雜交水稻種子純度DNA指紋鑒定與田間鑒定結果的比較

張雯 丁顯萍 張萍

摘 要：選取水稻品種（新優(yōu)188）的6個批次，即14-2、14-6，15-1、15-5，16-7、16-8，分別進行DNA指紋鑒定及田間鑒定，將2種鑒定結果加以比較，結果表明，雜交水稻種子純度DNA指紋鑒定結果均低于田間鑒定的結果。

關鍵詞：水稻；種子；純度；小區(qū)種植鑒定

中圖分類號 S511 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）13-0011-02

品種純度是指品種個體與個體之間在特征特性方面典型一致的程度，用本品種的種子數(shù)（或株、穗數(shù)）占供檢驗本作物種子數(shù)（株、穗數(shù)）的百分率表示[1]。品種純度的高低對作物的產(chǎn)量和品質(zhì)都有較大影響，在種子生產(chǎn)、加工、貯藏及經(jīng)營貿(mào)易中具有重要意義。DNA指紋方法是通過化學方法使水稻DNA從樣品中分離出來，棄除樣品中的蛋白質(zhì)、脂肪、多糖及其它次生代謝物，以及樣品中加入的三氯甲烷、異戊醇、乙醇等試劑，獲得純化的DNA，作為PCR反應的模板；對模板進行擴增，得到的產(chǎn)物在電泳過程中的電荷效應作用下進行分離，通過顯色顯示水稻DNA譜帶類型。SSR標記由于具有數(shù)量豐富、多態(tài)性高、遺傳上呈共顯性、實驗操作簡單、結果穩(wěn)定可靠、引物序列易交流等優(yōu)點，已成為雜交水稻種子純度鑒定的一種理想分子標記[2]。由于不同水稻品種遺傳組成不同，基因組DNA中簡單重復序列的重復次數(shù)有差異。這種差異可通過PCR擴增及電泳方法進行檢測，從而能夠區(qū)分不同品種。田間鑒定是指選擇土壤均勻、肥力一致的田塊，配套適宜的栽培管理措施，對收獲的種子進行小區(qū)種植鑒定，觀察品種的特征特性，統(tǒng)計并計算結果。本研究將DNA指紋鑒定與田間種植鑒定的結果加以比較，以找出2種鑒定結果的差異，使DNA指紋鑒定的結果更有參考性。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗材料由安徽荃銀高科種業(yè)股份有限公司提供，分別為2014、2015和2016年入庫的新優(yōu)188種子，每年隨機選取2個批次，一共6批。

1.2 試驗設計與方法 把選出的6批新優(yōu)188的種子編號為：14-2、14-6，15-1、15-5，16-7、16-8，用DNA指紋方法檢驗各批的純度，記錄檢測結果。同時在田間進行小區(qū)種植鑒定，將田間的雜株類型記錄下來，計算純度結果，與室內(nèi)檢測的結果進行比較。

1.2.1 DNA指紋鑒定 （1）將選出的6批種子，先進行發(fā)芽[3]，7d后選取合適的幼苗進行引物篩選，選用其中2對引物RM297和RM190繼續(xù)純度檢測試驗；（2）把每一批種子隨機取出400棵幼苗，研磨，加入提取液，水浴，再加入三氯甲烷、異戊醇、乙醇等藥劑，提取DNA；（3）制作反應體系，根據(jù)NY/T1433-2014中的反應程序進行PCR，94℃下預變性2min，進行30次擴增反應循環(huán)（94℃下變性45S，55℃下退火45S，72℃下延伸1min），然后72℃下延伸8min，最后10℃恒溫冷卻；（4）將PCR產(chǎn)物用非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳及染色檢測，觀察膠片并記錄結果。

1.2.2 田間種植鑒定 （1）試驗地選擇：考察田地前作狀況，同時選擇肥力一致且良好的田塊；（2）小區(qū)設計：在同一田塊將6個樣品相鄰種植，以突出它們之間的細微差異，每個樣品種植400株；（3）小區(qū)管理：在整個生長階段檢查小區(qū)的植株狀況，觀察品種的特征特性，注意除草劑使用，避免影響植株的特征特性；（4）鑒定和記錄：在整個生長季節(jié)隨時觀察，重點在花期和成熟期，根據(jù)品種特性鑒定并記錄下雜株類型和數(shù)量[1]。

