茉莉酸甲酯對(duì)匍枝筋骨草細(xì)胞生長(zhǎng)和 β-蛻皮甾酮積累的影響

王曉梅，遲德富，宇佳

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院, 黑龍江 哈爾濱 150040)

蛻皮激素(ecdysone)是一類調(diào)節(jié)昆蟲蛻皮、變態(tài)，影響昆蟲發(fā)育的內(nèi)源激素，最早由生物學(xué)家Polish于1919年提出[1]。1954年，科學(xué)家們首次從50多萬頭家蠶(Bombyxmori)蛹中成功分離出α-蛻皮激素[2]，并確定了α、β-蛻皮激素的甾體結(jié)構(gòu)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，這些甾體化合物多在昆蟲幼期的前胸腺產(chǎn)生，在成蟲期轉(zhuǎn)由性腺分泌。蛻皮激素是以膽固醇作為骨架來合成的。但昆蟲本身并不能合成膽固醇，而是直接或間接地從植物中得到。所以，昆蟲在幼蟲期間需要不斷進(jìn)行取食植物來獲取蛻皮激素的前體物質(zhì)[3]。

研究發(fā)現(xiàn)，在自然界中有300多種植物中都含有類似于昆蟲蛻皮激素的次生代謝物。這些次生代謝物被統(tǒng)稱為植物蛻皮甾醇(phytoecdysteroid)。含植物蛻皮甾醇的植物中，鴨跖草科、馬鞭草科、唇形科、菊科、莧科、天南星科和羅漢松科的植物居多[4-7]。而植物中植物蛻皮甾醇含量往往遠(yuǎn)高于昆蟲體內(nèi)蛻皮激素的含量[4]。為此，很多學(xué)者致力于植物蛻皮甾醇的種類鑒定、提取工藝、功能等方面的研究[8-9]。

匍枝筋骨草(Ajugalobata)為唇形科(Lamiaceae)筋骨草屬(Ajuga)植物，主要生長(zhǎng)在路邊、溪邊、山地丘陵等陰涼濕潤(rùn)之地，具有抗菌消炎、清熱解毒、化痰止咳等作用。匍枝筋骨草全株均含有植物蛻皮甾醇(phytoecdysteroid)中的一種主要成分，即β-蛻皮甾酮(β-ecdysterone，β-EC)，也被稱為20-羥基蛻皮激素(20-hydroxyecdysone)或β-蛻皮激素(β-ecdysone)[10-11]，且含量較高，約為全株重量的0.1%。陳小霞等[12]對(duì)3種筋骨草屬植物進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)金瘡小草(Ajugadecumbens)中所含β-EC高達(dá)4.4976 mg·g-1；而邱志國(guó)等[11]對(duì)筋骨草蛻皮激素類物質(zhì)的分析發(fā)現(xiàn)線葉筋骨草中β-EC含量可達(dá)414 μg·g-1；黎昕等[13]發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加1 mg·L-16-BA可促使筋骨草細(xì)胞內(nèi)β-EC含量，達(dá)0.2092 g·L-1；錢晶晶等[14]發(fā)現(xiàn)匍枝筋骨草懸浮細(xì)胞中β-EC含量可達(dá)0.246 g·L-1。

茉莉酸甲酯(jasmonic acid methyl ester，MeJA)是從素馨花(Jasminumgrandiflorum)精油中分離出來的一種揮發(fā)性物質(zhì)[15]，對(duì)植物有著廣泛的生理作用[16]。它可以抑制植物生長(zhǎng)，增加植物的抗性，提高脅迫能力。同時(shí)，它作為誘導(dǎo)子，可以參與膜間內(nèi)源信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，還可間接誘導(dǎo)產(chǎn)生大量次生代謝物質(zhì)[17-18]，具有類似于ABA的作用[17]。

本實(shí)驗(yàn)建立了匍枝筋骨草生長(zhǎng)模型及β-EC積累模型，通過在匍枝筋骨草懸浮細(xì)胞中添加MeJA，研究對(duì)其生長(zhǎng)狀況、β-EC積累的相關(guān)影響。旨在促進(jìn)提高β-EC產(chǎn)量，為工業(yè)化生產(chǎn)β-EC奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)在2016年5月在室內(nèi)進(jìn)行，于2017年3月完成試驗(yàn)。根據(jù)趙曉杰等[19]建立的匍枝筋骨草體系，選取繼代4～10代的懸浮細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料。細(xì)胞室培養(yǎng)條件：溫度(23±2) ℃，光周期16 h光照/8 h黑暗，濕度50%～60%，光照強(qiáng)度2000 lx，搖床轉(zhuǎn)速120～130 r·min-1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1生物量的測(cè)定 在無菌條件下，取4～10代懸浮細(xì)胞5 g，加入至50 mL的懸浮培養(yǎng)液中(接種量10%)，在搖床上分別培養(yǎng)4, 7, 10 d后添加不同濃度的誘導(dǎo)子茉莉酸甲酯，每天取樣觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，每處理重復(fù)3次，處理的細(xì)胞液過300目細(xì)胞篩(孔徑為48 μm)，擠壓吸干水分，稱其重量即得鮮重。鮮細(xì)胞在60 ℃的條件下烘干至恒重，即得干重。

1.2.2誘導(dǎo)子MeJA配置 取1 mL的MeJA標(biāo)準(zhǔn)品(95%，sigma公司)溶于50%的無水乙醇中，定容至50 mL，即得MeJA母液。經(jīng)0.22 μm的濾膜過濾后，向50 mL的培養(yǎng)液中分別添加6、29、57、86、115 μL的茉莉酸甲酯母液，使培養(yǎng)液中誘導(dǎo)子茉莉酸甲酯的最終質(zhì)量濃度分別為10、50、100、150和200 μmol·L-1。在對(duì)照組的培養(yǎng)瓶中亦加入對(duì)應(yīng)體積的50%乙醇。

