大豆胞囊線蟲病4號(hào)生理小種抗性候選基因GmRSCN4-3克隆與功能初步鑒定

韓英鵬，孫秋霞，包冬芳，董海冉，張嬋娟，趙 雪，李文濱

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所，大豆生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部東北大豆生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

大豆是重要油料和糧食作物，也是世界植食性蛋白和油脂重要來源[1]。大豆胞囊線蟲病（Soybean cyst nematode，SCN）俗稱“火龍秧子”，是世界性大豆病害，影響大豆產(chǎn)量和品質(zhì)[1-2]。SCN一般可造成減產(chǎn)20%～30%，嚴(yán)重時(shí)可減產(chǎn)70%～80%，甚至造成絕產(chǎn)[3-5]。研究表明，成熟胞囊線蟲可在土壤中存活長(zhǎng)達(dá)9年[6]。國(guó)際上，SCN被劃分為多個(gè)不同生理小種，各生理小種分布區(qū)域及致病性不同，其中3號(hào)生理小種抗源較多，相關(guān)遺傳研究報(bào)道較多[7-9]。我國(guó)目前已發(fā)現(xiàn)8個(gè)生理小種，包括1號(hào)、3號(hào)、4號(hào)生理小種，其中4號(hào)小種侵染力最強(qiáng)[10-11]，主要分布在黃淮海和東北大豆主產(chǎn)地區(qū)，但4號(hào)生理小種相關(guān)遺傳研究較少。輪作倒茬、化學(xué)藥劑、生物防治、合理施肥和灌溉等農(nóng)藝措施對(duì)大豆胞囊線蟲有防治作用，選育和利用抗病品種是該病害最有效控制措施之一。

分子輔助育種具有周期短，準(zhǔn)確性高且可克服不良性狀連鎖優(yōu)點(diǎn)[12]，是培育抗性品種有效途徑之一。大豆胞囊線蟲抗性由多個(gè)基因控制[13]，克隆并驗(yàn)證抗病候選基因，設(shè)計(jì)其連鎖標(biāo)記用于分子輔助選擇，可提高大豆抗線蟲育種效率[14]。目前抗病基因（R-gene）在植物基因組中占比大，約占基因數(shù)1%～2%[15-17]，表達(dá)物蛋白質(zhì)具有保守結(jié)構(gòu)域特征，如C-端存在富亮氨酸重復(fù)區(qū)段（Leucine-rich，LRR），亮氨酸拉鏈（Leucinezipper，LZ），跨膜結(jié)構(gòu)域（Transmembrancedomain，TM）等[18-19]。Cook等研究表明，大豆胞囊線蟲病抗性由3個(gè)相互獨(dú)立隱性基因Rhg1、Rhg2、Rhg3[7-8,20]和一個(gè)顯性抗病基因Rhg4控制[9,21-22]。通過基因沉默發(fā)現(xiàn)rhg1-b位點(diǎn)附近的31 kb范圍內(nèi)編碼3個(gè)與抗病相關(guān)基因，這3個(gè)基因在抗病和感品種之間存在拷貝數(shù)變異[20]。rhg4位點(diǎn)位于LGA2（8號(hào)染色體）上，與控制有色種的i位點(diǎn)連鎖[23-24]，結(jié)構(gòu)上與rhg1相似[25]，通過編碼絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（Shmt）控制絲氨酸和甘氨酸互變對(duì)SCN產(chǎn)生抗性。此外，HsL-pro1也被證明具有抗線蟲作用[26-27]。

本研究以抗病種質(zhì)東農(nóng)L-10為試驗(yàn)材料，擬克隆抗病候選基因GmRSCN4-3全長(zhǎng)序列，并構(gòu)建植物表達(dá)載體pCambia3300-GmRSCN4-3，利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆快速轉(zhuǎn)化技術(shù)及酸性品紅染色法作功能初步鑒定，可為分子輔助育種提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)選用2017年種子，包括大豆胞囊線蟲病4號(hào)生理小種抗性品種東農(nóng)L-10，感病品種東農(nóng)50及遼豆15為受體材料，以上材料均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

大豆胞囊線蟲病4號(hào)生理小種采集自黑龍江省安達(dá)大豆連作地塊，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離、純化并保存。

