江西贛州桃果炭疽病菌的形態(tài)及分子鑒定

葉夢(mèng)斐，周 燁，劉佳文，崔汝強(qiáng)，石緒根

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江西 南昌 330045)

桃(AmygdaluspersicaL.)，薔薇科、桃屬植物，是一種果實(shí)作為水果的落葉小喬木，花可以觀賞，果實(shí)多汁，可以生食或制桃脯、罐頭等，核仁也可以食用。果肉有白色和黃色的，桃有多種品種，一般果皮有毛，“油桃”的果皮光滑；“蟠桃”果實(shí)是扁盤狀；“碧桃”是觀賞花用桃樹，有多種形式的花瓣。桃原產(chǎn)中國，栽培歷史悠久，各省區(qū)廣泛栽培[1]。江西省是我國南方桃的重要產(chǎn)區(qū)之一，產(chǎn)業(yè)基礎(chǔ)較好，在落葉果樹中，桃是僅次于梨的經(jīng)濟(jì)栽培樹種。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2015年江西桃栽培面積10 716 hm2，產(chǎn)量63 705 t[2]，南昌市、景德鎮(zhèn)市、九江市、贛州市、上饒市為主產(chǎn)地區(qū)。桃炭疽病廣泛分布于各大產(chǎn)區(qū)，為桃的重要病害之一，對(duì)產(chǎn)量影響極大。炭疽病主要危害果實(shí)，幼果感病時(shí)果面呈暗褐色，發(fā)育緩慢甚至停滯，直至萎縮硬化。稍大的果實(shí)在發(fā)病初期，會(huì)產(chǎn)生淡褐色的水漬狀斑點(diǎn)，并且逐漸擴(kuò)大，形成紅褐色的圓形或橢圓形凹陷病斑，在潮濕環(huán)境中也會(huì)有橘紅色的小粒點(diǎn)長(zhǎng)出。在江西省內(nèi)的主產(chǎn)區(qū)中，贛州市龍南縣武當(dāng)鎮(zhèn)桃產(chǎn)量受炭疽病影響較為嚴(yán)重。但尚不清楚龍南縣武當(dāng)鎮(zhèn)桃炭疽病由何種炭疽菌引起，無法實(shí)施有效的防治措施。為此，筆者將形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)結(jié)合，對(duì)其病原進(jìn)行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 病果采集

2017年7月于江西省贛州市龍南縣武當(dāng)鎮(zhèn)桃園采集呈典型癥狀的桃果實(shí)炭疽病病果樣品(圖1)，樣品采回后立即進(jìn)行病菌分離。

1.2 病原分離與純化

圖1 桃果實(shí)炭疽病發(fā)病樣品Fig.1 The sample of diseased peach fruit of Colleto trichum

1.2.1 分離 按常規(guī)組織分離法分離病菌，分離培養(yǎng)基為PDA。用接種針輕輕刮取病果發(fā)病組織表面的孢子，并在1 mL無菌水中震蕩3～5 s制成孢子懸浮液，吸取100 μL孢子懸浮液于PDA平板培養(yǎng)基上，涂布均勻，倒置放入人工氣候箱中，26 ℃，培養(yǎng)5～6 d后觀察待分離菌的生長(zhǎng)情況。

1.2.2 純化 挑取菌落邊緣菌絲于PDA平板培養(yǎng)基中，倒置放入人工氣候箱中培養(yǎng)，逐日觀察菌落形態(tài)特征，待分生孢子團(tuán)形成后，鏡檢分生孢子形態(tài)，并隨機(jī)選取50個(gè)分生孢子測(cè)量其大小。

1.3 病菌致病性測(cè)定

按照柯赫氏法則要求，對(duì)分離的病菌進(jìn)行致病性測(cè)定。致病性測(cè)定方法如下：取已滅菌的培養(yǎng)皿，倒入PDA制成空白培養(yǎng)基備用；用無菌打孔器分別在分離株(大概10個(gè))和空白培養(yǎng)基(大概10個(gè))中打菌餅；取健康桃子，先用無菌水沖洗，棉球擦干，再用體積分?jǐn)?shù)為75%酒精擦洗，棉球擦干；用同一打孔器在桃子兩處打孔，用鑷子小心撕去果實(shí)表皮，分別將分離株與空白培養(yǎng)基接種到果實(shí)傷口處，3個(gè)重復(fù)；接種后，用無菌水保濕；將接種后的果實(shí)放入無菌托盤中，保鮮膜覆蓋后，置于恒溫培養(yǎng)箱中(28 ℃，60%濕度，光照∶黑暗= 16∶8)培養(yǎng)。待病斑出現(xiàn)后，進(jìn)行病菌再分離，觀察孢子形態(tài)與原分離株是否一致。