1.2.3樣品的制備 所得干細(xì)胞在研缽中加入液氮，在低溫條件下研磨成粉，取0.1 g干品粉末溶于2 mL甲醇中，在暗條件下浸提24 h，超聲振蕩1 h，微波消解10 min(消解溫度：50 ℃，功率：300 W×2，壓強(qiáng)：當(dāng)前壓力的兩倍)，靜置取上清液，用0.45 μm的有機(jī)濾膜過濾，即得測(cè)定液。

1.3 測(cè)定方法

用HPLC Waters 2695檢測(cè)β-EC含量。檢測(cè)條件：進(jìn)樣量10 μL，流速0.6 mL·min-1，Waters 2996 PDA檢測(cè)器(波長(zhǎng)范圍：190～800 nm)，流動(dòng)相(甲醇∶水=1∶1)，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫：25 ℃。色譜柱型號(hào)：C18(4.6×250 mm，5 μm 粒度)。

1.4 提取方法的驗(yàn)證與儀器校準(zhǔn)

1.4.1蛻皮激素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取蛻皮激素標(biāo)準(zhǔn)樣品8 mg溶于10 mL色譜純甲醇中，即得0.8 g·L-1β-EC的標(biāo)準(zhǔn)液。再依次分別配置濃度梯度為0.4、0.2、0.1、0.05 g·L-1的蛻皮激素標(biāo)準(zhǔn)液，分別進(jìn)樣10 μL，重復(fù)進(jìn)樣3次，制作β-EC線性回歸方程：y=3×107x-451985，R2=0.9993。

1.4.2精密度試驗(yàn) 取3個(gè)不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)液，分別進(jìn)樣10 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積，測(cè)得3個(gè)處理峰面積分別是5720135、11483655、23242561，計(jì)算測(cè)得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)=0.94%。

1.4.3重復(fù)性試驗(yàn) 取3個(gè)處理的匍枝筋骨草粉末，每個(gè)處理稱取5份，分別提取，進(jìn)樣，記錄峰面積，測(cè)得3個(gè)峰面積分別是26885、1921143、2159040，計(jì)算測(cè)得RSD=1.05%。

1.4.4穩(wěn)定性試驗(yàn) 取3個(gè)處理已制備的待測(cè)液，分別在0、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，測(cè)得3個(gè)峰面積分別是2149598、2100529、3284488，計(jì)算測(cè)得RSD=0.96%。

1.4.5加樣回收率試驗(yàn) 取3個(gè)處理的待測(cè)液，分別添加標(biāo)準(zhǔn)液，每個(gè)處理按照其所含β-EC濃度的80%、100%、120%設(shè)置3個(gè)濃度梯度，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，測(cè)得3個(gè)峰面積分別是1333620、2527232、2167941，測(cè)得平均加樣回收率(P)=97.26%，平均RSD=1.38%。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003進(jìn)行圖表的制作，采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)單因素方差分析，多重比較采用鄧肯極差檢驗(yàn)法(SSR法)，顯著性水平F=0.05。相關(guān)性分析采用Pearson法進(jìn)行簡(jiǎn)單相關(guān)分析。生長(zhǎng)模型采用Logistic，利用Origin 8進(jìn)行曲線的擬合度和相關(guān)參數(shù)的計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 匍枝筋骨草的生長(zhǎng)曲線及蛻皮甾酮積累曲線的規(guī)律

2.1.1細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 取懸浮細(xì)胞5 g加入50 mL的培養(yǎng)體系中，培養(yǎng)周期20 d。根據(jù)圖1細(xì)胞生長(zhǎng)曲線得知，細(xì)胞鮮重曲線呈現(xiàn)Logistic型增長(zhǎng)趨勢(shì)，分為4個(gè)生長(zhǎng)期。0～4 d為細(xì)胞生長(zhǎng)的遲滯期。此期細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，增殖倍數(shù)在37%～85%之間。4～10 d為細(xì)胞生長(zhǎng)的快速增殖期。此期細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)快速。其中第4天為細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的初始期，第10天達(dá)到細(xì)胞生長(zhǎng)的高峰期，鮮重達(dá)到32.12 g，增殖倍數(shù)達(dá)到351%。10～18 d為細(xì)胞生長(zhǎng)的平緩期，此期細(xì)胞保持在一個(gè)穩(wěn)定的水平上，鮮重在31.29～32.72 g。18～20 d進(jìn)入細(xì)胞生長(zhǎng)的衰落期，此期細(xì)胞生長(zhǎng)量逐漸減低，細(xì)胞開始褐化，逐漸老化死亡。細(xì)胞干重曲線與細(xì)胞鮮重曲線趨勢(shì)相似，4 d細(xì)胞干重為0.22 g，8 d進(jìn)入干物質(zhì)積累高峰期，細(xì)胞干重達(dá)到0.58 g，于18 d開始死亡。

2.1.2細(xì)胞內(nèi)β-蛻皮甾酮?jiǎng)討B(tài)積累曲線 從圖2看出，β-蛻皮甾酮(β-EC)積累曲線屬于與生長(zhǎng)偶聯(lián)型的次生代謝模型，且呈線性正相關(guān)。在生長(zhǎng)期第4天進(jìn)入β-EC快速積累期，第10天達(dá)到合成的高峰期，細(xì)胞中β-EC含量達(dá)到0.25 mg·g-1，10～16 d期間β-EC含量略有降低，但降低的速度緩慢，16 d后積累量迅速下降。

2.1.3細(xì)胞生長(zhǎng)和β-蛻皮甾酮積累曲線的模型擬合 以細(xì)胞培養(yǎng)天數(shù)(d)為自變量(x)，分別以細(xì)胞鮮重(g)、細(xì)胞干重(g)、β-EC合成量(mg·g-1)為因變量(y)，建立生長(zhǎng)模型。從表1得知，鮮重、干重、β-EC含量生長(zhǎng)模型都為L(zhǎng)ogistic，說明三者的變化規(guī)律相對(duì)同步，擬合曲線基本一致。其中，細(xì)胞鮮重、干重生長(zhǎng)曲線決定系數(shù)達(dá)到0.95，擬合程度較好。而β-EC積累曲線擬合模型的決定系數(shù)為0.86。