1.2 方法

1.2.1 胞囊分離、繼代及計(jì)數(shù)

本研究采用淘洗過篩法從病土中分離胞囊，接種高感大豆品種遼豆15擴(kuò)大繁殖。35 d后，將分離獲得的胞囊機(jī)械法破碎，釋放卵粒26℃條件下孵化7 d，孵化出二齡幼蟲（J2）混制成2 000條·mL-1卵懸液，用于接種鑒定。

采用塑料缽柱法，在溫室中鑒定大豆胞囊線蟲4號(hào)生理小種抗性，復(fù)合植株裝在高溫滅菌后沙土（1∶1）中，以每株2 000條接種2齡時(shí)期幼蟲，24～26℃按照干濕交替補(bǔ)充水分培養(yǎng)15 d后，采用酸性品紅染色法統(tǒng)計(jì)根上雌性胞囊數(shù)。

1.2.2 大豆根部總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

將東農(nóng)L-10種植在蛭石中，培養(yǎng)條件為光照（28℃/16 h），黑暗（28℃/8 h），水分充足，15 d后取大豆根部，利用Invitrogen TrizoL?Reagent RNA提取試劑盒說明書操作，提取大豆根部總RNA，具體方法參考陳安樂研究[28]。

1.2.3 GmRSCN4-3生物信息學(xué)分析

利用 ProtParam tool（http://www.expasy.ch/toools/protparam.html）在線工具分析氨基酸序列理化性質(zhì)[5]。 應(yīng) 用 ProtScale（http://ca.expasy.org/tools/prots cale.html）工具中Hphob./Kyte&Doolittle算法計(jì)算氨基酸序列親水性與疏水性。

1.2.4 大豆GmRSCN4-3基因克隆與表達(dá)載體構(gòu)建

1.2.4.1 東農(nóng)L-10 cDNA第一條鏈合成

計(jì)算提取RNA濃度：OD260×0.04μg·μL-1×100（稀釋倍數(shù)），μg·μL-1。按TOYOBOReverTra Ace qPCRRTMaster Mix with gDNA Remover試劑盒說明操作，cDNA第一條鏈合成體系（10μL）：在小離心管中配置以下混合液：4×DNMaster Mix（已添加gDNA Remover）2 μL； RNA template 0.5 pg～0.5 μg；Nuclease-free Water至總體積 8μL。37℃條件下金屬浴溫育5 min后，迅速至于碎冰上；瞬時(shí)針離心混合物，使其沉積在小離心管底部；冰上加樣操作，在上述離心管中配置以下反應(yīng)液：上述模板 RNA 8 μL；5×RT Master Mix II 2μL。37℃，15 min；50℃，5 min；98℃，5 min；4℃，結(jié)束程序，放于-20℃保存。

1.2.4.2 PCR引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Phytozome v12.1中的GmRSCN4-3基因序列信息，所用載體pCAMBIA3300酶切位點(diǎn)信息，選取XbaⅠ作為酶切位點(diǎn)，采用Primer Premier 5.0軟件作目的基因引物設(shè)計(jì)（見表1），由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.2.4.3 PCR擴(kuò)增體系

以東農(nóng)L-10根部cDNA為模板，擴(kuò)增目的基因序列，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為700 bp。KOD-FX-PCR反應(yīng)體系（50μL）如下：Autoclaved，distilled water（33-X）μL，10× PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 1×5 μL，dNTPs（0.2 mmol · L-1）5 μL，MgSO4（1.5 mmol·L-1）3 μL，引物（0.3 μmol· L-1each）1.5 μL，模板cDNA（200 ng·50μL-1）X μL，KOD-Plus-Neo（1 U ·50μL-1）1μL；94℃預(yù)變性 2 min，98℃變性10 s，60℃退火30 s，68℃延伸溫度30 s·kb-1，共36個(gè)循環(huán)，4℃保存。

表1 目的基因擴(kuò)增引物Table 1 Genes and corresponding primersfor PCR

1.2.4.4 目的基因片段回收

1%瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，利用全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析儀拍照記錄后，根據(jù)OMEGA Gel Extraction Kit（D2500-01）凝膠回收試劑盒說明書方法操作，回收目的條帶，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.5 線性化植物表達(dá)載體與目的基因片段連接

