南太湖地區(qū)一典型青蝦養(yǎng)殖池塘中微囊藻毒素 濃度與環(huán)境因子間的相關性

張榮飛，鄧澤融，吳陳濤，金敏敏，胡曉斌

(湖州師范學院生命科學學院，浙江湖州 313000)

池塘是我國淡水養(yǎng)殖的主要水體。長三角地區(qū)是我國主要的淡水養(yǎng)殖區(qū)，遍布著大量的淡水養(yǎng)殖池塘。養(yǎng)殖水體必須施肥以維持一定種類和數(shù)量的有益藻類、原生動物、微生物等，俗稱肥水，肥水會導致水體富營養(yǎng)化。另外，不當養(yǎng)殖也會加劇水體富營養(yǎng)化。主要原因：一方面，大量投喂外源性飼料導致的大量殘餌和水生動物排泄物在水體中腐爛，使水中的溶解氧降低，氨氮上升，使養(yǎng)殖水體水質(zhì)惡化、病原滋生；另一方面，養(yǎng)殖排出的水很少經(jīng)過安全處理再排放，加劇了周圍水域的富營養(yǎng)化程度，使公共水域被污染，藍藻大量繁殖，導致藍藻水華和藻毒素污染[1-2]。目前的養(yǎng)殖模式大大超過環(huán)境的容量和自凈能力[3]。

微囊藻毒素(MCs)是一類結構上有聯(lián)系的單環(huán)七肽化合物，有超過70種異構體。在我國太湖地區(qū)水體中存在最普遍、含量相對較多且毒性較大的兩種MC異構體為MC-LR、MC-RR(L和R分別代表亮氨酸、精氨酸)[4]。MCs在有毒藍藻死亡裂解時被大量釋放出來。

Magalhaes等[5]和Mohamed等[6]的研究結果均認為，MCs在魚體內(nèi)的積累會對攝入人群造成健康隱患[7]。

青蝦(Macrobrachiumnipponense)是我國產(chǎn)量最大的淡水蝦，其肉質(zhì)鮮嫩，營養(yǎng)豐富。近些年來，為提高養(yǎng)殖產(chǎn)量，養(yǎng)殖戶大量使用人工飼料，導致水體中藍藻大量繁殖，藻毒素增加，嚴重影響了養(yǎng)殖產(chǎn)品的質(zhì)量[7-8]。因此，有必要了解MCs在養(yǎng)殖水體中的分布及其與養(yǎng)殖水環(huán)境因子的相互關系。本研究選取南太湖地區(qū)一典型的淡水青蝦養(yǎng)殖池塘作為研究對象，對水體中MC-LR、MC-RR 及主要環(huán)境因子進行了監(jiān)測，研究了MCs在養(yǎng)殖水體中的時間分布特征及影響因素，為淡水養(yǎng)殖水體的MCs控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 養(yǎng)殖池塘基本情況

選取的淡水青蝦養(yǎng)殖池塘位于浙江省湖州市南潯區(qū)，近似正方形，面積4600 m2，水深在1.2～1.4 m左右，人工池塘。蝦塘在8月份干塘清淤，進行曝曬。在蝦苗放養(yǎng)前7～10 d，用生石灰干法清塘。注水后施經(jīng)發(fā)酵腐熟的有機肥，以培養(yǎng)蝦苗的開口餌料。施肥后進行水生植物栽培，品種有喜旱蓮子草(水花生)和苦草輪葉黑藻。浮面水生植物栽種面積占蝦塘面積的10%～20%，在離塘埂1 m的淺水處，沿塘四周栽培，寬1 m左右。沉性水生植物栽種離塘埂2 m以上。飼料以投喂青蝦顆粒飼料為主，并適當投喂小雜魚、螺螄、蚌肉等動物性飼料。飼料無發(fā)霉腐敗變質(zhì)、無污染。蝦塘中配備增氧機，蝦塘配備2臺功率1.2 kW的增氧機。該蝦塘初始放養(yǎng)青蝦苗密度為30 000尾/kW，初始放養(yǎng)重量約為1.25 g/尾。飼料系數(shù)在1.36。

1.2 樣品采集

將養(yǎng)殖池塘分為近似相等的四個區(qū)塊，在每個區(qū)塊中間位置進行取樣。蝦塘在8月份注水和調(diào)水， 9月份投放蝦苗，12月份開始捕撈上市。因此，采樣時間為2015年8—12月，上午11:00左右，每周采樣一次，使用有機玻璃采水器，采集水面下0.3 m處的水樣，將采集水樣混勻后儲存。氣溫和水溫在采樣時直接測定，總磷(TP)、總氮(TN)、氨氮(NH3-N)、pH值等指標也在現(xiàn)場測定，其他指標在水樣送回實驗室后，根據(jù)不同監(jiān)測指標的具體要求保存樣品，待測。