圖1 匍枝筋骨草懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of A. lobata suspension cells

圖2 匍枝筋骨草懸浮細(xì)胞β-蛻皮甾酮含量動(dòng)態(tài)曲線Fig.2 Content dynamic curve of β-EC content in A. lobata suspension cells

類別Category曲線類型Curve types擬合方程Fitting equation決定系數(shù)R2鮮重Cell fresh weight邏輯斯蒂曲線LogisticY=30.88-24.14/[1+(x/6.12)8.85]0.95干重Cell dry weight邏輯斯蒂曲線LogisticY=0.55-0.40/[1+(x/5.43)6.91]0.95β-EC含量β-EC content邏輯斯蒂曲線LogisticY=0.22-0.16/[1+(x/5.28)7.52]0.86

2.2 添加誘導(dǎo)子MeJA對(duì)筋骨草懸浮細(xì)胞的影響

2.2.1細(xì)胞鮮重的變化 根據(jù)表2得知，在培養(yǎng)了4 d的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系中，添加了10、50、100、150、200 μmol·L-1MeJA。 在處理后的第1天， 除添加100 μmol·L-1濃度的MeJA外， 其他處理懸浮細(xì)胞鮮重與CK差異顯著(P<0.01)。在處理后的第3、5、7、10天，各處理則均與CK差異顯著(P<0.05)。而在經(jīng)MeJA處理后的5個(gè)觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，各濃度處理組間均差異顯著(P<0.05)。其中，添加10、50 μmol·L-1濃度下，處理組懸浮細(xì)胞鮮重均高于CK，100、150、200 μmol·L-1濃度下細(xì)胞鮮重與CK相比表現(xiàn)抑制作用。在各個(gè)添加濃度中，50 μmol·L-1濃度下細(xì)胞鮮重增加值相對(duì)較高，在處理后的5個(gè)觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，細(xì)胞鮮重分別達(dá)到了11.68、25.21、33.76、35.10和32.20 g，細(xì)胞鮮重分別比同期CK增加了18.42%、33.15%、16.25%、12.16%和10.59%。而200 μmol·L-1濃度下細(xì)胞鮮重降低最顯著，在處理后的5個(gè)觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，細(xì)胞鮮重分別比同期CK下降了38.88%、32.86%、31.58%、26.35%和27.63%。

表2 在懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的不同時(shí)間添加不同濃度的茉莉酸甲酯對(duì)筋骨草生物量的影響Table 2 The influence on A. lobata suspension cell biomass after adding different concentration of MeJA at different culture time

注：表中數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。同列中*表示在同一時(shí)間內(nèi)CK和處理差異顯著(P<0.05)。同列中不同小寫字母表示同一時(shí)間內(nèi)處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

Notes: The data are given as means±SE in the Table.*denote significant different atP<0.05 compare with control at the same time in the same column. Different lowercase letters indicate significant different atP<0.05 at the same time in the same column. The same below.

在培養(yǎng)了7 d的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系中添加MeJA后細(xì)胞鮮重變化規(guī)律與培養(yǎng)了4 d的相似。在處理后1、3、5、7、10 d，各濃度處理組細(xì)胞鮮重均與CK差異顯著(P<0.01)，且各濃度處理組間差異均顯著(P<0.01)。其中，10、50 μmol·L-1濃度下細(xì)胞鮮重均高于CK，表現(xiàn)促進(jìn)作用。100、150、200 μmol·L-1濃度下細(xì)胞鮮重明顯低于CK，表現(xiàn)抑制作用。在各個(gè)濃度處理組中，50 μmol·L-1濃度下細(xì)胞鮮重增加最為顯著，表現(xiàn)最佳，在處理后的5個(gè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)鮮重分別達(dá)到27.20、35.90、33.89、31.34、29.26 g，與同期CK相比分別增重9.21%、18.17%、9.34%、7.61%、8.17%。而200 μmol·L-1濃度下細(xì)胞鮮重則降低較顯著，與同期CK相比分別下降35.56%、27.10%、21.57%、17.16%、14.85%。

在培養(yǎng)了10 d的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系中添加不同濃度的MeJA，處理后第1、3、5、7、10天，各濃度處理組細(xì)胞鮮重均與CK差異顯著(P<0.05)。處理后第1、3天，各濃度處理組間差異均顯著(P<0.05)。而處理后第5天，除100與150 μmol·L-1外，其他濃度處理組間差異均顯著(P<0.05)。處理后第7天，除10與50 μmol·L-1、150與200 μmol·L-1外，其他濃度處理組間差異均顯著(P<0.05)。處理后第10天，各處理組間差異均不顯著(P>0.05)。其中，處理后第1天，除添加10 μmol·L-1濃度的MeJA外，其他濃度處理懸浮細(xì)胞鮮重均顯著低于CK。在處理后的第3、5、7、10天，各濃度處理組均明顯低于CK。在添加的各個(gè)濃度處理組中，只有處理后第1天的10 μmol·L-1濃度下細(xì)胞鮮重有所增加，與同期CK相比僅增重2.85%。在處理后的第1、3、5、7天，200 μmol·L-1濃度下細(xì)胞鮮重均顯著降低，細(xì)胞鮮重分別比同期CK下降了23.65%、31.01%、29.93%、24.67%。

結(jié)果表明細(xì)胞的誘導(dǎo)子因MeJA添加周期、濃度的不同而發(fā)生變化，同時(shí)還與處理時(shí)間的長(zhǎng)短有密切關(guān)系。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞逐漸衰老死亡。同時(shí)，誘導(dǎo)子MeJA濃度的增大會(huì)加速細(xì)胞的衰老。此外，在細(xì)胞快速生長(zhǎng)的高峰期添加MeJA可促進(jìn)細(xì)胞快速衰老，而在細(xì)胞快速生長(zhǎng)期的初始期、中期添加MeJA后，細(xì)胞的衰老速度則相對(duì)較緩。

