乙烯對(duì)匍匐翦股穎ISR抗病反應(yīng)中AsA-GSH 循環(huán)及胼胝質(zhì)沉積的影響

姜寒玉,王亞峰,徐明,甘培文，張金林，馬暉玲

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中—美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心， 甘肅 蘭州 730070; 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

匍匐翦股穎(Agrostisstolonifera)為禾本科翦股穎屬(Agrostis)多年生草本植物，屬冷季型草坪草，因其具有適應(yīng)性強(qiáng)，抗寒耐旱，草質(zhì)柔軟細(xì)嫩，生長迅速，觀賞性強(qiáng)等優(yōu)良特性，是高爾夫球場(chǎng)球道，草地網(wǎng)球場(chǎng)等理想的高品質(zhì)草坪草，也是庭院、公園等養(yǎng)護(hù)水平較高的綠地首選草種。匍匐翦股穎不定根入土淺，喜水，抗病害能力差，易感染幣斑病、褐斑病、霜霉病和黑粉病等，從而引起草坪品質(zhì)、功能等方面的嚴(yán)重退化，給草坪生產(chǎn)管理和經(jīng)營帶來巨大損失[1]。

在病原物的作用下，植物產(chǎn)生的自我免疫基于一套高度靈活且復(fù)雜的響應(yīng)機(jī)制，植物首先利用最初產(chǎn)生的生理生化屏障，其次激活某些可誘導(dǎo)的防御機(jī)制，最終提高系統(tǒng)性響應(yīng)免于病原物的進(jìn)一步侵染。目前,人們已了解幾種生物誘導(dǎo)的系統(tǒng)性防御響應(yīng)機(jī)制，其一為系統(tǒng)獲得性抗性(systemic acquired resistance，SAR)，它通常由病原物侵染誘導(dǎo)產(chǎn)生，防止進(jìn)一步感染[2]，另一種為誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性(induced systemic resistance，ISR)，它往往由土壤根際的植物促生菌(PGPR)激活[3-4]?，F(xiàn)已在豆類、馬鈴薯(Solanumtuberosum)和擬南芥(Arabidopsisthaliana)等植物中都發(fā)現(xiàn)ISR反應(yīng)，其對(duì)細(xì)菌、真菌和病毒具有廣譜抗性[5]。丁二醇(butanediol, BDO)是一種新型的抗病性誘導(dǎo)因子，具有無毒、無污染和抗病性持久的優(yōu)點(diǎn)。2010年加拿大學(xué)者Cortes-Barco等[6]對(duì)匍匐翦股穎的抗病性誘導(dǎo)作用進(jìn)行了首次報(bào)道，其能夠誘導(dǎo)ISR抗病方式并有效抑制草坪葉病。隨后，研究發(fā)現(xiàn)BDO可誘導(dǎo)匍匐翦股穎產(chǎn)生抗病性，其抗病效果優(yōu)于通過SAR途徑由苯并噻二唑(BTH)引致的抗病性[7]。

乙烯是ISR誘導(dǎo)系統(tǒng)中重要的信號(hào)分子，為了進(jìn)一步探清其在ISR信號(hào)途徑中的作用，有研究以乙烯信號(hào)突變型植株為試驗(yàn)對(duì)象，發(fā)現(xiàn)通過根部施入熒光假單胞桿菌(Pseudcmonasfluoroscercs)WCS417r不能誘導(dǎo)植株對(duì)丁香假單胞菌番茄(Solanumlycopersicum)致病變種(Pst DC3000)的抗病性，無ISR系統(tǒng)響應(yīng)機(jī)制[8]，從而證實(shí)了乙烯信號(hào)通路與ISR機(jī)制的建立密切關(guān)聯(lián)。在對(duì)擬南芥植株ISR系統(tǒng)的研究中發(fā)現(xiàn)，茉莉酸-乙烯(JA/ET)響應(yīng)型基因包括Lox1、Lox2、VSP2、PDF1.2、HEL、CHI-B和PAL1等，這些基因均可被JA/ET信號(hào)激活得以表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物能夠?qū)Χ喾N病原物產(chǎn)生抗性[9]。通過研究與乙烯抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)的ETR1、EIN2基因?qū)χ参锓烙豍DF1.2基因表達(dá)的影響發(fā)現(xiàn)，乙烯與PDF1.2的合成有關(guān)，外施乙烯能夠提高PDF1.2基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，而SA不能誘導(dǎo)PDF1.2基因的表達(dá)[10-11]。