在pCAMBIA3300載體多克隆位點(diǎn)上找到單酶切位點(diǎn)XbaⅠ，根據(jù)所選酶切位點(diǎn)將植物表達(dá)載體pCAMBIA3300酶切線性化。酶切反應(yīng)體系為：XbaⅠ（10 U·μL-1）1 μL，10×Buffer Tango 4 μL，載體質(zhì)粒20μL，ddH2O 14μL，反應(yīng)條件：37℃金屬浴4～5 h，電泳驗(yàn)證酶切結(jié)果。

1.2.4.6 目的基因與克隆載體In-Fusion連接與轉(zhuǎn)化

大腸感受態(tài)（E.coli）DH5α購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，熱激法轉(zhuǎn)化目的基因。In-Fusion方法將線性化pCAMBIA3300載體與目的基因片段連接反應(yīng)體系如下：5×In-Fusion HD Enzyme Premix 1μL，目的片段1μL，XbaⅠ酶切pCambia3300載體 1μL，Autoclaved,distilled water 2μL，反應(yīng)總體積5μL，輕彈并混勻樣品，50℃鏈接3 h。

1.2.4.7 菌液驗(yàn)證及測(cè)序

采用Easy-Taq菌液PCR方法檢驗(yàn)陽性克隆，挑取6個(gè)1μL培養(yǎng)菌液作為模板PCR鑒定。吸取300μL鑒定正確菌液交由北京華大基因科技有限公司測(cè)序。菌液PCR反應(yīng)體系（20μL）為：10×buffer with Mg2+2μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 0.3μL，引物 1μL，菌液 1μL，Easy-taq 0.3μL，ddH2O 15.4μL；預(yù)變性:94℃,5 min，變性：94℃，30s，退火：58℃，30 s，延伸溫度：72℃，1 min·kb-1，共36個(gè)循環(huán)，終延伸72℃，5 min，4℃保存。將測(cè)序合格樣品，根據(jù)OMEGA公司Plasmid Mini Kit I（D6942-02*）試劑盒說明書按步驟提取質(zhì)粒。

1.2.5 發(fā)根農(nóng)桿菌（K599）侵染

選擇長(zhǎng)勢(shì)一致4 d苗齡大豆幼苗，使用一次性1 mL注射器收集無菌水重懸菌體，幼苗在子葉節(jié)點(diǎn)或近端下胚軸處注射2～3次，接種菌液，菌液注射后28℃暗培養(yǎng)24 h再用菌體侵染1次。將侵染后大豆幼苗放入含B&D營(yíng)養(yǎng)液潤(rùn)濕蛭石中，蛭石覆蓋傷口，保鮮膜覆蓋培養(yǎng)缽。侵染3 d后觀察愈合傷口，將突起下部約1 cm處剪斷。生長(zhǎng)2～3周后，將發(fā)根長(zhǎng)度為5～10 cm移栽至B&D營(yíng)養(yǎng)液水中，連續(xù)通氣培養(yǎng)3～5 d。利用該方法快速獲得復(fù)合植株（Composite plants），即轉(zhuǎn)基因植株發(fā)根和非轉(zhuǎn)基因地上部分[28-29]。

1.2.6 大豆根部總DNA提取

將水培階段結(jié)束的每3株復(fù)合植株（為一組）置于高溫滅菌土與細(xì)沙（1∶1）混合土中，同時(shí)用孵化出的二齡幼蟲（J2）混制成2 000條·mL-1卵懸液侵染，保持濕潤(rùn)并在15 d后取其新鮮單株側(cè)根3～4 cm于2 mL離心管中（加鋼珠），迅速放入液氮冷凍，標(biāo)準(zhǔn)打樣機(jī)搗碎側(cè)根（2000DENO/GRINDER），利用SDS小量法提取大豆根部總DNA，保存于20μL去離子水中。所得大豆根部DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，利用全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析儀（TANON 3500）檢測(cè)其濃度，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 酸性品紅染色法染色根系內(nèi)線蟲

以PCR陽性的根植株為陽性對(duì)照，以PCR陰性的根植株為陰性對(duì)照，以轉(zhuǎn)pCAMBIA3300為空白對(duì)照，鑒定大豆胞囊線蟲抗性，采用國(guó)際常用酸性品紅染色法鑒定[10]。