2.2.2不同添加時(shí)間對(duì)細(xì)胞干重的影響 從圖3可看出，在培養(yǎng)了4 d的懸浮體系中添加的MeJA后，各處理組細(xì)胞干重不同。添加10 μmol·L-1后細(xì)胞干重曲線與CK曲線有一定程度的交叉重合，最大差值僅為0.026 g，差異不顯著(P>0.05)。添加50 μmol·L-1的MeJA后，細(xì)胞干重曲線在前期(添加后2～5 d)顯著高于CK曲線，最大差值達(dá)到0.203 g(P<0.05)。添加100 μmol·L-1的MeJA后，其細(xì)胞干重曲線與CK曲線相比差異不顯著(P>0.05)，表現(xiàn)輕微下降的趨勢(shì)。添加200 μmol·L-1后細(xì)胞干重曲線則表現(xiàn)完全抑制作用(P<0.05)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，各個(gè)細(xì)胞干重曲線均有一個(gè)小高峰。其中50 μmol·L-1細(xì)胞干重曲線在處理后5 d達(dá)到生長(zhǎng)高峰，干物質(zhì)積累達(dá)到0.60 g，顯著優(yōu)于其他各處理(P<0.05)。

從圖4看出，在培養(yǎng)了7 d的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系中添加MeJA后，其細(xì)胞干重曲線與在培養(yǎng)了4 d的體系中添加MeJA后獲得的細(xì)胞干重曲線有相似之處。其中添加50 μmol·L-1細(xì)胞干重曲線在前期(添加后1～9 d)顯著高于CK曲線(P<0.05)，其高峰期出現(xiàn)在處理后的第3天，細(xì)胞干重達(dá)到0.62 g。而添加了200 μmol·L-1MeJA后的細(xì)胞干重曲線顯著低于CK曲線(P>0.05)。

從圖5可看出，與CK細(xì)胞干重曲線相比，在培養(yǎng)了10 d的懸浮培養(yǎng)體系中，加入各濃度的MeJA后，各處理組細(xì)胞干重曲線整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其與CK曲線最大差值達(dá)到0.216 g，顯著低于CK曲線(P>0.05)。

綜合分析圖3、4、5的試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞生長(zhǎng)的不同周期添加MeJA后其細(xì)胞干重曲線有所不同。在細(xì)胞快速生長(zhǎng)的初始期及中期添加MeJA，低濃度可促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)。而高峰期后添加MeJA會(huì)加速細(xì)胞的老化，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)起抑制作用。

圖3 在第4天向懸浮培養(yǎng)體系中添加 MeJA對(duì)細(xì)胞干重的影響Fig.3 The effect on cell dry weight after adding MeJA into suspension culture system at the 4th days

圖4 在第7天向懸浮培養(yǎng)體系中添加 MeJA對(duì)細(xì)胞干重的影響Fig.4 The effect on cell dry weight after adding MeJA into suspension culture system at the 7th days

圖5 在第10天向懸浮培養(yǎng)體系中添加 MeJA對(duì)細(xì)胞干重的影響Fig.5 The effect on cell dry weight after adding MeJA into suspension culture system at the 10th days

2.2.3β-蛻皮甾酮積累量的變化 根據(jù)表3得知，在培養(yǎng)了4 d的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系中添加了10、50、100、150、200 μmol·L-1的MeJA。處理后第1、3、5、7、10天，各濃度處理組β-蛻皮甾酮(β-EC)積累量均與CK差異顯著(P<0.05)。在觀測(cè)的5個(gè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，處理后第1、5、10天，各濃度處理組間β-EC積累量差異顯著(P<0.05)。而在處理后第3天，50與200 μmol·L-1濃度處理組間積累量差異不顯著(P>0.05)，其他濃度處理組間則差異顯著(P<0.05)。在處理后第7天，10、50、100、150 μmol·L-1濃度組間β-EC積累量差異顯著(P<0.05)，10與200 μmol·L-1濃度組間β-EC積累量則差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著MeJA濃度的增大，β-EC積累量呈先升后降趨勢(shì)。在各濃度處理組中，100 μmol·L-1濃度下β-EC積累量表現(xiàn)最佳，在處理后的5個(gè)時(shí)間觀測(cè)點(diǎn)內(nèi)積累量分別達(dá)到1.5465、2.7766、0.7544、0.4735、0.2808 mg·g-1，分別為同期CK的15.84、20.77、2.48、0.80、0.13倍。而在處理后第1、3、5天，10 μmol·L-1濃度下β-EC積累量顯著降低，分別為同期CK的0.80、0.58、0.23倍。在處理后第7、10天，200 μmol·L-1濃度下β-EC積累量最低，分別為同期CK的0.17和0.01倍。

在培養(yǎng)了7 d的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系中添加了不同濃度的MeJA處理后的5個(gè)時(shí)間觀測(cè)點(diǎn)內(nèi)，各濃度處理組β-EC積累量均與CK相比差異顯著(P<0.05)。在處理后第3天，除200與10 μmol·L-1濃度組間積累量則差異不顯著(P>0.05)外，其他濃度處理組間差異顯著(P<0.05)。而在處理后第1、5、7、10天，各濃度處理組間均差異顯著(P<0.05)。隨著處理濃度組依次增大，β-EC積累量表現(xiàn)先升后降。在處理后第1天，150 μmol·L-1濃度下β-EC積累量最佳，為1.4986 mg·g-1，增長(zhǎng)率為同期CK的10.40倍。而在之后第3、5、7、10天，100 μmol·L-1濃度下β-EC積累量顯著提高，分別達(dá)到0.5541、1.2164、3.5315、0.6901 mg·g-1，增長(zhǎng)率分別為同期CK的1.38、3.52、14.44、3.15倍。在各個(gè)添加濃度中，在處理后的第1、3天，10 μmol·L-1濃度下β-EC積累量較低，為0.3455、0.3662 mg·g-1，增長(zhǎng)率分別為同期CK的1.62、0.98倍。而在處理的第5、7、10天，200 μmol·L-1濃度下β-EC積累量相對(duì)較低，分別為0.2626、0.2165、0.1560 mg·g-1，增長(zhǎng)率分別比同期CK下降了2.2749%、5.3261%、6.1449%。

