反相高效液相色譜法測(cè)定人血清中奧卡西平活性代謝產(chǎn)物的濃度

高雅莉　莊奕筠　許秋霞

[摘要] 目的 建立反相高效液相色譜法測(cè)定人血清中奧卡西平（OXC）活性代謝產(chǎn)物MHD的濃度。 方法 收集血清樣品經(jīng)甲醇沉淀蛋白后，采用InertSustain C18（5 μm，4.6×150 mm）色譜柱，流動(dòng)相為甲醇-水（35：65），流速：0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm，柱溫：40℃，進(jìn)樣體積：20 μL。 結(jié)果 血清中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)樣品測(cè)定無(wú)干擾，MHD 在4.8～38.4 μg/mL線性關(guān)系良好，回歸方程為：A=13968.3C-13730.7，r=0.9990。MHD的低、中、高3種濃度平均回收率均>95%，日內(nèi)、間 RSD 均<3%（n=5）。 結(jié)論 反相高效液相色譜法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高，適用于人體內(nèi)奧卡西平活性代謝產(chǎn)物MHD的血藥濃度監(jiān)測(cè)。

[關(guān)鍵詞] 奧卡西平；10，11-二氫-10-羥基卡馬西平；活性代謝產(chǎn)物；反相高效液相色譜法；血藥濃度

[中圖分類(lèi)號(hào)] R969 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2018）12-0042-03

Determination of active metabolites of oxcarbazepine in human serum by reversed-phase high performance liquid chromatography

GAO Yali ZHUANG Yiyun XU Qiuxia CHEN Xi

Department of Pharmacy，the Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University，Quanzhou 362000，China

[Abstract] Objective To establish reversed-phase high performance liquid chromatography method for the determination of oxcarbazepine（OXC） active metabolite MHD concentration in human serum. Methods The serum samples were collected and the protein was precipitated by methanol， then InertSustain C18（5 μm， 4.6×150 mm） chromatography column was used， and the mobile phase was methanol-water（35：65）， flow rate： 0.8mL/min， detection wavelength： 210 nm， column temperature： 40°C， injection volume： 20 μL. Results The endogenous substances in serum did not interfere with the determination of the samples. The linearity of MHD was good from 4.8 to 38.4 μg/mL. The regression equation was： A=13968.3C-13730.7， r=0.9990. The average recoveries of MHD at low， medium， and high concentrations were all> 95%， and intra-and inter-day RSDs were <3%（n=5）. Conclusion The reversed-phase high performance liquid chromatography method is simple， accurate and sensitive， which is suitable for monitoring the plasma concentration of MHD， an active metabolite of oxcarbazepine.

[Key words] Oxcarbazepine；10， 11-dihydro-10-hydroxycarbamazepine；Active metabolites； Reversed-phase high performance liquid chromatography；Serum concentration

癲癇是一組由于腦部神經(jīng)元異常過(guò)度放電所引起的突然、短暫、反復(fù)發(fā)作的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）功能失常的慢性疾病和綜合征[1]，是一類(lèi)嚴(yán)重影響人類(lèi)身心健康的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。目前，癲癇患者控制癲癇發(fā)作的最重要手段仍然是服用抗癲癇藥物。奧卡西平（oxcarbazepine，OXC）是一種新型的抗癲癇藥物，是卡馬西平（carbamazepine，CBZ）的10-酮基衍生物（圖1），2000年1月由美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市。OXC不良反應(yīng)的發(fā)生率顯著低于CBZ[2]，且耐受性好，對(duì)肝藥酶誘導(dǎo)作用較弱，藥物相互作用少，可作為傳統(tǒng)抗癲癇藥的替代藥物[3]。OXC在服用后，迅速且?guī)缀跬耆亟到鉃樗幚砘钚源x產(chǎn)物10，11-二氫-10-羥基卡馬西平（monohydroxycarbazepine，MHD）（圖2）。在人體進(jìn)行的一項(xiàng)物質(zhì)平衡研究中，OXC原型僅占血清中總放射活性的2%[4]，因此在臨床上可通過(guò)測(cè)定血清中MHD血藥濃度來(lái)判斷OXC的療效和不良反應(yīng)。為了解MHD在體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征和進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)，本研究參考國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，簡(jiǎn)化血樣前處理，優(yōu)化色譜條件，建立了RP-HPLC法測(cè)定人血清中MHD濃度，為臨床合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