1.3 水質(zhì)指標的測定方法

1.3.1 TP 、 TN、NH3-N等常規(guī)指標的分析測定

采用HACH公司的DR2800的便攜式水質(zhì)分析儀。TN采用過硫酸鉀氧化顯色分光光度法，TP采用過硫酸鉀-鉬酸鹽-抗壞血酸顯色光度法，NH3-N采用水楊酸顯色光度法；葉綠素(Chl-a)含量采用0.45 μm濾膜過濾水樣后丙酮提取，用分光光度法測定[9]。用Lugol試劑固定水樣，然后沉淀、濃縮，用高倍顯微鏡計數(shù)得到藍藻密度[10]。

1.3.2 MCs的分析測定

分別用10 mL 甲醇和10 mL 純水以 5 mL/min 的流速流過Sep-pak SPE小柱，以活化小柱；量取1 000 mL 經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾的水樣，連接SPE固相萃取裝置將水樣通過活化過的SPE小柱，進行富集，流速為4 mL/min；富集完畢，用10 mL 5% 的甲醇水溶液淋洗小柱，流速同上；用氮氣吹干SPE小柱 10 min；用5 mL 純甲醇洗脫兩次；用氮吹儀將洗脫液濃縮至0.5 mL 以下，用甲醇定容至0.5 mL 并轉移到棕色的色譜進樣瓶內(nèi)，待上機分析。

MCs 檢測采用美國AB Sciex Instuments公司的API QTRAP@ 4000 LC-MS/MS液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，配有三重四級桿質(zhì)量分析器和電噴霧(ESI)離子源。HPLC流動相：A為甲醇-乙腈(1+1)溶液(體積分數(shù)，下同)；B為0.1%甲酸水溶液；流量為0.2 mL/min；進樣量為10 μL。選擇正離子監(jiān)測模式(ESI+)選擇反應監(jiān)測(MRM)；毛細管電壓3.0 kV；測定MC-LR的監(jiān)測離子為：母離子的m/z 995.7，定性離子的m/z 553.2，定量離子的m/z 135.0。測定MC-RR的監(jiān)測離子為：母離子的m/z 520.0，定性離子的m/z 440.2，定量離子的m/z 135.0。

水質(zhì)分析試劑為購自美國HACH公司的專用試劑。MCs標準樣品購自中國國家標準物質(zhì)研究中心(純度>95%)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和作圖方法

用SPSS 17.0 對水質(zhì)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，用Origin 9.0作圖。

2 結果與分析

2.1 蝦塘水質(zhì)結果

從表1可看出，TN含量為0.2～5.9 mg/L，TP含量為0.47～1.99 mg/L，水體處于嚴重的富營養(yǎng)化狀態(tài)。

表1 2015年8—12月淡水青蝦養(yǎng)殖池塘水質(zhì)總體情況

2.2 池塘水體中MCs的濃度變化

監(jiān)測結果顯示，整個監(jiān)測期間都檢測到了MC-LR和MC-RR，MC-LR的最高濃度達到了102.3 mg/L，MC-RR的最高值為32.6 mg/L。MC-LR的濃度要高于相應時段的MC-RR，特別是在11月中旬，MC-LR的濃度遠遠高于MC-RR的濃度(圖1)。監(jiān)測數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析表明，MC-LR 和MC-RR的濃度隨時間變化呈顯著性正相關(P<0.05，r=0.440)。

圖1 蝦塘水體藻毒素的濃度變化

2.4 池塘水體中NH3-N、TN和水溫的關系

從圖2和圖3可以看出，NH3-N和TN在檢測期間波動上升，而水溫總體波動下降。統(tǒng)計結果也顯示，NH3-N與水溫呈顯著性負相關(P<0.01，r=-0.824)，TN與水溫呈顯著性負相關(P<0.01，r=-0.794)。NH3-N含量在8月初蝦塘剛蓄水時，隨著蓄水放養(yǎng)青蝦時間的增加一直波動上升，至12月上旬達到最高值1.6 mg/L，并在12月份維持在1.2 mg/L。TN含量也從蓄水初期的0.0 mg/L左右波動上升，10月中下旬 達最高值5.6 mg/L，在隨后的監(jiān)測時間段內(nèi)保持在高位波動。水溫隨著季節(jié)的變化不斷下降，從八月初的37.6 ℃，下降至12月底的7.6 ℃。