表3 在懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的不同時(shí)間添加不同濃度的茉莉酸甲酯對(duì)筋骨草β-蛻皮甾酮含量的影響Table 3 The influence on A. lobata β-EC content after adding different concentration of MeJA at different culture time

在培養(yǎng)了10 d的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系中添加了不同濃度的MeJA，處理后第1天，各濃度處理組β-EC積累量均與CK差異顯著(P<0.05)，各處理組間β-EC積累量均差異顯著(P<0.05)。此期50 μmol·L-1濃度下β-EC積累量最佳，為0.6797 mg·g-1，β-EC增長(zhǎng)率為同期CK的1.75倍。200 μmol·L-1濃度下β-EC積累量較低，為0.2324 mg·g-1，比同期CK下降了5.8663%。處理后第3天，除了150 μmol·L-1濃度處理組外，其他濃度處理組間β-EC積累量與CK相比均差異顯著(P<0.05)。而各濃度處理組間β-EC積累量均差異顯著(P<0.05)。其中，10 μmol·L-1濃度下積累量達(dá)到1.4136 mg·g-1，增長(zhǎng)率為同期CK的5.06倍。200 μmol·L-1濃度下積累量為0.1576 mg·g-1，比同期CK下降了32.3294%。處理后第5天，除了100 μmol·L-1濃度處理組外，10、50 μmol·L-1濃度下β-EC積累量與CK差異顯著(P<0.05)。150、200 μmol·L-1濃度下則未檢測(cè)到β-EC。10、50、100 μmol·L-1濃度組間β-EC積累量均差異顯著。其中，10 μmol·L-1濃度下積累量為0.8534 mg·g-1，增長(zhǎng)率為同期CK的3.38倍。100 μmol·L-1濃度下積累量為0.1884 mg·g-1，比同期CK下降了3.2129%。處理后第7、10天，除CK外，各濃度處理組均未檢測(cè)到β-EC。

綜合分析發(fā)現(xiàn)，β-EC的積累量與誘導(dǎo)子MeJA的添加時(shí)間、處理時(shí)長(zhǎng)以及處理濃度有直接關(guān)系。在細(xì)胞快速生長(zhǎng)的初始期(第4天)添加MeJA后對(duì)細(xì)胞相對(duì)刺激較小，各處理與CK相比，β-EC積累量均有不同程度的提升，表現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)。而在細(xì)胞的快速生長(zhǎng)的中期添加(第7天)MeJA后，細(xì)胞中β-EC積累量則有大幅提高，在一定濃度下隨著處理天數(shù)的增加，β-EC積累量緩慢升高，而添加高濃度MeJA后，β-EC積累量表現(xiàn)為短時(shí)間內(nèi)急速升高后下降。在細(xì)胞的快速生長(zhǎng)的高峰期(第10天)添加MeJA后對(duì)細(xì)胞刺激較大，添加低濃度的MeJA可在短時(shí)間內(nèi)刺激產(chǎn)生大量的β-EC，但是之后細(xì)胞漸漸衰老死亡，添加高濃度MeJA后，β-EC積累量則較少。

2.2.4β-蛻皮甾酮積累量與細(xì)胞干重相關(guān)性分析 以β-EC積累量為因變量，細(xì)胞干重為自變量，采用Pearson法分析MeJA的不同添加時(shí)期對(duì)β-EC積累量、細(xì)胞干重的相互影響。由表4可知，在培養(yǎng)了4 d的懸浮細(xì)胞中添加了不同濃度的MeJA后，各濃度處理組生長(zhǎng)量與β-蛻皮甾酮(β-EC)含量都近似表現(xiàn)極顯著相關(guān)。其中，添加10、50 μmol·L-1的MeJA后，細(xì)胞生長(zhǎng)量與β-EC含量呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到0.918、0.929。添加150、200 μmol·L-1的MeJA兩者間亦表現(xiàn)正相關(guān)(P<0.01)，而添加100 μmol·L-1的MeJA則呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)(P<0.01)。此期細(xì)胞生長(zhǎng)量與β-EC含量相關(guān)性從大到小依次為：50 μmol·L-1>10 μmol·L-1>200 μmol·L-1>150 μmol·L-1>100 μmol·L-1。

在培養(yǎng)了7 d的懸浮細(xì)胞中添加了不同濃度的MeJA后細(xì)胞生長(zhǎng)量與β-EC含量相關(guān)性和培養(yǎng)了4 d的懸浮細(xì)胞的相關(guān)性基本一致，其中添加50 μmol·L-1的MeJA后細(xì)胞生長(zhǎng)量與β-EC含量的相關(guān)性最高，相關(guān)系數(shù)可達(dá)到0.920。不同的是，添加100、150 μmol·L-1的MeJA后細(xì)胞生長(zhǎng)量與β-EC含量顯著性不相關(guān)(P>0.05)。此期細(xì)胞生長(zhǎng)量與β-EC含量相關(guān)性從大到小依次為：50 μmol·L-1>10 μmol·L-1>200 μmol·L-1>150 μmol·L-1>100 μmol·L-1。

表4 不同濃度MeJA處理下β-蛻皮甾酮含量與 細(xì)胞生長(zhǎng)量的相關(guān)分析Table 4 Correlation coefficients between β-EC content and cell growth under different concentration of MeJA

注：*和**分別表示細(xì)胞生長(zhǎng)量與β-蛻皮甾酮含量在P<0.05和P<0.01的水平上差異顯著。

Notes:* and ** indicate significant correlation on theP<0.05 andP<0.01 level between β-EC content and cell growth.

