薄層色譜一標(biāo)多測(cè)方法在腰痛片中的應(yīng)用

崔宇宏，王 玳

（山西省食品藥品檢驗(yàn)所，山西太原030001）

腰痛片具補(bǔ)腎活血、強(qiáng)筋止痛的功效，用于腎陽(yáng)不足、瘀血阻絡(luò)所致的腰痛及腰肌勞損，臨床主要用于治療急性腰損傷及腎虛、慢性腰肌勞損所致的腰痛。腰痛片收載于《中國(guó)藥典》2015年版一部，處方中有杜仲葉、鹽補(bǔ)骨脂、續(xù)斷、當(dāng)歸、炒白術(shù)、牛膝、肉桂、乳香、赤芍、狗脊、澤瀉、土鱉蟲等12味藥材，原標(biāo)準(zhǔn)鑒別項(xiàng)僅收載3個(gè)薄層鑒別［1］，分別鑒別續(xù)斷、當(dāng)歸、赤芍，方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且控制藥材數(shù)量較少，無(wú)法全面控制藥材的質(zhì)量。李瑞麗等［2］對(duì)腰痛片中當(dāng)歸、肉桂、赤芍進(jìn)行薄層鑒別，趙江紅等［3］對(duì)腰痛片中補(bǔ)骨脂、赤芍進(jìn)行薄層鑒別，但均為一塊薄層板鑒別一味藥材。為了達(dá)到快速、簡(jiǎn)便、省時(shí)省力的目的，從供試品溶液的制備、展開(kāi)系統(tǒng)及薄層板的選擇多個(gè)方面考慮，將原標(biāo)的鑒別合并，并增加了補(bǔ)骨脂、肉桂、乳香、杜仲葉的薄層鑒別。采用2塊薄層板，鑒別7味藥材，1個(gè)色譜系統(tǒng)同時(shí)鑒別當(dāng)歸、補(bǔ)骨脂、乳香、肉桂4味藥材，另一個(gè)色譜系統(tǒng)同時(shí)鑒別了續(xù)斷、杜仲葉、赤芍。實(shí)現(xiàn)了快速鑒別的目的，提高了效率、節(jié)約了成本。

1 試藥及試劑

對(duì)照藥材及對(duì)照品：當(dāng)歸（110719-200613）、乳香（0970-9602）、補(bǔ)骨脂（1056-9801）、續(xù)斷（1033-200003）、肉桂（121363-200401）、杜仲葉（1068-9901）、芍藥苷（121072-200806）、川續(xù)斷皂苷Ⅵ（111685-200401）、桂皮醛（110710-201016）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

樣品：腰痛片多個(gè)企業(yè)生產(chǎn)樣品

試劑：硅膠G、硅膠GF254高效預(yù)制板（青島海洋化工廠、merck板、煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所），其余均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)與結(jié)果

2.1 當(dāng)歸、補(bǔ)骨脂、肉桂、乳香的薄層鑒別

采用同一供試品溶液，以當(dāng)歸、補(bǔ)骨脂、肉桂、乳香對(duì)照藥材在同一塊薄層板上同時(shí)鑒別4味藥材。UV（365nm）下檢視鑒別當(dāng)歸、補(bǔ)骨脂，噴二硝基苯肼試液后鑒別肉桂、乳香。

2.1.1 供試品溶液的制備 取本品10片，除去包衣，研細(xì)，加二氯甲烷30 mL，冰水浴超聲處理30 min，濾過(guò)（濾渣備用），濾液揮干，加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為供試品溶液。

2.1.2 對(duì)照藥材及其對(duì)照品溶液的制備 取當(dāng)歸、補(bǔ)骨脂、乳香、肉桂對(duì)照藥材各0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。

2.1.3 陰性對(duì)照品溶液的制備 根據(jù)處方，分別取處方中各藥味（除當(dāng)歸、補(bǔ)骨脂、肉桂、乳香）1/100處方量，按供試品溶液的制備方法，分別制備缺當(dāng)歸、缺補(bǔ)骨脂、缺肉桂、缺乳香的對(duì)照溶液，即得。

2.1.4 薄層層析方法 吸取上述溶液各5～10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（7∶2）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視，供試品色譜中，在與當(dāng)歸、補(bǔ)骨脂對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點(diǎn)。噴以二硝基苯肼乙醇試液，日光下檢視。供試品色譜中，在與乳香、肉桂對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的主斑點(diǎn)。

2.1.5 薄層層析結(jié)果 專屬性：供試品色譜斑點(diǎn)清晰、陰性對(duì)照無(wú)干擾。重復(fù)性：對(duì)多企業(yè)、多批樣品進(jìn)行了薄層鑒別，重復(fù)性好。耐用性：使用merck預(yù)制板、青島海洋預(yù)制板及煙臺(tái)預(yù)制板不同品牌的預(yù)制板，在不同溫濕度條件下的薄層鑒別均符合要求。結(jié)論：專屬性、重復(fù)性、耐用性均符合要求（見(jiàn)圖 1、2）。

圖1 當(dāng)歸、補(bǔ)骨脂薄層鑒別（專屬性，UV365nm下檢視）

圖2 乳香、肉桂薄層鑒別（專屬性，噴二硝基苯肼試液）

2.2 續(xù)斷、杜仲葉、白芍的薄層鑒別

將處方中續(xù)斷、杜仲葉、白芍的薄層鑒別合并，以一塊薄層板、一種展開(kāi)系統(tǒng)，同時(shí)鑒別續(xù)斷、杜仲葉、赤芍三種藥材。

2.2.1 供試品溶液的制備 取當(dāng)歸、補(bǔ)骨脂等鑒別項(xiàng)下的備用濾渣，蒸干溶劑，加水飽和正丁醇30 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，加甲醇5 mL使溶解，置中性氧化鋁柱（100～200目）2 g，用甲醇50 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照藥材及其對(duì)照品溶液的制備 取杜仲葉、續(xù)斷對(duì)照藥材各1 g，加水適量煎煮30 min，濾過(guò)，濾液用水飽和正丁醇30 mL提取，提取液蒸干，加甲醇5 mL使溶解同法分別制成對(duì)照藥材溶液。再取芍藥苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品，分別加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照品溶液的制備 分別取處方中各味（除續(xù)斷、杜仲葉、赤芍）1/100處方量，分別制備缺續(xù)斷、杜仲葉、赤芍的對(duì)照溶液，按供試品溶液的制備方法制備，即得。