圖2 蝦塘水體氨氮濃度和水溫的變化

圖3 蝦塘水體總氮濃度和水溫的變化

2.5 池塘水體中MCs和TN、TP的關系

對數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析表明：TN與MC-LR呈顯著性正相關(P<0.05，r=0.436)；TP與MC-LR也呈顯著性正相關(P<0.05，r=0.500)。從圖4、圖5也可看出體TN、TP分別與MC-LR的波動趨勢在整體上呈現(xiàn)出一定程度上的一致性。TP在整個檢測期間波動也非常明顯。從8月份蝦塘蓄水初期的0.47 mg/L上升至11月初的1.99 mg/L，然后又下降至12月份的0.6 mg/L左右。TP與MC-RR在整個監(jiān)測周期內(nèi)呈極顯著正相關(P<0.01，r=0.757)(圖6)。

圖4 蝦塘水體MC-LR和總氮濃度的變化

圖5 蝦塘水體MC-LR和T總磷濃度的變化

圖6 蝦塘水體MC-RR和總磷濃度的變化

2.6 池塘水體中Chl-a與TP、MCs的關系

對監(jiān)測結果的統(tǒng)計分析結果表明：池塘水體中Chl-a與TP呈極顯著正相關(P<0.01，r=0.692) (圖7)，Chl-a與MC-RR的濃度變化也表現(xiàn)出顯著的正相關(P<0.05，r=0.454)(圖8)，Chl-a與MC-LR的濃度變化也表現(xiàn)出一定的正相關關系，但不顯著(P=0.062，r=0.404)(圖9)。Chl-a 的含量在12.2～513.3 μg/L之間波動巨大。在8月初剛蓄水時，水中Chl-a含量較低，然后不斷上升，至9月上旬達到一個高峰，超過300 μg/L，然后是一個明顯的下降過程，至10月上中旬下降至蓄水以來的最低濃度，接著在10月下旬迅速上升至整個檢測期間的最高濃度，在11月中旬再次顯著下降，至12月底一直維持在一個較低的濃度水平。

圖7 蝦塘水體Chl-a和TP濃度的變化

圖8 蝦塘水體葉綠素a和MC-RR濃度的變化

圖9 蝦塘水體葉綠素a和MC-LR濃度的變化

3 討論

3.1 MCs濃度的變化

水質(zhì)監(jiān)測數(shù)據(jù)(表1)顯示水體處于嚴重的富營養(yǎng)化狀態(tài)。一般認為藍藻生長繁殖的最適宜溫度在 25～30 ℃[11]，而從8月底至11月初，池塘水溫主要為20～30 ℃，對藍藻的生長繁殖較為有利。所以，在此期間，藍藻繁殖速度較快，產(chǎn)生了明顯的水華和MCs污染。但是，在9—11月，水體中游離的MCs濃度只是維持在10～50 mg/L，并未達到整個監(jiān)測期間內(nèi)的最高水平。其主要原因在于MCs 是一類受產(chǎn)毒基因調(diào)控，在胞內(nèi)代謝產(chǎn)生的毒素，MCs主要集中在細胞的類囊體核區(qū)，只有當藻細胞死亡、破裂時才會釋放到水體中[12]。當藍藻處于旺盛繁殖階段的時候，只有小部分藍藻開始死亡[13-14]，MCs沒有大量釋放到水中。另一方面，在此期間，富營養(yǎng)化的水體和相對較高的溫度也有利于其它微生物的繁殖，其中包括可降解MCs的微生物[15-16]。同時，在自然光照條件下，水體中的光敏性物質(zhì)會產(chǎn)生氧化性很強的活性氧自由基，被自由基氧化也是MCs分子消除的一個重要途徑[17]。

在11月中下旬，游離MCs的濃度相比之前大幅上升，達到了整個監(jiān)測期間的最高值。主要原因是水溫下降至10 ℃以下，藍藻細胞開始大量死亡，大量的MCs被釋放到水體中，MCs的生物降解速度顯著下降，同時，光照強度也顯著減弱。進入12月份以后，由于水溫很低，藍藻繁殖受到極大抑制，MCs濃度顯著下降。

3.2 營養(yǎng)鹽濃度變化

從統(tǒng)計結果看，溫度對TN和NH3-N有顯著性影響。在監(jiān)測期間TN含量和NH3-N含量保持上升趨勢。由于季節(jié)變化，水溫不斷下降，使得NH3-N和TN含量與水溫形成了一種顯著的負相關關系。由于淡水青蝦養(yǎng)殖池塘9月上旬才開始投放蝦苗，所以在8—9月期間，水體TN含量不是很高，隨著養(yǎng)殖時間的不斷延長，投餌量和排泄物的增加，養(yǎng)殖水體TN含量顯示出明顯上升的趨勢，從0.2 mg/L增加到最高5.9 mg/L，飼料投喂可能是TN保持較高濃度最重要的原因。另一方面，水溫也會影響浮游植物的種類、數(shù)量和活動性，從而間接影響到水中營養(yǎng)物質(zhì)的含量[18-19]。有研究表明，水溫對沉積物中氮的釋放速率有顯著影響，溫度上升有利于沉積物種營養(yǎng)元素的釋放[20-21]。有些水體微生物傾向于在相對低溫(5 ℃)的環(huán)境中展現(xiàn)出更高的降解有機氮的活性。因此，隨著水溫的降低，沉積物中的有機氮也會被轉化為無機氮釋放到水體中[21]。這可能也是NH3-N含量在12月份保持穩(wěn)定的一個重要原因。