當(dāng)病原物侵染植物時(shí)，細(xì)胞內(nèi)開始積累大量的活性氧(reactive oxy gen species, ROS)，而ROS清除系統(tǒng)通過具有氧化還原性的酶和抗氧化物質(zhì)協(xié)同作用?？箟难?谷胱甘肽(ascorbate-glutathione，AsA-GSH)循環(huán)在該系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，清除過程中引起了AsA、GSH及相關(guān)酶活性的變化，誘導(dǎo)了植物的抗病性防御反應(yīng)[12]。因此抗壞血酸過氧化物酶(peroxidase, APX)、AsA和GSH是AsA-GSH循環(huán)的重要組分。如真菌灰葡萄菌侵染番茄葉片后，改變了植株AsA-GSH循環(huán)，APX、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)和谷胱甘肽還原酶(GR)等酶活性降低，GSH和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)活性增強(qiáng)，導(dǎo)致脫氫抗壞血酸(DHA)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量積累，AsA/GSH降低，抗壞血酸和谷胱甘肽含量減少[13]。同時(shí)AsA和GSH可作為信號(hào)分子直接調(diào)控MAP激酶，從而調(diào)節(jié)水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)的合成，最終介導(dǎo)植株對(duì)病原物的防御反應(yīng)[14-15]。

胼胝質(zhì)，即β-1,3葡聚糖，當(dāng)植物受到病原物侵害后能夠迅速在質(zhì)膜和細(xì)胞壁之間沉積，并誘導(dǎo)產(chǎn)生特定的防御機(jī)制[16]。研究發(fā)現(xiàn)，大豆(Glycinemax)在抵御花葉病毒侵染過程中，產(chǎn)生了大量的胼胝質(zhì)從而限制了病毒的胞間運(yùn)輸[17]?？共⌒栽綇?qiáng)的品種在侵染點(diǎn)越早地積累了胼胝質(zhì)，其沉積特點(diǎn)與大豆抗病毒侵染密切相關(guān)[18]。在mapk4突變型擬南芥植株中，AtGsl5基因與擬南芥抗病性密切相關(guān)，該基因在mapk4中高效表達(dá)，胼胝質(zhì)合成酶活性升高，同時(shí)胼胝質(zhì)大量累積，進(jìn)一步證實(shí)了胼胝質(zhì)在植物抗病性中的重要作用[19-20]。

為了探討乙烯對(duì)匍匐翦股穎ISR抗病反應(yīng)中AsA-GSH循環(huán)以及胼胝質(zhì)沉積的影響，本研究以立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)侵染匍匐翦股穎，通過BDO誘導(dǎo)產(chǎn)生ISR抗病反應(yīng)后，采用不同濃度的乙烯誘導(dǎo)劑和抑制劑噴施葉片，探討在ISR抗病反應(yīng)中AsA、GSH含量及相關(guān)酶活性以及胼胝質(zhì)的沉積部位、大小和數(shù)量等變化，從而揭示乙烯信號(hào)分子在匍匐翦股穎ISR抗病生理響應(yīng)中的作用特點(diǎn)，以期為匍匐翦股穎抗病性研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試品種及病原菌

供試匍匐翦股穎選取北方常見品種Penn-A4，由北京克勞沃公司提供。立枯絲核菌菌種(#3.2888) 購自中國普通微生物菌種保藏中心。

1.2 材料種植及處理

試驗(yàn)于2016年7月進(jìn)行，在規(guī)格為10 cm×10 cm×8 cm的方形花盆中裝入滅菌的沙土混合物(土∶沙=2∶1)。種子用無菌水浸泡6 h，70%乙醇沖洗1 min，次氯酸鈉浸泡15 min，后用無菌水沖洗6次。每盆均勻撒播處理后的匍匐翦股穎種子0.3 g，覆蓋一薄層沙土，每日定量澆水15 mL。置于(25±2) ℃恒溫條件下生長，光周期為16 h·d-1。

立枯絲核菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)中，25 ℃培養(yǎng)4 d后用打孔器取6 mm直徑菌絲塊，加入到PDA培養(yǎng)基中，在25 ℃ 100 r·min-1的條件下培養(yǎng)4 d，取出菌團(tuán)，去掉中心的培養(yǎng)基顆粒，然后將菌絲放入無菌水中清洗，清洗完成后，擰干菌絲放入研缽進(jìn)行研磨，研磨成勻漿后加入無菌水，濃度為OD340 nm=0.8。

待匍匐翦股穎長至10 cm左右時(shí)，將15 mL 100 μmol·L-1BDO直接澆灌到幼苗根部土壤中，連續(xù)澆灌5 d。配制含0.01%吐溫的菌液，采用菌絲懸浮液噴霧法接種匍匐翦股穎，每盆均勻噴灑15 mL的菌液，噴灑完成后等5 d，誘導(dǎo)ISR反應(yīng)。取生長情況相同的盆栽苗，采用乙烯抑制劑氯化鈷(CoCl2)和促進(jìn)劑1-氨基環(huán)丙烷羧酸(1-amino cyclopropane carboxylic acid, ACC)處理幼苗，處理濃度分別為A：1 mmol·L-1CoCl2；B：3 mmol·L-1CoCl2；C：5 mmol·L-1CoCl2；D：50 μmol·L-1ACC；E：75 μmol·L-1ACC；F：100 μmol·L-1ACC；CK為清水對(duì)照。每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。上述處理每次均噴施15 mL，噴施5、10、15 d后取材，參考文獻(xiàn)[21]的方法，進(jìn)行石蠟切片的制備，同時(shí)剪取噴施10 d的葉片進(jìn)行生理指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 抗病生理指標(biāo)的測(cè)定方法