2.2.4 薄層層析方法 吸取上述溶液各5～10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-水（13∶6∶2）的下層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。噴以2%香草醛的10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視。供試品色譜中，在與杜仲葉、續(xù)斷對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色的主斑點(diǎn)；在與川續(xù)斷皂苷、芍藥苷對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2.1.5 薄層層析結(jié)果 ①專屬性：供試品色譜斑點(diǎn)清晰、陰性對(duì)照無(wú)干擾。②重復(fù)性：對(duì)多企業(yè)、多批樣品進(jìn)行了薄層鑒別，重復(fù)性好。③耐用性：使用青島海洋預(yù)制板、merck預(yù)制板不同品牌的預(yù)制板，在不同溫濕度條件下的薄層鑒別均符合要求。④結(jié)論：專屬性、重復(fù)性、耐用性均符合要求（見(jiàn)圖3）。

圖3 續(xù)斷、杜仲葉、赤芍的薄層鑒別（青島海洋板）

3 討 論

3.1 建立薄層色譜-標(biāo)多測(cè)的目的

控制中成藥中藥材的質(zhì)量，最常用的方法是薄層色譜鑒別方法。中國(guó)藥典中對(duì)于成藥中的多味藥材通常采用1個(gè)薄層色譜鑒別1味藥材，操作繁瑣，效率較低，造成了資源浪費(fèi)。故根據(jù)藥材所含成分的性質(zhì)，采用1個(gè)供試品溶液，1種薄層色譜條件鑒別成藥中多味藥材的方法，可以提高檢測(cè)速度，節(jié)約。

3.2 供試品溶液制備方法的確定

當(dāng)歸、補(bǔ)骨脂、乳香、肉桂主含脂溶性成分，且部分成分容易揮發(fā)，故選擇毒性相對(duì)小、沸點(diǎn)低、容易揮干的二氯甲烷作為提取溶劑，并選擇在冰水浴中超聲處理。

續(xù)斷、杜仲葉、赤芍含有皂苷或苷類成分，故將二氯甲烷提取后的濾渣加水飽和正丁醇超聲提取后，再過(guò)中性氧化鋁柱去除雜質(zhì)干擾，用甲醇洗脫，收集洗脫液，蒸干用甲醇溶解后作為鑒別續(xù)斷、杜仲葉、赤芍的供試品溶液。

3.3 展開(kāi)劑與顯色劑的選擇

脂溶性成分的展開(kāi)劑，先以藥典鑒別當(dāng)歸的展開(kāi)劑正己烷-乙酸乙酯（7∶1）展開(kāi)，結(jié)果補(bǔ)骨脂的斑點(diǎn)Rf值過(guò)低，故調(diào)整為正己烷-乙酸乙酯（7∶2）時(shí)，各味藥材的Rf值適中，斑點(diǎn)清晰。

水溶性成分的展開(kāi)劑，采用水溶性成分比較通用的展開(kāi)劑系統(tǒng)，二氯甲烷-甲醇-水，試用（13∶6∶2）、（13∶5∶2）、（13∶7∶2）下層液的不同比例，結(jié)果二氯甲烷-甲醇-水（13∶6∶2）下層液時(shí)，各味藥材的 Rf值適中。

在UV365 nm下能夠檢視當(dāng)歸及補(bǔ)骨脂，斑點(diǎn)清晰，且陰性無(wú)干擾。噴以二硝基苯肼乙醇試液后，乳香及肉桂顯橙色斑點(diǎn)。

針對(duì)杜仲葉、續(xù)斷、赤芍中苷類成分，曾使用10%硫酸乙醇、2%香草醛硫酸溶液、2%香草醛的10%硫酸乙醇溶液。結(jié)果使用2%香草醛的10%硫酸乙醇溶液時(shí)，各藥材斑點(diǎn)清晰，顯色效果最佳。

3.4 結(jié)果

建立了7味藥材快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了薄層鑒別的一測(cè)多評(píng)，并將方法應(yīng)用于不同企業(yè)生產(chǎn)的腰痛片中7味藥材的質(zhì)量考察。根據(jù)15個(gè)企業(yè)147批次樣品的檢測(cè)結(jié)果，企業(yè)間、企業(yè)內(nèi)批間斑點(diǎn)的大小強(qiáng)弱不同，反映企業(yè)藥材來(lái)源均不固定，難以保證產(chǎn)品質(zhì)量的均一性，其中當(dāng)歸、補(bǔ)骨脂、續(xù)斷、赤芍由于原標(biāo)準(zhǔn)有鑒別或含量測(cè)定，故斑點(diǎn)均能清晰可辨，但原標(biāo)無(wú)質(zhì)量控制方法的乳香、杜仲葉、肉桂的問(wèn)題較大，各企業(yè)間斑點(diǎn)強(qiáng)弱存在較大差異，從極弱、弱到清晰可辨。薄層鑒別結(jié)果反映，有的企業(yè)只注重標(biāo)準(zhǔn)有要求的項(xiàng)目，而忽略標(biāo)準(zhǔn)未控制的藥材的質(zhì)量。