2 結果與分析

2.1 DNA指紋鑒定結果 從表1可知各批種子DNA指紋鑒定的純度結果，每批鑒定株數(shù)均為400株，根據(jù)公式：純度（%）=（株數(shù)-R-A/B/S-其他雜株）/株數(shù)×100計算結果。14-2純度為96.3，14-6純度為97.5，15-1純度為96.8，15-5純度為96.5，16-7純度為97.8，16-8純度為97.0。

2.2 田間鑒定結果 由表2可知，田間鑒定各批株數(shù)為400株，通過對整個生育期的觀察，記錄各批種子的雜株類型，純度結果分別為98.8、99.0、99.0、98.5、99.8、99.3。

2.3 DNA指紋鑒定與田間鑒定結果的比較 將室內(nèi)檢測的純度結果與田間鑒定的結果加以比較，可以看出每批樣品的田間鑒定純度結果要高于室內(nèi)的結果，且都是高出1.5%以上，詳見表3。

3 討論與結論

比較DNA指紋鑒定與田間鑒定的結果，發(fā)現(xiàn)室內(nèi)的結果均低于田間。田間鑒定主要在水稻生長過程中觀察其品種的特征特性，而DNA指紋鑒定是在室內(nèi)提取樣品的DNA，通過擴增和電泳，得出結果。兩種方法原理不同，結果有差異，目前國家標準以田間鑒定結果為準。田間種植鑒定是當前乃至今后一定時期內(nèi)種子質(zhì)量監(jiān)管的主要任務和各種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗機構的重要工作[4]。但對于企業(yè)來說，種子入庫大約在當年的8月中下旬到12月底前后，而正季的田間鑒定是在次年的4月中旬播種，待整個生育期結束后才能看到純度結果。種子入庫后到播種之前就要包裝銷售，為了對市場負責，給包裝銷售提供可靠的依據(jù)，就需要室內(nèi)先進行測純，了解種子的質(zhì)量情況。許多研究表明，利用DNA指紋鑒定技術鑒定品種真實性和純度的方法是可行的，檢測結果是準確的[5]。雜交稻大田用種的純度標準必須高于96.0%，室內(nèi)測純的結果暫沒有標準可依，但根據(jù)近幾年的室內(nèi)檢測結果和田間鑒定的結果比較，發(fā)現(xiàn)基本都是室內(nèi)測純結果偏低，若室內(nèi)測純的結果也以大田標準來規(guī)定，會有部分合格種子暫時不能包裝，如果室內(nèi)檢測結果的趨勢與田間一致，找出某個品種的室內(nèi)檢測結果與田間鑒定結果的差異點數(shù)，不僅可提前為種子出庫質(zhì)量做參考，還能更準確的掌握該品種的實際質(zhì)量水平。將入庫的種子及時包裝銷售到市場，為來年的銷售工作做好質(zhì)量保障。品種真實性和純度是種子質(zhì)量的重要指標，對作物產(chǎn)量及品質(zhì)具有直接的影響。因品種真實性和純度問題造成大幅減產(chǎn)的事件時有發(fā)生，嚴重影響了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。因此，加快分子檢測技術的研發(fā)和應用，是當前種子質(zhì)量管理工作的一項重要而迫切的任務[5]。對企業(yè)而言，室內(nèi)純度檢測的準確性更加重要，種子在進入市場之前，質(zhì)量需要嚴格把關，純度是種子質(zhì)量指標中尤為重要的一項，純度不合格會嚴重影響來年的收成和品質(zhì)。DNA指紋鑒定利用SSR分子標記技術進行純度鑒定這種鑒定方法適用于雜交水稻種子純度的快速鑒定。關鍵是要研究掌握室內(nèi)檢測與田間鑒定結果的關系，更清楚地了解品種特性，為市場銷售減少風險，嚴格把好質(zhì)量關。

參考文獻

[1]李成荃，黃義德，楊惠成，等.安徽稻作學[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2007：362-366.

[2]李召華，朱克永，陳祖武，等.SSR分子標記技術在雜交水稻種子純度鑒定中的應用[J].雜交水稻，2006（04）：11-14.

[3]GB/T 3543.1-1995 農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程[S].

[4]曹洪，楊俊.水稻小區(qū)種植鑒定技術與要求[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2014（08）：69+72.

[5]周會.利用分子生物學技術鑒定農(nóng)作物品種真實性和純度[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學，2012.

（責編：張宏民）