匍匐翦股穎幼苗經(jīng)BDO誘導(dǎo)產(chǎn)生ISR抗病反應(yīng)，在ET促進(jìn)劑ACC或抑制劑CoCl2處理后，測(cè)定了AsA-GSH循環(huán)中各生理特性的變化。APX活性的測(cè)定參照Nakano等[22]的方法，GR活性的測(cè)定參照Foyer 等[23]的方法，AsA含量的測(cè)定參照Kampfenkel等[24]的方法，GSH和GSSG含量的測(cè)定參照Anderson等[25]的方法。

1.4 石蠟切片的制備方法

1.4.1取材 每個(gè)處理每盆隨機(jī)剪取1株匍匐翦股穎幼苗，然后去掉根部，葉尖，保留中部葉片，切成5 mm左右的小段，混勻保存于裝有福爾馬林-醋酸-酒精固定液(FAA)的青霉素小瓶，置于4 ℃冰箱中保存。

1.4.2脫水、透明 材料經(jīng)FAA固定12～16 h后，依次放入15%、30%、50%、70%、85%的乙醇中梯度脫水，各濃度脫水20 min，后于95%乙醇中脫水30 min，無水乙醇中脫水2次，各20 min。然后依次置換1/2二甲苯、二甲苯進(jìn)行透明，于1/2二甲苯中透明1 h，二甲苯中透明2次，每次30 min，直至材料完全透明為止。

1.4.3浸蠟、包埋 在裝有透明材料的青霉素小瓶中加碎蠟2次，第1次加入與瓶中二甲苯等量的碎蠟，放入電熱鼓風(fēng)干燥箱中，36 ℃保持1 h，待碎蠟完全融化后，加入瓶中液體50%的碎蠟， 36 ℃保存12 h，溫度調(diào)至42 ℃，置換50%石蠟保持1 h，溫度調(diào)至50 ℃，置換75%的石蠟保持30 min后，溫度調(diào)至60 ℃，依次置換純石蠟3次，各30 min，TKY-BMB型石蠟包埋機(jī)進(jìn)行包埋。1個(gè)蠟塊中1個(gè)材料，蠟塊的尺寸為：0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm(每個(gè)處理至少包埋蠟塊10個(gè))，將包埋好的蠟塊冷卻后直接修塊，進(jìn)行切片或保存到4 ℃冰箱備用。

1.4.4切片、展片、烤片 采用輪式手動(dòng)切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)切片，厚度10 μm，切片時(shí)每個(gè)蠟塊中材料的前面部分切除，每個(gè)蠟塊切片10張，每張蠟帶至少含有8個(gè)材料。將恒溫水浴鍋溫度調(diào)節(jié)至45 ℃，在500 mL大燒杯加入蒸餾水放入水浴鍋中，將切好的蠟帶光面朝下放入燒杯中，待蠟帶完全展開后，將涂抹好蛋清甘油的載玻片伸入燒杯中，使蠟帶粘到載玻片上，將粘有蠟帶的載玻片自然晾干后，在光學(xué)顯微鏡下觀察展片效果，取展片效果好的片子(每個(gè)處理鏡檢切片數(shù)約30張)置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中于38 ℃下烘烤，使之完全干燥。

1.4.5染色、封片 取干燥后的片子，依次放入加有二甲苯、1/2二甲苯、95%的乙醇、85%的乙醇、70%的乙醇、50%的乙醇、30%的乙醇、磷酸緩沖液、0.1%的苯胺藍(lán)染色劑的立式染缸中；在二甲苯、1/2二甲苯中各5 min，95%的乙醇、85%的乙醇、70%的乙醇、50%的乙醇、30%的乙醇中各5 s，磷酸緩沖液中10 min，0.1%的苯胺藍(lán)染色劑中30 min。最后將染色后的片子取出，置于蒸餾水中30 s，洗凈片子上的雜質(zhì)后，過1/2二甲苯、二甲苯各10 s，待片子干燥后采用中性樹膠封片。

1.4.6拍照觀察 將所得切片自然風(fēng)干后，置于LeiCa DM6000 B熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用IBM SPSS Statistics 22和Microsoft Office Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)，胼胝質(zhì)顆粒大小用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行分析計(jì)算，每個(gè)處理鏡檢片數(shù)30張，每張取5～10個(gè)視野。根據(jù)檢測(cè)的維管束數(shù)量及其上沉積的胼胝質(zhì)沉積部位、大小、數(shù)量，計(jì)算出平均每個(gè)維管束中胼胝質(zhì)的沉積數(shù)量和沉積面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度CoCl2及ACC處理對(duì)匍匐翦股穎ISR反應(yīng)中AsA-GSH循環(huán)的影響