從8月份蓄水初期至11月，TP含量總體上升明顯。其主要原因可能是隨著養(yǎng)殖時間的增加，投餌量不斷增加，同時，殘餌量和排泄物的累積，使TP含量表現(xiàn)出明顯上升的趨勢。另一方面，水溫對TP的含量也有一定的影響，一般來講，大部分的無機磷以難溶鹽形式存在于水體中，水溫較高時，磷鹽的溶解度增加，同時微生物活動能力強，增加了水體沉積物中有機質(zhì)的礦化和分解，導致了沉積物中氧化還原電位降低，鐵離子被還原，使磷從磷酸鐵沉淀中釋放出來。溫度上升也會使各種水生動物活動性增強，增加水體的攪動性，導致沉積物顆粒處于懸浮態(tài)，也會導致TP增加[22]。到了12月份，水溫明顯下降，水生動物攝食量下降，投餌量也會有所降低，同時，從沉積物釋放至水柱的TP也會隨之下降。

氮不但是藻類生長的必需營養(yǎng)元素，而且也是合成MCs分子的必需元素，水體氮元素含量缺乏會抑制藻類的生長繁殖[23]。水體中TN從蓄水初期的0.2 mg/L不斷增加至5.9 mg/L，均值為2.82 mg/L。水體中TN含量的增加會導致藍藻的生長繁殖加快，MCs的濃度隨之升高。另一方面，由于秋季水溫低于夏季，適宜的水溫又使藍藻迅速繁殖形成水華，水面形成一層含有藍藻的綠色膜，MCs的濃度也顯著增加，但統(tǒng)計結果表明MC-RR與TN無顯著相關性。

TP與MCs濃度變化表現(xiàn)出的顯著性正相關可能與二者的季節(jié)變動存在一致性有關。關于TP 對MCs 的影響至今也沒有一致的研究結論。Utkilen 等[24]認為磷對MCs的產(chǎn)生沒有影響，而Sivonen[11]認為當磷的含量在0.1～0.4 mg/L范圍內(nèi)時，MCs 濃度與磷含量呈正相關，當磷含量進一步上升時，其與MCs 無顯著相關性。也有研究表明微囊藻的產(chǎn)毒能力隨著磷濃度的減小而增加[25-26]。

3.3 Chl-a與藍藻密度的變化

一般認為，盡管不同的浮游藻類在其生長過程中對營養(yǎng)鹽的需求不完全相同，在多數(shù)水體中，浮游藻類的生物量仍會與水體中的營養(yǎng)鹽濃度變化基本一致[27]。藻類的生物量與Chl-a含量有正相關關系。有研究者認為，水體中營養(yǎng)鹽增加會導致其中藻類生物量的顯著增加[28]，但也有研究報道，湖泊中水體藻類的生物量與水體中的營養(yǎng)鹽濃度之間并不具有顯著的相關性[29]。這表明營養(yǎng)鹽對藻類生物量的影響不是一個單因素簡單作用關系。

由于蝦塘是人工投喂的養(yǎng)殖池塘，為水體提供了較為豐富的N、P營養(yǎng)，故N、P含量并不是藻類生長的限制因子。因此，Chl-a含量的變化可能不是由于N、P營養(yǎng)鹽的濃度波動引起。監(jiān)測期間陰雨天較多，但在10月中下旬，連續(xù)穩(wěn)定的晴天，使得池塘藻類快速繁殖，Chl-a水平迅速上升，形成了一個峰值。

統(tǒng)計結果顯示出Chl-a濃度與MCs濃度變化之間呈正相關，而Chl-a與藍藻密度并無顯著性相關。在藍藻爆發(fā)季節(jié)，Chl-a濃度和藍藻密度通常具有顯著性正相關[30]。這表明，Chl-a最大峰值并非由于藍藻爆發(fā)導致。由于MCs的峰值通常在藍藻細胞大量死亡之后才出現(xiàn)，因此，此次統(tǒng)計上的Chl-a與MCs濃度變化之間的正相關關系并不意味著此二者之間有必然的一致性。