在培養(yǎng)了10 d的懸浮細(xì)胞中添加了不同濃度的MeJA后，添加10 μmol·L-1的MeJA表現(xiàn)無顯著相關(guān)(P>0.05)，添加50、100、150、200 μmol·L-1的MeJA則都呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)分別為0.785、0.968、0.934、0.904。此期細(xì)胞生長(zhǎng)量與β-EC含量相關(guān)性從大到小依次為：100 μmol·L-1>150 μmol·L-1>200 μmol·L-1>50 μmol·L-1>10 μmol·L-1。

經(jīng)結(jié)果分析表明細(xì)胞生長(zhǎng)量與β-EC含量的相關(guān)性隨著MeJA添加時(shí)間和濃度的不同而發(fā)生變化。在細(xì)胞快速生長(zhǎng)期的初始期(第4天)添加低濃度MeJA后細(xì)胞生長(zhǎng)量與β-EC含量的相關(guān)系數(shù)較大，而添加高濃度MeJA后相關(guān)系數(shù)則逐漸減小或?yàn)樨?fù)。在細(xì)胞快速生長(zhǎng)的中期(第7天)添加MeJA后細(xì)胞生長(zhǎng)量與β-EC含量相關(guān)性規(guī)律與細(xì)胞快速生長(zhǎng)期的初始期(第4天)添加相似。低濃度相關(guān)系數(shù)較大，高濃度相關(guān)系數(shù)則減小或?yàn)樨?fù)。在細(xì)胞快速生長(zhǎng)的高峰期(第10天)添加MeJA相關(guān)性規(guī)律與第4天或第7天的規(guī)律不一致。此時(shí)，添加高濃度MeJA后細(xì)胞生長(zhǎng)量與β-EC含量的相關(guān)系數(shù)較大，添加低濃度MeJA則相關(guān)系數(shù)較小。

2.2.5β-蛻皮甾酮總含量的變化 由表5可知，向培養(yǎng)了4 d的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系中添加了10、50、100、150、200 μmol·L-1的MeJA，除了處理后第3天的10、200 μmol·L-1外，其他處理組培養(yǎng)體系中所有細(xì)胞的β-EC總含量均與CK差異顯著(P<0.05)。處理后第1、5、7、10天，各處理組β-EC總含量均與CK差異顯著(P<0.05)。處理后第1天，除200與10、50 μmol·L-1濃度組間差異不顯著外(P>0.05)，各樣品處理組間β-EC總含量均差異顯著(P<0.05)。在各個(gè)濃度處理組中，100 μmol·L-1濃度下β-EC總含量為0.3145 mg，表現(xiàn)最佳，而10 μmol·L-1濃度下總含量較低，僅為0.0359 mg。處理后第3天， 除100與150 μmol·L-1濃度處理組間β-EC總含量差異顯著外(P<0.05)，其他處理組間β-EC總含量差異不顯著(P>0.05)。在各個(gè)濃度處理組中，100 μmol·L-1濃度下β-EC總含量達(dá)到0.7868 mg，200 μmol·L-1濃度下β-EC總含量較低，僅為0.0615 mg。處理后第5天，除200、10 μmol·L-1外，其他處理組間β-EC總含量均差異顯著(P<0.05)。在各個(gè)濃度處理組中，100 μmol·L-1濃度下β-EC總含量較高，但與處理后第3天相比有所下降，為0.2816 mg。而10 μmol·L-1濃度下β-EC總含量較低，僅為0.1095 mg。處理后第7天，除10、150 μmol·L-1外，其他處理組間β-EC總含量差異顯著(P<0.05)。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，100 μmol·L-1濃度下β-EC總含量較高，但與處理后第5天相比呈降低趨勢(shì)，為0.2336 mg，200 μmol·L-1濃度下β-EC總含量?jī)H為0.0813 mg。處理后第10天，除10、100 μmol·L-1外，其他處理組間β-EC總含量差異顯著(P<0.05)。在5個(gè)濃度處理組中，50 μmol·L-1濃度下β-EC總含量較高，為0.1077 mg。200 μmol·L-1濃度下β-EC總含量較低，僅為0.0535 mg。

表5 在懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的不同時(shí)間添加不同濃度的茉莉酸甲酯對(duì)筋骨草樣品內(nèi)β-蛻皮甾酮總含量的影響Table 5 The influence insampleson A. lobata β-EC totalcontent after adding different concentration of MeJA at different culture time

在培養(yǎng)了7 d的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系中添加了不同濃度的MeJA后第3天，200 μmol·L-1濃度的β-EC總含量與CK差異不顯著(P>0.05)。處理后第7天，10、150、200 μmol·L-1濃度的β-EC總含量與CK差異亦不顯著(P>0.05)。處理后第1、5、10天，各濃度組內(nèi)β-EC總含量與CK相比均差異顯著(P<0.05)。處理后第1天，除50、150、200 μmol·L-1濃度組間β-EC總含量差異顯著外(P<0.05)，其他濃度組間β-EC總含量差異不顯著(P>0.05)。在各個(gè)濃度處理組中，150 μmol·L-1濃度下β-EC總含量最高，達(dá)到0.5244 mg，10 μmol·L-1濃度下β-EC總含量較低，僅為0.1474 mg。處理后第3天，除50與100 μmol·L-1組間β-EC總含量差異不顯著外(P>0.05)，其他處理組間β-EC總含量均差異顯著(P<0.05)。在各個(gè)濃度處理組中，100 μmol·L-1濃度下β-EC總含量較高，為0.2955 mg。而200 μmol·L-1濃度下β-EC總含量?jī)H為0.1339 mg。處理后第5天，各濃度處理組間β-EC總含量均差異顯著(P<0.05)。在各個(gè)濃度處理組中，100 μmol·L-1濃度下β-EC總含量較高，為0.5798 mg。200 μmol·L-1濃度下β-EC總含量?jī)H為0.0797 mg。處理后第7天，除10與50、150 μmol·L-1，150和200 μmol·L-1處理樣品組間β-EC總含量差異不顯著(P>0.05)，其他濃度間β-EC總含量差異均顯著(P<0.05)。在各個(gè)濃度處理中，100 μmol·L-1濃度下β-EC總含量最高，與處理后第5天相比有大幅提升，達(dá)1.2124 mg，200 μmol·L-1濃度下β-EC總含量?jī)H為0.0447 mg。處理后第10天，除10與50 μmol·L-1、150與200 μmol·L-1外，其他濃度處理組間β-EC總含量均差異顯著(P<0.05)。在各個(gè)濃度處理組中，100 μmol·L-1濃度下β-EC總含量較高，與處理后第7天相比有所下降，為0.1334 mg。而200 μmol·L-1濃度下β-EC總含量?jī)H為0.0302 mg。

