多重?zé)晒釶CR方法檢測食品中致病菌的實(shí)用研究

◎ 董 睿，孫端方

（1.貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，貴州 貴陽 550009；2.貴州省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，貴州 貴陽 550016）

《國家食品安全監(jiān)督抽檢實(shí)施細(xì)則》和根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)制定的各省市縣級食品監(jiān)抽細(xì)則，食品中致病菌是食品檢測的主要對象。致病菌檢測包括沙門氏菌（以下簡稱“沙門”）、金黃色葡萄球菌（以下簡稱“金葡”）、水產(chǎn)品中副溶血性弧菌（以下簡稱“副溶”）、肉制品中單核細(xì)胞增生李斯特菌（以下簡稱“單增”）、牛肉制品中大腸埃希氏菌O157:H7/NM等。

致病菌檢測的強(qiáng)制國標(biāo)方法均以篩選培養(yǎng)法為主體，經(jīng)過多重篩選選出疑似陽性樣品后，采用生化方法進(jìn)行驗(yàn)證，檢測過程耗時(shí)較長、工作量大。多重?zé)晒釶CR法在初篩環(huán)節(jié)以其檢測迅速、操作量低等明顯優(yōu)勢，在科研領(lǐng)域已得到反復(fù)驗(yàn)證，但在國內(nèi)監(jiān)抽領(lǐng)域還未采用相關(guān)方法。

本研究以沙門、金葡、副溶、單增為檢測對象，驗(yàn)證多重?zé)晒釶CR法在實(shí)際食品中致病菌的應(yīng)用，選用以往省抽備樣中的檢出樣品，設(shè)計(jì)引物和探針進(jìn)行檢測；以GB 4789.4-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》、GB 4789.7-2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)》、GB 4789.10-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》、GB 4789.30-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》為方法對照。

1 材料與方法

1.1 樣品

調(diào)取以往省抽備樣中分別只檢出了沙門、金葡、副溶或單增的食品各10批次，分別設(shè)為沙門、金葡、副溶、單增的陽性對照，再互為其他3種菌種的陰性對照，并在檢驗(yàn)過程中設(shè)空白對照。

1.2 方法

1.2.1 熒光PCR法

先按GB 4789.4-2016、GB 4789.7-2013、GB 4789.10-2016、GB 4789.30-2016中初次增菌方法進(jìn)行取樣培養(yǎng)。DNA提取試劑盒為Toyobo MagExtractor?Genome，熒光PCR試劑為Toyobo Thunderbird qPCR Mix，引物探針，見表1。體系配制及反應(yīng)參數(shù)按試劑說明書。熒光PCR儀為ABI 7500 Fast。

表1 多重?zé)晒釶CR引物及探針表

1.2.2 國標(biāo)方法

按 GB 4789.4-2016、GB 4789.7-2013、GB 4789.10-2016、GB 4789.30-2016檢測。

2 結(jié)果與分析

圖1示例了分別只檢出沙門、金葡、副溶或單增的食品各1批次的FAM、HEX、TAMRA、Cy5熒光信號，其中作為陽性對照的熒光呈顯著的S形曲線增長，且Ct值＜30.0，作為陰性對照的熒光無信號增長且Ct值＞40.0，結(jié)果見表2。其余批次也符合實(shí)驗(yàn)要求。該結(jié)果表明多重?zé)晒釶CR方法可準(zhǔn)確區(qū)分沙門、副溶、金葡、單增，也與國標(biāo)檢測和生化檢測的結(jié)果相符。

圖1 多重?zé)晒釶CR信號曲線圖

表2 多重?zé)晒釶CR檢測結(jié)果表

3 討論

食品中致病菌檢測的國標(biāo)方法通常為3～5 d，基本為純?nèi)斯げ僮?，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；并且在初篩、復(fù)篩的平板菌落挑取過程中，存在肉眼判斷誤差；同時(shí)在實(shí)際檢測中，成千上萬的樣品數(shù)量使得上述缺點(diǎn)非常顯著。普通PCR法檢測食品中致病菌，檢測時(shí)間縮短為2 d左右，操作簡便；在實(shí)際檢測中，樣品數(shù)量越多，相對國標(biāo)方法效率提升越高。

多重PCR在普通PCR基礎(chǔ)上，通過運(yùn)用多對引物檢測目的基因，成倍提升檢測效率；熒光PCR作為第二代PCR技術(shù)，通過監(jiān)測探針或染料在PCR擴(kuò)增時(shí)的熒光信號變化以計(jì)算檢測結(jié)果，大幅提高了準(zhǔn)確性。多重?zé)晒釶CR在熒光PCR基礎(chǔ)上，通過運(yùn)用多條探針檢測目的基因，結(jié)合上述兩種方法優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)提升檢測效率和準(zhǔn)確性，可逐步運(yùn)用于日常檢測工作。