島津LC-30AD高效液相色譜系統(tǒng)：包括DGU-20A5R脫氣機(jī)、SIL-30AC自動(dòng)進(jìn)樣器、SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器、CTO-30A柱溫箱、LC-30AD二元泵以及LC solution色譜工作站；XH-B型漩渦混合器（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）；離心機(jī)（10900/min，德國(guó)ABBOTT公司）；METTLER AE240電子天平。

1.2 試劑與試藥

奧卡西平片（商品名為曲萊，Novartis Pharma Schweiz AG，規(guī)格300 mg/片）；MHD對(duì)照品（南京康滿(mǎn)林生物醫(yī)藥科技有限公司，純度約為96%，批號(hào)：20131227）；甲醇（HPLC級(jí)，美國(guó)TEDIA公司）；純化水（本實(shí)驗(yàn)室自制）；空白血漿（健康體檢者的混合血漿）；其他試劑為分析純。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：InertSustain C18（5 μm，4.6×150 mm）；流動(dòng)相：甲醇-水（35：65）；流速：0.8 mL/min；二極管陣列檢測(cè)器波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣體積：20 μL。

1.3.2 對(duì)照品溶劑的配制 精密稱(chēng)取MHD標(biāo)準(zhǔn)品適量放在燒杯中，用少量甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用甲醇多次洗滌燒杯，并把洗滌溶液全部轉(zhuǎn)移到容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，配制成0.96 mg/mL（此濃度經(jīng)過(guò)純度折算）的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，轉(zhuǎn)移至棕色瓶后置冰箱4℃貯存。臨用時(shí)，用甲醇稀釋成濃度為96 μg/mL的工作液。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)血清樣品的制備及前處理 分別精密量取96 μg/mL的MHD工作液適量，用甲醇稀釋得到含MHD 4.8、9.6、14.4、19.2、28.8、38.4 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液。精密移取空白血清200 μL置于1.5 mL EP管中，分別加入200 μL上述已配置好的不同濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液，旋渦混勻1 min，加入600 μL甲醇，旋渦混勻1 min，10900 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾器濾過(guò)，進(jìn)樣上機(jī)。

1.3.4 血清樣品前處理 精密量取患者血清樣品200 μL置于1.5 ml EP管中，加入800 μL甲醇沉淀蛋白，旋渦混勻1 min，10900 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾器濾過(guò)，進(jìn)樣上機(jī)。

2 結(jié)果

2.1 方法的專(zhuān)屬性

在選定的血樣前處理方法和色譜分離條件下，得到空白血清（A）、空白血清加入MHD對(duì)照品（B）、患者服藥后血樣（C）的色譜圖見(jiàn)圖3?？梢?jiàn)在本實(shí)驗(yàn)條件下MHD的保留時(shí)間為15.25 min，血清中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)MHD的測(cè)定無(wú)干擾，色譜峰形較好，分離完全。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取含MHD的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，按“1.3.3”項(xiàng)下方法操作后，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以樣品峰面積（A）對(duì)質(zhì)量濃度（C）作線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程A=13968.3C-13730.7，r=0.9990，結(jié)果表明血清中MHD在4.8～38.4 μg/mL線性關(guān)系良好。

2.3 方法回收率和精密度

分別精密量取96 μg/mL的MHD工作液適量，用甲醇稀釋得到含MHD7.2、12、24 μg/mL低、中、高3種質(zhì)控溶液，每個(gè)濃度平行配制5份，按“1.3.3”項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣分析，各濃度分別在同一日內(nèi)測(cè)定，連續(xù)測(cè)定5 d。根據(jù)所得圖形峰面積（A）代入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得各樣品濃度，以日內(nèi)測(cè)得的實(shí)測(cè)濃度計(jì)算日內(nèi)RSD，不同日測(cè)得的實(shí)測(cè)濃度計(jì)算日間RSD，以實(shí)測(cè)濃度與理論濃度的比值計(jì)算方法回收率。MHD的低、中、高3種濃度平均回收率均>95%，日內(nèi)、日間RSD均<3%（n=5），見(jiàn)表1。