2.1.1不同濃度CoCl2及ACC處理對(duì)匍匐翦股穎ISR反應(yīng)中APX活性的影響 如圖1A所示，經(jīng)不同濃度CoCl2和ACC處理后，匍匐翦股穎幼苗葉片的APX活性均顯著高于CK。隨著CoCl2處理濃度的增加，APX活性呈先降低后升高的趨勢(shì)，在處理濃度為5 mmol·L-1條件下升至最高，為595.56 U·g-1。隨著ACC處理濃度的增加，APX活性也呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，在100 μmol·L-1ACC處理下升至最高，達(dá)755.56 U·g-1。在乙烯促進(jìn)劑ACC處理下，APX活性顯著高于CoCl2的處理活性(P<0.05)。

2.1.2不同濃度CoCl2及ACC處理對(duì)匍匐翦股穎ISR反應(yīng)中AsA含量的影響 不同濃度ACC處理匍匐翦股穎幼苗后，各處理的AsA含量差異顯著(圖1B)。ACC處理下的AsA含量顯著高于對(duì)照及CoCl2處理，且隨著處理濃度的增加，AsA含量也顯著升高，并在100 μmol·L-1ACC處理下升至最高，達(dá)666.16 μmol·g-1。各濃度CoCl2處理下，AsA含量均低于對(duì)照，并維持較低水平，且各處理間差異不顯著(P>0.05)。

圖1 不同濃度CoCl2及ACC處理對(duì)匍匐翦股穎ISR反應(yīng)中AsA-GSH循環(huán)的影響Fig.1 Effects of the ascorbate-glutathione cycle in ISR reaction of creeping bentgrass with different concentration CoCl2 and ACC treatment 不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。The different letters mean significant difference at P<0.05. CK: Water control; A: 1 mmol·L-1 CoCl2; B: 3 mmol·L-1 CoCl2; C: 5 mmol·L-1 CoCl2; D: 50 μmol·L-1 ACC; E: 75 μmol·L-1 ACC; F: 100 μmol·L-1 ACC.

2.1.3不同濃度CoCl2及ACC處理對(duì)匍匐翦股穎ISR反應(yīng)中GR活性的影響 在匍匐翦股穎ISR抗病反應(yīng)中，不同濃度CoCl2及ACC處理下的GR活性均顯著高于對(duì)照(圖1C)。ACC處理下的GR活性顯著高于CoCl2處理?xiàng)l件。隨著CoCl2及ACC處理濃度的升高，GR活性均呈現(xiàn)顯著上升的趨勢(shì)，分別在5 mmol·L-1CoCl2和100 μmol·L-1ACC處理下升至11.66和18.13 U·g-1(P<0.05)。

2.1.4不同濃度CoCl2及ACC處理對(duì)匍匐翦股穎ISR反應(yīng)中GSH含量的影響 不同濃度ACC處理匍匐翦股穎幼苗后，各處理GSH含量差異顯著(圖1D)。隨著CoCl2處理濃度的升高，GSH含量逐漸降低，在5 mmol·L-1CoCl2處理下降至最低，為153.99 μmol·g-1。隨著ACC處理濃度的升高，GSH含量顯著增加，在100 μmol·L-1ACC處理下升至最高，達(dá)203.78 μmol·g-1(P<0.05)。

2.1.5不同濃度CoCl2及ACC處理對(duì)匍匐翦股穎ISR反應(yīng)中GSSG含量的影響 匍匐翦股穎ISR抗病反應(yīng)中，ACC處理下的GSSG含量顯著低于CoCl2及對(duì)照(圖1E)。經(jīng)3 mmol·L-1CoCl2處理后，GSSG含量升至最高，為118.47 μmol·g-1，而經(jīng)75 μmol·L-1ACC處理后，GSSG含量則降至最低，為54.14 μmol·g-1(P<0.05)。

2.1.6不同濃度CoCl2及ACC處理對(duì)匍匐翦股穎ISR反應(yīng)中GSH/GSSG的影響 如圖1F所示，各處理?xiàng)l件下GSH/GSSG差異顯著。經(jīng)ACC處理后的GSH/GSSG顯著高于CoCl2及對(duì)照。在75 μmol·L-1ACC處理下GSH/GSSG達(dá)到最高，為3.64，而在3 mmol·L-1CoCl2處理下GSH/GSSG降至最低，為1.36。此外，ACC處理下的GSH/GSSG顯著高于對(duì)照，而CoCl2處理下的GSH/GSSG則顯著低于對(duì)照(P<0.05)。