在培養(yǎng)了10 d的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系中添加了不同濃度的MeJA，處理后第1天，除150 μmol·L-1濃度的β-EC總含量與CK差異不顯著外(P>0.05)，其他濃度組β-EC總含量均與CK差異顯著(P<0.05)。各濃度處理組間β-EC總含量均差異顯著(P<0.05)。在各個(gè)濃度處理組中，50 μmol·L-1濃度下β-EC總含量較高，為0.3013 mg，而200 μmol·L-1濃度下β-EC總含量?jī)H為0.0798 mg。處理后第3天，各濃度處理組間β-EC總含量均差異顯著(P<0.05)。此期10 μmol·L-1濃度下β-EC總含量較高，為0.5889 mg，之后隨著添加濃度的增大，含量逐漸減少，200 μmol·L-1濃度下β-EC總含量?jī)H為0.0384 mg。處理后第5天，10、50、100 μmol·L-1濃度下β-EC總含量差異顯著(P<0.05)，150、200 μmol·L-1濃度下未檢測(cè)到β-EC。此期10 μmol·L-1濃度下β-EC總含量較高，為0.2786 mg，隨著添加濃度的增大，含量逐漸減少，100 μmol·L-1濃度下β-EC總含量?jī)H為0.0465 mg。

結(jié)果表明，筋骨草懸浮細(xì)胞內(nèi)β-EC的含量與處理時(shí)間的長(zhǎng)短和誘導(dǎo)子的濃度有直接關(guān)系，同時(shí)也與細(xì)胞自身生長(zhǎng)狀況有關(guān)。在細(xì)胞快速生長(zhǎng)的初始期(處理后第4天)添加MeJA，對(duì)細(xì)胞影響較小，細(xì)胞內(nèi)β-EC含量提高幅度較小，隨著處理后時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞逐漸衰老，細(xì)胞內(nèi)β-EC含量亦都大幅減少。細(xì)胞快速生長(zhǎng)的中期(處理后第7天)是MeJA最適添加時(shí)期，此期對(duì)細(xì)胞刺激適中，一定濃度下可促進(jìn)β-EC的產(chǎn)生和積累，獲得最高產(chǎn)量。在細(xì)胞快速生長(zhǎng)的高峰期(處理后第10天)添加MeJA對(duì)細(xì)胞影響較大，可在短期內(nèi)獲得較多的β-EC，但存在時(shí)間較短，細(xì)胞反應(yīng)劇烈，迅速衰老。

3 討論與結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，筋骨草細(xì)胞在培養(yǎng)的初始階段，細(xì)胞增殖速度較慢，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而轉(zhuǎn)變?yōu)榭焖僭鲋常竭_(dá)高峰后趨于穩(wěn)定狀態(tài)。β-蛻皮甾酮(β-EC)含量積累曲線也基本符合此規(guī)律。該研究結(jié)果與其他種類的筋骨草懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)規(guī)律基本一致[13-14]。另外，王文星等[20]發(fā)現(xiàn)瑞香狼毒(Stellerachamaejasme)懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)以及黃酮的積累隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加，基本符合“S”型。丹參(Salviamiltiorrhiza)、黃岑(Scutellariabaicalensis)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)量曲線亦是如此，呈“S”形曲線變化[21-22]，符合Logistic模型變化規(guī)律。

MeJA對(duì)植物細(xì)胞有多方面的功能。它可激活植物細(xì)胞體內(nèi)防御酶的活性[23-27]，促進(jìn)細(xì)胞的分裂和增殖，調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育[17-18]。王保軍等[28]和Sirvent等[29]向貫葉連翹(Hypericumperforatum)懸浮細(xì)胞中添加100 μmol·L-1MeJA后，其生長(zhǎng)量是對(duì)照的1.3倍，較低和較高濃度的MeJA對(duì)貫葉連翹生物量的影響不明顯。說明只有適量濃度的MeJA才會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)量有促進(jìn)作用。這與本研究的結(jié)果規(guī)律是部分相似的，不同的是在本研究中，100 μmol·L-1以上的MeJA對(duì)筋骨草細(xì)胞的生物量起抑制作用。在徐曲毅等[30]對(duì)綠豆(Vignaradiate)下胚軸生長(zhǎng)的研究中，10-6～10-4mol·L-1以上的MeJA抑制綠豆下胚軸生長(zhǎng)，這與本研究結(jié)果的表現(xiàn)是一致的。張進(jìn)杰等[31]發(fā)現(xiàn)高濃度MeJA會(huì)抑制黃芩細(xì)胞的生長(zhǎng)，而過早加入誘導(dǎo)物，細(xì)胞生長(zhǎng)也會(huì)受到抑制[32]。這一觀點(diǎn)與本研究結(jié)果一致，說明細(xì)胞的抑制作用受誘導(dǎo)物添加時(shí)期、濃度等因素的影響。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)MeJA可縮短匍枝筋骨草懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)周期，加速其成熟、衰老。東方百合種球(Liliumoriental)經(jīng)過1.0和10.0 mg·L-1MeJA處理后，可導(dǎo)致始花期顯著提前。而在東方百合生長(zhǎng)的現(xiàn)蕾期噴施1.0 mg·L-1MeJA可使單株花期和群體花期分別延長(zhǎng)2.09和3.25 d[33]。在本研究中，細(xì)胞快速生長(zhǎng)的初始期(第4天)添加50 μmol·L-1MeJA后筋骨草細(xì)胞鮮重持續(xù)增加，在添加后第7天達(dá)到最高值35.10 g，而在細(xì)胞快速生長(zhǎng)的高峰期(第10天)添加50 μmol·L-1MeJA后第1天細(xì)胞生長(zhǎng)就受到抑制，逐漸衰老死亡。說明不同的時(shí)期添加MeJA可調(diào)控植物的生長(zhǎng)[34-35]，本研究結(jié)果與此基本一致。

