(duì)于PBMC的促進(jìn)作用，為解釋甘草的調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了新的證據(jù)。

向靜等[12]利用從甘草水煎劑中提取的miRNA以及合成的甘草miRNA模擬物作用于PBMC，再一次證實(shí)甘草miRNA具有明顯的免疫調(diào)節(jié)功能，并利用RT-PCR對(duì)其模式識(shí)別受體（PRR） 基因以及部分轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)分子和細(xì)胞因子的基因表達(dá)變化進(jìn)行分析。結(jié)果表明，甘草miRNA對(duì)免疫細(xì)胞表面的一類模式識(shí)別受體TLR家族中的TLR1、TLR9表達(dá)上調(diào)作用，對(duì)TLR4和TLR8的表達(dá)則有下調(diào)的作用。甘草miRNA能夠使得AP-1的重要組分c-JUN和c-FOS表達(dá)下降，說明其通過抑制AP-1通路來抑制Th2細(xì)胞分化。甘草miRNA還降低了NF-kB，p53和STAT1的表達(dá)，說明其可能抑制了炎癥通路、凋亡以及Th1細(xì)胞的分化。值得關(guān)注的是，促炎因子IL-6的表達(dá)在miRNA組和總提物組相反，說明甘草水煎劑中成分和作用的復(fù)雜性，其整體作用效果可能是是由甘草miRNA與甘草所含次級(jí)代謝產(chǎn)物共同作用產(chǎn)生的。

金銀花具有良好的清熱解毒作用，廣泛應(yīng)用于各種病毒性感冒，但目前基于金銀花抗病毒作用的次級(jí)代謝產(chǎn)物成分藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究難以說明金銀花的抗病毒作用。Zhen Zhou等[6]利用金銀花水煎液中提取的miRNA2911分別進(jìn)行體內(nèi)和體外的抗病毒實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)于流感A類病毒具有廣譜抗流感病毒作用，特別是H1N1、H5N1和H7N9病毒。該研究首先證明了miRNA2911能在金銀花水煎液中穩(wěn)定存在，并能夠被人體吸收。根據(jù)金銀花中miRNA2911的序列進(jìn)行人工合成，利用合成的miRNA2911提取物對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃實(shí)驗(yàn)，在外周血及肺部中都能顯著發(fā)現(xiàn)miRNA2911的存在，并利用無效的miRNA2911類似序列核苷酸進(jìn)行抗病毒實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其可以在體內(nèi)檢測(cè)到，但是無抗病毒效果。隨后利用抗miRNA2911的核苷酸序列與miRNA2911同時(shí)灌胃，也無抗病毒效果。該研究直接證明了金銀花的抗病毒作用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一是其含有的miRNA2911。

4 討論

中藥miRNA的相關(guān)研究給中藥作用物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了一個(gè)新的研究思路，藥物的作用物質(zhì)基礎(chǔ)不僅僅局限于次級(jí)代謝產(chǎn)物也可能是核酸等初級(jí)代謝產(chǎn)物，這為中藥的質(zhì)量控制、新藥開發(fā)等提供了一個(gè)新的研究方向。在中藥作用物質(zhì)基礎(chǔ)研究方面，很多中藥的次級(jí)代謝產(chǎn)物的體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)都難以說明某些藥物作用，如金銀花的抗病毒作用等。這類問題可以嘗試從miRNA的角度去建立研究方法。在藥物開發(fā)上，如果發(fā)現(xiàn)某個(gè)中藥的藥效作用的有效成分是miRNA，則可以嘗試使用PCR技術(shù)對(duì)于相應(yīng)的miRNA片段進(jìn)行擴(kuò)增或者人工合成，制成注射劑、片劑等生物制劑，使得中藥的衍生產(chǎn)品更加豐富，患者用藥更加方便，藥物生產(chǎn)效率，降低成本。在某些中藥質(zhì)量控制和藥物炮制過程中，miRNA的種類和含量的改變同樣值得關(guān)注。

雖然miRNA作為中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究的前景十分可觀，但是對(duì)于其后續(xù)的開發(fā)應(yīng)用方面所涉及的問題仍然值得思考。miRNA的具體作用機(jī)制尚不完全清楚，其開發(fā)應(yīng)用方面也必然會(huì)受到一定的限制。首先，中藥所含的miRNA雖然被證明是中藥藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，但是miRNA本身是一種核酸，其制劑開發(fā)應(yīng)用就會(huì)從中藥資源開發(fā)轉(zhuǎn)變成為基因治療藥物開發(fā)，不可避免會(huì)涉及基因治療的倫理問題，必須衡量其實(shí)用性和風(fēng)險(xiǎn)性。其次，在應(yīng)用的技術(shù)問題上，也存在許多問題，如目的基因表達(dá)可控性差、miRNA多靶點(diǎn)引起的副作用、使用劑量的考核、人體排出體外和體內(nèi)積累等問題，其中最令人擔(dān)憂的是長期安全性和耐藥性的產(chǎn)生。

隨著技術(shù)水平的不斷提高，新發(fā)現(xiàn)和新理論的提出，都進(jìn)一步深化了中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究，但是目前面臨的待解決的問題仍然很多。例如文章提出的“miRNA可能是中藥藥物作用新機(jī)制”的觀點(diǎn)仍需要更多的實(shí)驗(yàn)研究證明，其后續(xù)相關(guān)研究仍有很多問題亟待解決，中藥作用的物質(zhì)基礎(chǔ)仍需最大限度地運(yùn)用現(xiàn)代相關(guān)技術(shù)進(jìn)一步分析。

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（收稿日期：2017-12-21 編輯：程鵬飛）