2.2 不同濃度CoCl2及ACC處理對(duì)匍匐翦股穎ISR反應(yīng)中胼胝質(zhì)沉積的影響

2.2.1不同濃度CoCl2及ACC處理對(duì)匍匐翦股穎ISR反應(yīng)中胼胝質(zhì)的主要沉積部位、大小和數(shù)量的影響 由圖2所示，匍匐翦股穎葉片中胼胝質(zhì)的主要沉積部位是厚壁細(xì)胞、韌皮部、木質(zhì)部及表皮組織(圖2D～F)，其中韌皮部中胼胝質(zhì)的沉積形態(tài)主要為絲狀、小顆粒狀、中顆粒狀和大顆粒狀四種形式(圖2A～C)。此外，在同一維管束中可觀察到不同的胼胝質(zhì)形態(tài)，圖2B顯示胼胝質(zhì)沉積主要為韌皮部絲狀、大顆粒狀及厚壁細(xì)胞絲狀胼胝質(zhì)，圖2C中沉積的主要為韌皮部絲狀及中小顆粒胼胝質(zhì)，圖2E中顯示沉積的主要為韌皮部、厚壁細(xì)胞絲狀胼胝質(zhì)，圖2F中沉積類型為木質(zhì)部、韌皮部和厚壁細(xì)胞絲狀胼胝質(zhì)。圖2G顯示了大量的胼胝質(zhì)沉積，主要以絲狀胼胝質(zhì)為主。

圖2 匍匐翦股穎葉片中胼胝質(zhì)的大小(圖A～C)、分布部位(圖D～F)以及葉片橫切面(圖G)Fig.2 Distribution of callose in creeping bentgrass leaves size (Figure A-C), parts (Figure D-F) and leaf cross section (Figure G) 圖中淡黃綠色亮斑為胼胝質(zhì)；A:韌皮部絲狀胼胝質(zhì)；B:韌皮部大顆粒胼胝質(zhì)；C:韌皮部中顆粒和小顆粒胼胝質(zhì)；D:表皮組織；E:木質(zhì)部；F:主維管束；G:葉橫切面。Callose： Yellowish green fluorescence light spot; A: Filamentous callose in parenchyma tissue; B: Great particle of callose in parenchyma tissue; C: Small and middle particle in parenchyma tissue; D: Epidermal tissue; E: Xylem tissue; F: Main vein; G: Leaf cross sections.

表1顯示了不同濃度乙烯抑制劑(CoCl2)及促進(jìn)劑(ACC)處理下匍匐翦股穎葉片中胼胝質(zhì)的主要沉積部位、大小和數(shù)量。在不同的處理?xiàng)l件和處理時(shí)間下，厚壁細(xì)胞的胼胝質(zhì)沉積均高于其他組織部位。在CoCl2和ACC處理5 d后，匍匐翦股穎幼苗葉片的胼胝質(zhì)沉積出現(xiàn)了不同的變化趨勢(shì)，CoCl2處理下表皮組織、厚壁細(xì)胞和木質(zhì)部的胼胝質(zhì)沉積總量高于韌皮部，而且隨著CoCl2處理濃度的升高，韌皮部中胼胝質(zhì)的總量呈下降趨勢(shì)，反之，隨著ACC處理濃度的升高，韌皮部中胼胝質(zhì)的數(shù)量則逐漸增加，同時(shí)CoCl2和ACC處理下的韌皮部胼胝質(zhì)總量均高于對(duì)照。在CoCl2和ACC處理10 d后，匍匐翦股穎幼苗葉片的胼胝質(zhì)沉積總量表現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)，二者處理下表皮組織、厚壁細(xì)胞和木質(zhì)部的胼胝質(zhì)沉積總量高于韌皮部，隨著CoCl2處理濃度的升高，韌皮部、木質(zhì)部及表皮組織中的胼胝質(zhì)沉積總量呈下降趨勢(shì)，反之，隨著ACC處理濃度的升高，所有組織部位中胼胝質(zhì)的數(shù)量均呈增加趨勢(shì)，同時(shí),CoCl2處理下的木質(zhì)部、厚壁細(xì)胞和表皮組織的胼胝質(zhì)總量高于對(duì)照。CoCl2和ACC處理15 d后的胼胝質(zhì)沉積與前期處理呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)， 兩種處理?xiàng)l件下表皮組織、厚壁細(xì)胞和木質(zhì)部的胼胝質(zhì)總量均高于韌皮部，隨著CoCl2處理濃度的升高，所有組織胼胝質(zhì)的沉積總量均逐漸降低，同時(shí)隨著ACC處理濃度的升高，胼胝質(zhì)的沉積總量也呈現(xiàn)出降低趨勢(shì)。由此可知，經(jīng)BDO誘導(dǎo)ISR反應(yīng)的匍匐翦股穎感染褐斑病后，乙烯對(duì)匍匐翦股穎葉片組織中胼胝質(zhì)的沉積具有一定程度的影響，主要沉積部位在厚壁細(xì)胞、韌皮部組織、木質(zhì)部組織和表皮組織，其中厚壁細(xì)胞和木質(zhì)部胼胝質(zhì)沉積較多，而表皮組織胼胝質(zhì)沉積較少。一定濃度的乙烯抑制劑能夠降低胼胝質(zhì)的沉積數(shù)量，乙烯促進(jìn)劑則增加了胼胝質(zhì)的沉積，提高了匍匐翦股穎幼苗的抗病性。同時(shí)厚壁細(xì)胞的胼胝質(zhì)沉積數(shù)量顯著高于其他部位，可見該位置是匍匐翦股穎抵御病害侵染的主要障礙，防止病害對(duì)植株的進(jìn)一步侵染。