2.4 臨床應(yīng)用

應(yīng)用建立的RP-HPLC法測(cè)定OXC活性代謝產(chǎn)物MHD在體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)谷濃度水平，測(cè)定時(shí)血中雜質(zhì)無(wú)干擾。2016年1月～2017年12月共收集77例門(mén)診及住院病例，其中在有效血藥濃度范圍內(nèi)（《中國(guó)藥典·臨床用藥須知·化學(xué)藥和生物制品卷》（2010年版）推薦值為10～35 μg/mL[6]）的占46.75%（36/77），<10 μg/mL占53.25%（41/77），最低為1.11 μg/mL，>35 μg/mL占0。結(jié)果顯示OXC在按常規(guī)劑量給藥的情況下，存在部分患者血藥濃度在有效濃度范圍外，因此，需要在血藥濃度監(jiān)測(cè)下調(diào)整給藥劑量，本方法能夠滿(mǎn)足臨床血藥濃度監(jiān)測(cè)，也能用于患者過(guò)量服藥情況下的中毒藥物濃度監(jiān)測(cè)，從而為患者制定個(gè)體化用藥方案。

3 討論

從奧卡西平的藥動(dòng)學(xué)特征來(lái)看，口服OXC后，其活性代謝產(chǎn)物MHD一般在2～3 d內(nèi)達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度。本文對(duì)癲癇患者口服OXC片后進(jìn)行TDM，在給藥前采集血樣測(cè)定人血清中MHD穩(wěn)態(tài)谷濃度水平。MHD在人血清中的血藥濃度測(cè)定方法已有文獻(xiàn)報(bào)道，通常采用LC-MS/MS法[7]和HPLC法[8-16]。LC-MS/MS專(zhuān)屬性強(qiáng)、靈敏度高，但由于成本昂貴，不適用于常規(guī)檢測(cè)。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于MHD藥物濃度測(cè)定的HPLC法大多采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行測(cè)定[9-11，16]，操作較為繁瑣，本文采用外標(biāo)法進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法簡(jiǎn)便快捷，也能準(zhǔn)確地測(cè)定MHD的血藥濃度。

MHD結(jié)構(gòu)中有兩個(gè)苯環(huán)，具有明顯的紫外吸收。本實(shí)驗(yàn)在200～360 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm時(shí)，基線平穩(wěn)，吸收值較大，靈敏度較高，因此選取210 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。采用甲醇-水為流動(dòng)相，按照不同配比進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)甲醇-水（35：65）時(shí)，血清中內(nèi)源性雜質(zhì)對(duì)樣品測(cè)定無(wú)干擾，色譜峰最為理想。血樣預(yù)處理方法包括固相萃取法[8]、液液萃取法[9-12]和蛋白沉淀法[13-16]。固相萃取法費(fèi)用較高，操作繁瑣；液液萃取法處理具有易乳化、易造成過(guò)程污染、提取不完全等缺點(diǎn)。本文采用有機(jī)溶劑蛋白沉淀法，操作簡(jiǎn)便、快速、成本較低，通過(guò)對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的測(cè)定方法進(jìn)行改進(jìn)，采用甲醇[14-16]沉淀蛋白，采集血清量少，試劑價(jià)廉，毒性低，離心后直接取上清液進(jìn)樣，色譜分離好，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，適用于臨床血藥濃度監(jiān)測(cè)。

綜上所述，抗癲癇治療是一個(gè)長(zhǎng)期的過(guò)程，我院目前開(kāi)展奧卡西平的血藥濃度監(jiān)測(cè)，既是醫(yī)生了解患者用藥依從性的一種手段，同時(shí)也是醫(yī)生監(jiān)測(cè)患者治療效果的一種方式，有助于醫(yī)生針對(duì)個(gè)體癲癇患者調(diào)整用藥方案，提高治療效果，降低不良反應(yīng)發(fā)生率。

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（收稿日期：2017-11-28）