1.4 分子鑒定

1.4.1 rDNA-ITS序列擴(kuò)增 用無菌吸水紙吸干菌絲水分，用液氮碾磨后，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，按照基因組DNA提取試劑盒(博彩生物公司)操作說明提取DNA，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA樣品質(zhì)量。用通用引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′[3]擴(kuò)增rDNA-ITS序列，PCR反應(yīng)在25 μL體系中進(jìn)行，體系如下：10×PCR Buffer 2 μL，dNTP Mix 2 μL，DNA模板1 μL，引物ITS 10.5 μL，引物ITS4 0.5 μL，rTaq酶0.2 μL，ddH2O18.8 μL；PCR擴(kuò)增程序如下：94 ℃預(yù)變性4 min,94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)后，72 ℃ 10 min，4 ℃保存運(yùn)行。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4.2 TA克隆 參照割膠回收試劑盒(AXYGEN公司)操作說明回收PCR產(chǎn)物，進(jìn)行TA克隆[4]，實(shí)驗(yàn)方法如下：取4 μL割膠回收的產(chǎn)物、1 μL PMD-T-18和5 μL Solition Ⅰ于PCR管中混勻，16 ℃反應(yīng)30 min，利用凍融法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，均勻涂布于含50 mg/L Amp的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)12～16 h后，用通用引物M13F：5′-GTAAAACGACGGCCAGT-3′，M13R：5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′進(jìn)行菌落PCR鑒定陽性重組子，PCR反應(yīng)體系如下：10× PCR Buffer 2 μL，dNTP Mix 2 μL，單菌落模板0 μL；引物各0.4 μL，rTaq酶0.2 μL，ddH2O 15 μL，PCR擴(kuò)增程序如上述。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，測(cè)序并-80 ℃冰箱中保存菌種。

1.4.3 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹 采用MEGA7.0軟件[5]，構(gòu)建分離株與其他12種炭疽病病原菌之間的系統(tǒng)進(jìn)化樹，構(gòu)建方法是鄰接法(neighbor-joining，NJ)，自引導(dǎo)值(Bootstrap Replication)設(shè)為1 000，其他依照默認(rèn)設(shè)置。

2 結(jié)果與討論

2.1 病菌形態(tài)及大小觀測(cè)

本實(shí)驗(yàn)通過組織分離法從病果中分離獲得4個(gè)形態(tài)幾乎一致的真菌，在PDA平板上菌落初為白色，后由中部向邊緣逐步變?yōu)榛揖G色，背面為黃綠色，近圓形，上有黑色小點(diǎn)，菌落蓬松，邊緣整齊、光滑，菌落生長(zhǎng)速率12.4 mm/d。顯微鏡下觀察，其分生孢子呈圓柱形，單孢，兩端鈍圓，孢子大小為(19.19～26.08) μm×(5.91～9.35) μm。根據(jù)分離株的形態(tài)特征，查閱相關(guān)文獻(xiàn)[6-7]，推測(cè)贛州市桃果炭疽病菌屬于膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)，其在菌落形態(tài)及孢子形態(tài)如圖2所示。

A:菌落正面形態(tài)特征;B:菌落背面形態(tài)特征;C:分生孢子形態(tài)A:The obverse side morphological characteristics of the colony,B:The reverse side morphological characteristics of the colony,C:The morphology of conidium圖2 贛州桃果炭疽病菌菌落及分生孢子形態(tài)特征 Fig.2 The morphological characteristics of bacterial colony and conidia of Colletotrichum gloeosporioides in Ganzhou

2.2 病菌致病性測(cè)定結(jié)果

將分離株進(jìn)回接至健康果實(shí)中，恒溫培養(yǎng)7 d，發(fā)現(xiàn)分離株回接產(chǎn)生的病斑與原始癥狀相似，且從回接病斑中分離到與原始分離株形態(tài)及孢子大小一致的病原菌。致病性測(cè)定結(jié)果見圖3。

2.3 rDNA-ITS 序列測(cè)定及同源性分析

2.3.1 DNA電泳結(jié)果 采用博彩生物基因組DNA提取試劑盒方法提取分離株基因組的DNA，結(jié)果見圖4。

2.3.2 rDNA-ITS序列擴(kuò)增 以分離株基因組DNA為模板，用真菌鑒定通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可知擴(kuò)增序列大小約為550 bp，符合預(yù)期大小，結(jié)果見圖5。

A:分離菌回接;B:空白對(duì)照A:The inoculation isolated fungi;B:Blank control圖3 回接桃果病斑Fig.3 The disease spots of the inoculated peach fruit