表1 匍匐翦股穎葉片中胼胝質(zhì)的沉積主要部位以及各部位數(shù)量Table 1 The callose main deposition positions and number of different in leaves of creeping bentgrass

注：上表數(shù)據(jù)均為平均值，胼胝質(zhì)大顆粒的面積大于0.01 mm2；胼胝質(zhì)中顆粒的面積小于0.01 mm2大于0.005 mm2；胼胝質(zhì)小顆粒的面積小于0.005 mm2大于0.001 mm2；絲狀胼胝質(zhì)為面積小于0.001 mm2的顆粒。

Note: The data are mean value. Area of greater particle callose is more than 0.01 mm2; Area of middle particle callose is less than 0.01 mm2and more than 0.005 mm2; Area of small particle callose is less than 0.005 mm2and more than 0.001 mm2; Area of filamentary form callose is less than 0.001 mm2.

2.2.2不同濃度CoCl2及ACC處理對(duì)匍匐翦股穎ISR反應(yīng)中胼胝質(zhì)沉積面積的影響 由表2可得，在CoCl2和ACC噴施處理5 d時(shí)，匍匐翦股穎幼苗葉片中胼胝質(zhì)的沉積面積在乙烯合成抑制劑CoCl2各處理間無顯著性差異，在50 μmol·L-1ACC處理下則顯著低于其他處理濃度，胼胝質(zhì)沉積面積較對(duì)照少0.05 mm2，胼胝質(zhì)沉積個(gè)數(shù)較對(duì)照多30.45。在CoCl2和ACC噴施處理10 d時(shí)，匍匐翦股穎幼苗葉片中胼胝質(zhì)的沉積面積在CoCl2各處理間無顯著性差異，但50和75 μmol·L-1ACC處理下胼胝質(zhì)的沉積量顯著高于100 μmol·L-1ACC處理?xiàng)l件，亦顯著高于CK。在CoCl2和ACC噴施處理15 d時(shí)，匍匐翦股穎幼苗葉片中胼胝質(zhì)沉積面積在CoCl2和ACC各處理間無顯著差異。由此可見， 50 μmol·L-1ACC處理5 d時(shí)胼胝質(zhì)沉積最少，而50和75 μmol·L-1ACC處理10 d時(shí)胼胝質(zhì)沉積面積明顯高于CoCl2，處理15 d時(shí)各處理間無顯著差異。乙烯分子對(duì)由BDO誘導(dǎo)的ISR反應(yīng)中胼胝質(zhì)的沉積具有一定影響， 但隨著病害脅迫時(shí)間的延長，胼胝質(zhì)沉積面積逐漸減少，且在病菌侵染初期，低濃度乙烯條件(50 和75 μmol·L-1ACC)使得匍匐翦股穎ISR反應(yīng)中胼胝質(zhì)的沉積顯著增加，增強(qiáng)了匍匐翦股穎幼苗的抗病性，但至侵染后期，胼胝質(zhì)逐漸降解，沉積面積減少，各處理間無顯著差異。

表2 匍匐翦股穎葉片中胼胝質(zhì)的沉積面積Table 2 The callose deposition area in the creeping bentgrass leaves

注：表中數(shù)據(jù)用新復(fù)極差法進(jìn)行檢驗(yàn)，同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異達(dá)到0.05顯著水平。

Note：Data in the Table with the new multiple range method tests. Different lowercase letters in the same column were significantly different at 0.05 levels.