1.2.8 候選基因功能驗(yàn)證

提取轉(zhuǎn)基因植株根部DNA，利用克隆引物PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因陽性根，PCR鑒定。將檢測(cè)帶有轉(zhuǎn)基因陽性根植株及其對(duì)照作線蟲卵懸液接種鑒定，15 d后采用酸性品紅染色法，作大豆胞囊線蟲病4號(hào)生理小種抗性鑒定。20×光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)，每株取11個(gè)側(cè)根，計(jì)算每株雌蟲平均數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016對(duì)處理組和對(duì)照組作t測(cè)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmRSCN4-3基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

通過 ProtParam tool（http://www.expasy.ch/toools/protparam.html）對(duì)GmRSCN4-3蛋白序列分析理化性質(zhì)。結(jié)果表明，GmRSCN4-3基因編碼669個(gè)氨基酸，分子式為C1984H3301N669O826S190，預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為55.83 ku，等電點(diǎn)PI為5.10，不穩(wěn)定性指數(shù)為62.45，證明此蛋白為不穩(wěn)定性蛋白；總負(fù)電荷基數(shù)（Asp+Glu）為0個(gè)，正電荷殘基數(shù)（Arg+Lys）為0個(gè)，脂溶指數(shù)（Aliphatic index）為21.52；疏水性平均系數(shù)（GRAVY）為0.827。蛋白質(zhì)氨基酸序列分析表明，GmRSCN4-3蛋白中含量最高為cys（28.4%），其次是gly（26.8%）。Hphob./Kyte&Doolittle算法（http://ca.expasy.org/tools/protscale.html）分析氨基酸序列親水性與疏水性，其中負(fù)分值氨基酸少于正分值氨基酸，即親水性小于疏水性，表明其為疏水性蛋白。

2.2 抗病候選基因GmRSCN4-3克隆和轉(zhuǎn)化

2.2.1 東農(nóng)L-10根部總RNA提取

選取接種線蟲卵懸液12 h后東農(nóng)L-10根部組織提取總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其中18S和28SRNA帶型清晰可辨（見圖1），經(jīng)Nanovue超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，總RNA中OD260/OD280比值為1.98，介于1.9～2.1，說明RNA完整性好、純度高，適宜cDNA合成。

2.2.2 大豆抗胞囊線蟲候選基因GmRSCN4-3 cDNA獲得

以大豆東農(nóng)L-10根部總RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，分別用GmRSCN4-F、GmRSCN4-R，經(jīng)PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物得到特異性目的片段，長(zhǎng)度500～750 bp，與預(yù)期片段700 bp一致（見圖2）。將擴(kuò)增所得目的片段與pCAMBIA3300植物過表達(dá)載體利用In-Fusion連接（見圖3），轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證（見圖4），挑取5個(gè)陽性克隆送華大基因測(cè)序。以測(cè)序大豆品種Williams82 GmRSCN4-3序列信息設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增目的基因，將測(cè)序結(jié)果與NCBI公布序列比對(duì)，再將5個(gè)測(cè)序結(jié)果兩兩比對(duì)，最終選取與NCBI公布序列最接近且在測(cè)序結(jié)果中有兩個(gè)以上完全匹配序列，確定為大豆東農(nóng)L-10品種中GmRSCN4-3基因最終序列。

圖1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 Agarosegel electrophoriesis of total RNA

圖2 目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis result of gene amplification products

圖3 pCambia3300載體單酶切電泳Fig.3 Agarosegel electrophoriesis of p Cambia3300 vector single enzyme digestion

2.2.3 發(fā)根農(nóng)桿菌陽性克隆鑒定

以含pCambia3300-GmRSCN4-3重組質(zhì)粒發(fā)根農(nóng)桿菌菌液為試材，使用Infusion克隆引物作PCR，對(duì)發(fā)根農(nóng)桿菌作陽性克隆鑒定，結(jié)果表明6個(gè)不同單克隆菌液PCR產(chǎn)物均為陽性（見圖5），表明pCambia3300-GmRSCN4-3基因成功轉(zhuǎn)化。