M:DL 2 000 Maker；1～2:分離菌基因組DNAM:DL 2 000 Maker；1-2:The DNA genome of isolated fungi圖4 分離菌DNA電泳結(jié)果Fig.4 The DNA electrophoresis of isolated fungi

2.3.3 TA克隆 將回收純化的擴(kuò)增產(chǎn)物連接克隆至載體PMD-T-18上，利用菌落PCR法，陽性克隆鑒定，擴(kuò)增后得到片段約700 bp，符合預(yù)期大小，確定為陽性克隆，保存陽性克隆送蘇州泓迅生物科技有限司測(cè)序，電泳結(jié)果見圖6。

M：DL 2 000 Maker；1～5：rDNA-ITS序列M：DL 2 000 Maker；1-5：rDNA-ITS sequence圖5 分離菌rDNA-ITS擴(kuò)增電泳Fig.5 The rDNA-ITS sequence of isolated fungi

M：DL 2 000 Maker；1～5：TA克隆序列M：DL 2 000 Maker；1-5：The sequence of TA clone圖6 分離菌rDNA-ITS序列克隆電泳Fig.6 The rDNA-ITS cloning sequence of isolated fungi

圖7 贛州桃膠孢炭疽rDNA-ITS序列Fig.7 The rDNA-ITS sequence of Colletotrichum gloeosporioides in Ganzhou

2.3.4 測(cè)序結(jié)果 測(cè)序結(jié)果表明該DNA片段長(zhǎng)度為536 bp(不包括引物片段長(zhǎng)度)，將此序列放在NCBI上進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果表明該序列與膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)的同源性達(dá)100%，故該桃果實(shí)的致病菌為膠孢炭疽菌。該DNA片段的序列如圖7所示。

2.3.5 系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析 利用MEGA7.0軟件，構(gòu)建了分離株與其他12個(gè)炭疽病病原菌的rDNA-ITS序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹。從進(jìn)化樹可以看出，分離株與C.gloeosporioides、C.siamense和G.cingulata的進(jìn)化關(guān)系最近，形成一個(gè)小分支，而與其他病原菌的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，結(jié)果如圖8所示。

圖8 贛州桃果實(shí)炭疽病分離株與12種炭疽病菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.8 Neighbor-joining tree based on the rDNA-ITS sequences of isolated fungi and twelve other anthracnose pathogen in the database

3 結(jié)論與討論

本文通過病菌分離純化和rDNA-ITS序列測(cè)定對(duì)江西省贛州市桃果實(shí)炭疽病病菌進(jìn)行了鑒定，所獲得的分離株具有一致的菌落特征和分生孢子形態(tài)大小，與文獻(xiàn)記載的膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)形態(tài)特征相符，選取分離株進(jìn)行rDNA-ITS序列測(cè)定和同源性分析，結(jié)果與膠孢炭疽菌具有100%的核苷酸序列同源性，據(jù)此，筆者認(rèn)為贛州桃果實(shí)炭疽病病菌應(yīng)屬于膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)。

桃炭疽病是廣泛分布于國內(nèi)各桃產(chǎn)區(qū)的重要病害，已有研究表明我國福建古田縣、清流縣，陜西西安市，廣西桂林市靈川縣，湖北省，遼寧省，浙江省桐廬縣，上海市浦東新區(qū)，貴州省貴陽市均有發(fā)現(xiàn)炭疽病，且危害較為嚴(yán)重[8-17]，其中福建古田縣和貴州省貴陽市的桃炭疽病菌為盤長(zhǎng)孢刺盤孢菌(ColletotrichumgloeosporioidesPenz)[8,17]，湖北省的桃炭疽病菌為尖孢炭疽病菌(Colletotrichumacutatum)[13]?？梢钥闯觯髭M州桃炭疽病菌與國內(nèi)多數(shù)桃產(chǎn)區(qū)的炭疽病菌同屬不同種，具有一定的研究?jī)r(jià)值。

rDNA-ITS 序列測(cè)定是目前國內(nèi)外使用較廣的植物病原分子鑒定方法[18-21]。本研究所測(cè)得的贛州桃炭疽病菌的rDNA-ITS序列既與膠孢炭疽菌的對(duì)應(yīng)序列具有100%的同源性，也與油茶炭疽病菌和暹羅刺盤孢的對(duì)應(yīng)序列具有100%的同源性。結(jié)果表明rDNA-ITS序列在炭疽病菌的鑒定中存在一定的局限性，需要與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法相結(jié)合進(jìn)行，可以提高結(jié)果的可信度。