3 討論

3.1 不同濃度CoCl2及ACC處理對(duì)匍匐翦股穎ISR反應(yīng)中AsA-GSH循環(huán)的影響

AsA-GSH循環(huán)在ROS清除反應(yīng)中具有重要作用。在該循環(huán)中，AsA作為特定的電子供體通過APX減少了H2O2，即在APX的催化下將H2O2還原成H2O，同時(shí)AsA被氧化成脫氫抗壞血酸，氧化的脫氫抗壞血酸則由GSH通過非酶促方式還原，從而構(gòu)成AsA-GSH循環(huán)[26]。APX主要存在于細(xì)胞質(zhì)、葉綠體和線粒體等部位，能夠清除植物體內(nèi)大量累積的H2O2，該酶過量表達(dá)能夠減少H2O2對(duì)植物的毒害作用。同時(shí)抗壞血酸是植物體內(nèi)非酶活性氧清除系統(tǒng)的重要組成部分[27]。對(duì)煙草(Nicotianatabacum)與TMV(煙草花葉病毒)互作體系的深入研究發(fā)現(xiàn)，煙草遭受病毒侵染后，其體內(nèi)活性氧大量產(chǎn)生，APX活性下降，防止了H2O2的有效降解，而H2O2能夠誘導(dǎo)程序性細(xì)胞壞死，并激活病程相關(guān)蛋白基因的表達(dá)，防止病毒的進(jìn)一步侵染，反之，H2O2水平的過高積累再次誘導(dǎo)了APX活性的增加[28-29]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著CoCl2和ACC處理濃度的增加，APX活性均呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，當(dāng)APX活性降至最低時(shí)，匍匐翦股穎幼苗體內(nèi)H2O2大量積累，抑制病害侵染，增強(qiáng)植株抗病性。但經(jīng)高濃度CoCl2和ACC處理后APX活性升至最高，降低了H2O2在植株體內(nèi)水平。Li等[30]的研究結(jié)果也表明，病毒侵染的初期階段，APX活性降低，但隨著H2O2大量積累植物細(xì)胞破壞，APX活性又有所升高。經(jīng)一定濃度的ACC和CoCl2處理，匍匐翦股穎植株體內(nèi)APX活性均顯著高于對(duì)照，且經(jīng)ACC處理后APX活性升至最高?？梢姡欢舛鹊囊蚁┠軌蛘{(diào)節(jié)匍匐翦股穎在ISR抗病反應(yīng)中APX的活性，積累H2O2誘導(dǎo)過敏反應(yīng)，消除H2O2保護(hù)植株正常細(xì)胞，既確?；钚匝踉谥苯右志罢T導(dǎo)抗性基因等ISR抗病反應(yīng)中的作用，又防止活性氧過量積累傷害細(xì)胞。

AsA能夠作為信號(hào)物質(zhì)誘導(dǎo)抗病基因表達(dá)，對(duì)植物中ROS，H2O2和ABA、SA、JA和乙烯等植物激素的含量有一定的調(diào)控作用，從而對(duì)植物的抗病性產(chǎn)生積極作用。在擬南芥vtc1突變體中，AsA的缺乏導(dǎo)致病程相關(guān)蛋白PR1、PR2和PR5編碼基因的不同表達(dá)[31]。同時(shí)，外源AsA可誘導(dǎo)煙草對(duì)TMV產(chǎn)生全株抗性，并表達(dá)了酸性PRs抗性蛋白基因，增強(qiáng)了煙草對(duì)TMV的抗病性[32]。本研究結(jié)果表明，不同濃度CoCl2和ACC處理匍匐翦股穎幼苗后，各處理的AsA含量差異顯著，且經(jīng)ACC處理后的AsA含量顯著高于CoCl2處理?？梢?，匍匐翦股穎ISR抗病反應(yīng)中ET的積累誘導(dǎo)了AsA含量的升高，增強(qiáng)了植株抗病性。同時(shí)隨著乙烯濃度的積累，AsA含量達(dá)到最高。房媛媛等[33]研究發(fā)現(xiàn)匍匐翦股穎植株經(jīng)BDO誘導(dǎo)的ISR抗病反應(yīng)中，隨著接菌時(shí)間的延長，AsA和DHA含量也顯著積累，有效誘導(dǎo)了匍匐翦股穎對(duì)褐斑病的抗性。

在AsA-GSH循環(huán)中，脫氫抗壞血酸再生AsA與GR活性密切相關(guān)，GR活性升高，促進(jìn)DHA還原為AsA，也催化GSSG還原為GSH，GSH直接或間接地調(diào)控了活性氧的合成，誘導(dǎo)了防御基因的表達(dá)，介導(dǎo)了植物體的防御反應(yīng)?；移咸丫秩痉讶~片后，AsA和GSH含量顯著降低，GR活性增強(qiáng)[34]。病毒感染細(xì)胞后，GSH/GSSG顯著下降，這被認(rèn)為是病毒感染后氧化逆境的產(chǎn)生[35]。本研究中，低濃度的乙烯環(huán)境下，匍匐翦股穎幼苗中AsA含量較低，APX活性下降，大量還原型谷胱甘肽GSH被催化還原為GSSG，GSSG大量積累，同時(shí)GR活性較低，GSSG經(jīng)GR少量還原為GSH，GSH保持較低水平。而高濃度的乙烯環(huán)境下，AsA含量較高，APX活性升高，GSSG在高活性GR作用下催化還原為GSH，使得GSH大量積累。研究發(fā)現(xiàn)，GSH能夠調(diào)控JA/ET信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中相關(guān)基因的表達(dá)，而JA和ET是ISR抗病反應(yīng)中重要的信號(hào)分子[36]。因此，在匍匐翦股穎ISR抗病反應(yīng)中，一定濃度乙烯能夠誘導(dǎo)AsA和GSH含量的積累，它們不僅參與了活性氧的代謝平衡，同時(shí)也作為信號(hào)分子在ISR抗病反應(yīng)中起到重要作用。