MeJA作為細(xì)胞間傳導(dǎo)的信號(hào)分子，可刺激植物啟動(dòng)防御體系，從而增加多種次生代謝物質(zhì)、揮發(fā)物的產(chǎn)量[36-38]。謝陽(yáng)姣等[39]發(fā)現(xiàn)苦玄參(Picriafelterrae)經(jīng)過 0.05 mmol·L-1的MeJA處理后，對(duì)代謝產(chǎn)物苦玄參苷 IA 和苦玄參苷 IB 的積累均表現(xiàn)為促進(jìn)作用，這與Aftab等[40]的MeJA可提高植物中青蒿素產(chǎn)量的觀點(diǎn)相似。苗曉燕等[41]發(fā)現(xiàn)當(dāng)MeJA濃度達(dá)400 μmol·L-1時(shí)，珊瑚菜(Glehniabolittoralis)的干燥根中補(bǔ)骨脂素和異歐前胡素含量可達(dá)到最大值，分別為CK的6.09和5.53倍。 這說明MeJA可以刺激多種次生代謝產(chǎn)物的大量產(chǎn)生。朱宏濤等[42]發(fā)現(xiàn)，三七(Panaxnotoginseng)組培苗中總苷含量隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)總體呈先升后降趨勢(shì)，MeJA濃度不同，總苷最高含量出現(xiàn)的時(shí)間也不一致，低濃度出現(xiàn)時(shí)間晚，高濃度出現(xiàn)時(shí)間早。這與本研究的結(jié)果基本相似。在本研究中，代謝產(chǎn)物β-EC積累量也呈現(xiàn)先升后降趨勢(shì)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，添加高濃度MeJA的細(xì)胞最先達(dá)到積累高峰，之后快速衰老死亡。蔡靜等[43]發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)周期第10天(指數(shù)生長(zhǎng)中期)加入100 μmol·L-1MeJA對(duì)明黨參(Changiumsmyrnioides)懸浮細(xì)胞作用效果最明顯，而最適收獲時(shí)間為處理4 d后，此時(shí)懸浮細(xì)胞中佛手酚的產(chǎn)量為未誘導(dǎo)細(xì)胞的73.6倍。在本研究也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果。同時(shí)，王和勇等[44]發(fā)現(xiàn)不同植物的代謝產(chǎn)物對(duì)誘導(dǎo)子的敏感程度不同，因此不同代謝產(chǎn)物的積累與合成還需進(jìn)一步研究探討。

本研究表明，筋骨草細(xì)胞的生長(zhǎng)、β-EC積累動(dòng)態(tài)曲線呈“S”型，符合Logistic規(guī)律。其中4～10 d是細(xì)胞生長(zhǎng)、β-EC合成的關(guān)鍵時(shí)期。此期細(xì)胞鮮重最高為32.12 g，干物質(zhì)積累達(dá)0.58 g，細(xì)胞中β-EC達(dá)到0.25 mg·g-1。在生長(zhǎng)周期內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)和β-EC的合成幾乎同步，表明筋骨草細(xì)胞在生長(zhǎng)過程中不斷積累β-EC類物質(zhì)，細(xì)胞生長(zhǎng)的速度與β-EC的合成密切相關(guān)。在筋骨草細(xì)胞的不同生長(zhǎng)時(shí)期添加MeJA對(duì)細(xì)胞鮮重、β-EC的積累量影響有所不同，而β-EC總含量與β-EC的積累量規(guī)律相似，同時(shí)，三者還與添加濃度、處理時(shí)間等因素相關(guān)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞生長(zhǎng)的初始期添加MeJA后對(duì)細(xì)胞影響最小，表明在細(xì)胞生長(zhǎng)的初期可能對(duì)MeJA類物質(zhì)并不敏感，雖可刺激一定量的β-EC產(chǎn)生，但存留時(shí)間較短。在此時(shí)添加MeJA，細(xì)胞中β-EC的含量和培養(yǎng)體系中所有細(xì)胞中β-EC總量的最大值均出現(xiàn)在添加100 μmol·L-1MeJA后的第3天，分別為2.7766 mg·g-1和0.7868 mg。而在細(xì)胞生長(zhǎng)的中期(第7天)添加100 μmol·L-1MeJA后的第7天，細(xì)胞中β-EC含量和所有細(xì)胞中β-EC總量的最高值均出現(xiàn)在添加后的第7天，分別達(dá)到3.5315 mg·g-1和1.2124 mg，此時(shí)積累量達(dá)到了本研究所有處理組中β-EC總量的最高值，是同期CK的14.44倍。在此期，添加更高濃度MeJA后，也可以在短時(shí)間內(nèi)刺激懸浮細(xì)胞產(chǎn)生大量β-EC。如：在第7天添加150 μmol·L-1MeJA處理后1 d，細(xì)胞中β-EC含量可達(dá)1.4986 mg·g-1，培養(yǎng)體系中所有細(xì)胞的β-EC總量達(dá)0.5244 mg。在細(xì)胞生長(zhǎng)的后期添加MeJA主要表現(xiàn)為抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，促使生長(zhǎng)周期縮短，加速細(xì)胞衰老，只有很低劑量的MeJA能在添加后的短時(shí)間內(nèi)促進(jìn)一定量的β-EC產(chǎn)生。如：在此期添加10 μmol·L-1MeJA后的第3天，細(xì)胞中的β-EC含量達(dá)1.4136 mg·g-1，培養(yǎng)體系中所有細(xì)胞中β-EC總量達(dá)0.5889 mg。