2.3 轉(zhuǎn)基因陽性根鑒定

對(duì)接種15 d后14株發(fā)根植株提取DNA，作克隆引物PCR鑒定（見圖6），結(jié)果表明11株植株均表現(xiàn)為陽性。

2.4 轉(zhuǎn)基因陽性根表型鑒定

將檢測(cè)到標(biāo)有轉(zhuǎn)基因陽性根的11個(gè)植株及其對(duì)照處理在相同條件下接種鑒定，15 d后經(jīng)酸性品紅染色法20×光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)，每株取10個(gè)側(cè)根，計(jì)算每株雌蟲平均值（見表2），結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因陽性根中雌蟲胞囊數(shù)顯著低于對(duì)照。

圖4 p Cambia3300-GmRSCN4-3轉(zhuǎn)大腸桿菌PCR初步鑒定Fig.4 PCR results of Escherichia coli containing therecombinant plasmid p Cambia3300-GmRSCN4-3

圖5 含p Cambia3300-GmRSCN4-3重組質(zhì)粒發(fā)根農(nóng)桿菌菌液PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.5 PCR results of Agrobacterium rhizogenes bacteria containing therecombinant plasmid p Cambia3300-GmRSCN4-3

圖6 東農(nóng)50發(fā)根植株陽性根PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.6 Positive root PCR results of Dongnong 50 root plant

表2 植株根部雌蟲平均數(shù)Table2 Average number of female plant (個(gè)·cm-1)

3 討論與結(jié)論

3.1 發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆遺傳轉(zhuǎn)化

大豆R基因種類和數(shù)量眾多，但有關(guān)抗SCN抗病候選基因較少，大豆胞囊線蟲抗性基因功能鑒定通常采用永久遺傳轉(zhuǎn)化法，此方法驗(yàn)證抗病候選基因所需時(shí)間長(zhǎng)，步驟繁瑣且轉(zhuǎn)化效率低，阻礙大豆胞囊線蟲病候選基因鑒定效率[28]。發(fā)根農(nóng)桿菌侵染子葉節(jié)或下胚軸從而誘導(dǎo)形成不定根，具有生長(zhǎng)速度快、生長(zhǎng)所需條件易控制、遺傳穩(wěn)定、發(fā)根數(shù)量多、轉(zhuǎn)化效率高、生長(zhǎng)條件簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)[29]。因此，發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆發(fā)根遺傳轉(zhuǎn)化成為大豆根部病害抗性基因理想研究系統(tǒng)。本研究利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化大豆方法，快速鑒定GmRSCN4-3基因?qū)Υ蠖拱揖€蟲抗性，證明該系統(tǒng)有效性。

3.2 SCN抗性基因功能快速鑒定法-品紅染色法

大豆胞囊線蟲抗性鑒定方法主要包括根系酸性品紅染色法和傳統(tǒng)根系胞囊計(jì)數(shù)法。本研究采用根系酸性品紅染色法作抗性鑒定[10]，與傳統(tǒng)根系胞囊計(jì)數(shù)法相比，此方法有鑒定時(shí)間短、胞囊脫落少、計(jì)數(shù)準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。因此本研究采用改進(jìn)的發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)毛狀根法結(jié)合根系酸性品紅染色法，可高效開展大豆胞囊線蟲抗性候選基因功能驗(yàn)證。

3.3 抗大豆胞囊線蟲候選基因功能驗(yàn)證

目前，我國(guó)已篩選出高抗大豆胞囊線蟲病4號(hào)小種抗源多數(shù)為黑種皮地方品種，其抗源抗性多由顯性抗病位點(diǎn)Rhg4控制，該基因與黑種皮基因i密切連鎖[23-24]，利用這些抗源開展育種多采用多次回交方式。與以往抗源不同，本研究采用抗源為黃種皮東農(nóng)L-10[31]，可直接應(yīng)用于育種，同時(shí)本研究成功從抗病品種東農(nóng)L-10中獲得抗病候選基因GmRSCN4-3，初步驗(yàn)證抗性候選基因GmRSCN4-3具有抗大豆胞囊線蟲病4號(hào)生理小種功能，為東農(nóng)L-10分子輔助育種體系建立奠定抗性基因基礎(chǔ)。本研究通過發(fā)根農(nóng)桿菌作抗性基因GmRSCN4-3初步功能鑒定，為過表達(dá)技術(shù)和基因敲技術(shù)全面解析GmRSCN4-3基因功能提供新思路。