3.2 不同濃度CoCl2及ACC處理對(duì)匍匐翦股穎ISR反應(yīng)中胼胝質(zhì)沉積的影響

大量研究表明，病原菌侵染植物時(shí)，胼胝質(zhì)的沉積是一種常見的細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)，經(jīng)常以胼胝質(zhì)的積累作為抗病性強(qiáng)弱的指標(biāo)。白粉菌感染擬南芥(Arabidopsisthaliana)、細(xì)菌感染豌豆(Pisumsativum)時(shí)，被感染的細(xì)胞壁處加厚，產(chǎn)生大量的胼胝質(zhì)沉積，感染TMV的煙草，植株整個(gè)葉片細(xì)胞壁上都有胼胝質(zhì)沉積，且抗病植株沉積量顯著高于感病植株[37]。此外，泡桐(Paulownia)感染叢枝病(MLO)后，抗病性和感病無性系篩管胼胝質(zhì)的沉積存在顯著差異，在抗病系中胼胝質(zhì)大量沉積[38]。本研究中匍匐翦股穎葉片感染褐斑病后有大量的胼胝質(zhì)沉積，且沉積部分主要是維管束鞘厚壁細(xì)胞、韌皮部、木質(zhì)部及表皮組織。丁新倫等[39]實(shí)驗(yàn)表明，在水稻條紋病(RSV)的脅迫下，感病水稻葉片組織中胼胝質(zhì)的熒光強(qiáng)度與健株無顯著差異，但是抗病水稻葉片組織中胼胝質(zhì)的熒光強(qiáng)度卻較健株明顯增強(qiáng)，且大維管束鞘內(nèi)層厚壁細(xì)胞、木質(zhì)部和韌皮部以及大維管束鞘延伸的厚壁組織、小維管束、表皮細(xì)胞以及葉肉細(xì)胞均有胼胝質(zhì)熒光出現(xiàn)。

植物抗病信號(hào)傳導(dǎo)途徑分為兩條，分別是SA和JA/ET信號(hào)途徑，其中 JA/ET信號(hào)途徑介導(dǎo)ISR，在JA和ET的相互作用下，影響了植物次生代謝物質(zhì)的積累[33]。研究發(fā)現(xiàn)，芒果(Mangiferaindica)采后使用10 μmol·L-1的茉莉酸甲酯(MeJA)處理顯著降低了貯藏期的病情指數(shù)和接種炭疽病菌的病斑直徑，使用10 μmol·L-1的MeJA處理顯著促進(jìn)了貯存期接種炭疽桿菌芒果果實(shí)內(nèi)源激素乙烯的釋放，其釋放速率呈現(xiàn)出前期迅速增高后期急劇下降的趨勢(shì)，有效增加了貯藏期芒果的抗病性[40]。蘇晶等[41]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用1.0 μL·L-11-MCP處理可以抑制傷口應(yīng)激早期乙烯的釋放，傷口組織中苯丙氨酸酶(PAL)和過氧化物酶(POD)活性受到抑制，降低了傷口處總酚和木質(zhì)素的含量，延緩了愈傷的進(jìn)程，增加了果實(shí)對(duì)灰霉菌的易感性，且1.0 μg·L-1的1-MCP處理可以提高果實(shí)乙烯的釋放量，加快愈傷進(jìn)程，提高果實(shí)的抗病性。上述研究表明，一定濃度的乙烯處理與植物的抗病性呈顯著正相關(guān)，且抗病性越強(qiáng)，染病后胼胝質(zhì)的沉積越多，但目前尚未有ET在草坪草ISR抗病性響應(yīng)中的作用的相關(guān)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，胼胝質(zhì)在匍匐翦股穎感染褐斑病初期，經(jīng)低濃度乙烯合成促進(jìn)劑ACC處理后，尚未大量沉積，隨著發(fā)病時(shí)間的延長，胼胝質(zhì)開始顯著增加，但在褐斑病侵染后期，胼胝質(zhì)的沉積在乙烯合成抑制劑和促進(jìn)劑之間無顯著差異。

綜上所述，在BDO誘導(dǎo)的匍匐翦股穎ISR抗病反應(yīng)中，乙烯信號(hào)分子影響了AsA-GSH循環(huán)以及胼胝質(zhì)的沉積，誘導(dǎo)了匍匐翦股穎的抗病性。一定濃度的乙烯誘導(dǎo)了AsA和GSH含量的明顯上升，但其如何與乙烯信號(hào)分子協(xié)同作用，參與到匍匐翦股穎ISR抗病反應(yīng)，尚有待于進(jìn)一步研究。同時(shí)在匍匐翦股穎感染褐斑病初期，乙烯分子能夠有效誘導(dǎo)胼胝質(zhì)沉積，但在侵染后期乙烯分子無顯著影響。可知乙烯信號(hào)分子對(duì)胼胝質(zhì)沉積的影響是短期效應(yīng)，一定濃度的乙烯分子能有效增強(qiáng)匍匐翦股穎植株對(duì)褐斑病的抵御能力。研究結(jié)果為探清匍匐翦股穎ISR抗病響應(yīng)中ET信號(hào)分子如何調(diào)控抗病生理特性提供了理論基礎(chǔ)。