異亮氨酸對(duì)鱖mTOR信號(hào)通路及氮代謝影響

黃 康 梁旭方 何 珊 李 姣 湯樹林 張 真

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)鱖魚研究中心, 武漢 430070; 2. 淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心, 農(nóng)業(yè)部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430070)

蛋白質(zhì)是生命體的物質(zhì)基礎(chǔ), 是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者, 在魚體中, 蛋白質(zhì)是魚體的重要組成成分, 占魚體干重的65%—75%[1]。蛋白質(zhì)作為魚類代謝的主要能源物質(zhì)之一, 在魚體中代謝的終產(chǎn)物是氨氮, 其中蛋白質(zhì)的代謝水平可以通過(guò)氨氮排泄間接反映[2,3]。因此, 在魚體內(nèi)可以通過(guò)氨氮的變化間接反映魚體內(nèi)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化利用情況[4,5]。目前對(duì)于影響魚類氨氮排泄因子的研究主要集中在溫度[6]、攝食[7]、饑餓[8]、魚體大小[9]等方面, 而且也有通過(guò)長(zhǎng)期飼喂添加單種氨基酸的飼料來(lái)研究氨氮排泄。此外, 在對(duì)虹鱒(Oncorhynchus mykiss)的研究發(fā)現(xiàn), 短期內(nèi)氨基酸通過(guò)激活雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路從而影響蛋白質(zhì)、脂肪和糖類三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝[10,11]。因此, 氨基酸與魚類氨氮排泄之間的關(guān)系值得進(jìn)一步的探究。

異亮氨酸(Isoleucine, Ile)又稱為α-氨基-β-甲基戊酸, 首先是Ehrlich從甜菜糖漿中分離提取出來(lái)的,后來(lái)通過(guò)蛋白質(zhì)水解得到, 由于和亮氨酸的化學(xué)組成相同而理化性質(zhì)不同, 故稱為異亮氨酸。異亮氨酸是魚類維持生命活動(dòng)的必需氨基酸, 對(duì)魚類生產(chǎn)性能具有一定的影響, 飼料中適宜水平的異亮氨酸可以降低餌料系數(shù), 提高增重和蛋白沉積水平[12—15]。異亮氨酸可作為激素、酶類等物質(zhì)的合成原料, 而且在調(diào)控蛋白質(zhì)代謝上發(fā)揮重要的生理功能, 是維持機(jī)體正常生長(zhǎng)發(fā)育不可缺少的營(yíng)養(yǎng)素。

雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是磷酸肌醇-3-激酶相關(guān)的激酶家族的一種大分子、多結(jié)構(gòu)域的絲氨酸/蘇氨酸激酶。首先是在芽殖酵母對(duì)真菌毒素和免疫抑制劑雷帕霉素(Rapamycin)的抗性突變中發(fā)現(xiàn)的[16]。在機(jī)體細(xì)胞中, mTOR信號(hào)通路通過(guò)影響蛋白合成、脂類代謝和能量代謝等來(lái)調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖[17]。研究發(fā)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)素可以激活mTOR信號(hào)通路來(lái)調(diào)控蛋白質(zhì)的合成, 相關(guān)研究主要集中在氨基酸對(duì)mTOR信號(hào)通路的影響。氨基酸可以直接或者間接作用于mTOR信號(hào)通路, 從而介導(dǎo)蛋白質(zhì)的代謝[18,19]。在支鏈氨基酸中, 亮氨酸研究較為集中, 在人、豬、鼠和魚類等不同物種中都有報(bào)道亮氨酸對(duì)mTOR信號(hào)通路的作用最為明顯, 但是異亮氨酸對(duì)mTOR通路的研究相對(duì)較少[20—23]。

鱖(Siniperca chuatsi)隸屬于鱸形目Perciformes、鱸亞科Sinipercinae, 俗稱桂花魚、桂魚。鱖肉豐厚堅(jiān)實(shí), 味鮮肥腴, 是我國(guó)特有的久享盛譽(yù)的名貴淡水魚, 經(jīng)濟(jì)價(jià)值高[24]。鱖從開口吃食起終身以活魚蝦為食, 是典型的肉食性兇猛魚類[25]。本研究以鱖為研究材料, 通過(guò)腦室注射異亮氨酸對(duì)鱖氨氮排泄、關(guān)鍵氮排泄基因表達(dá)及肝臟中mTOR信號(hào)通路的影響, 解析異亮氨酸對(duì)魚類代謝的影響, 豐富肉食性魚類的蛋白質(zhì)代謝研究的基礎(chǔ)資料, 為開發(fā)鱖人工飼料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚和養(yǎng)殖條件

實(shí)驗(yàn)用鱖來(lái)自于湖北武漢華中農(nóng)業(yè)大學(xué)鱖魚研究中心。實(shí)驗(yàn)前鱖暫養(yǎng)于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)循環(huán)水系統(tǒng)7d, 每天飽食投喂餌料魚麥鯪(Cirrhinus mrigala)。水溫維持在(25±0.4)℃, pH 6.8—7.2, 溶氧為6.5—6.8 mg/L, 光照周期為自然光照周期。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在正式實(shí)驗(yàn)前, 鱖饑餓24h, 實(shí)驗(yàn)用的每個(gè)圓柱形塑料桶初始水體積為100 L, 并測(cè)定初始水體環(huán)境的氨氮含量。挑選150尾體質(zhì)健康, 規(guī)格整齊的鱖(20.29±0.61) g隨機(jī)分成2個(gè)組, 每個(gè)組3個(gè)平行,每個(gè)平行25尾。其中對(duì)照組注射5 μL的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS), 實(shí)驗(yàn)組注射5 μL溶解的20 μg的異亮氨酸(Sigma, 美國(guó)), 本研究中注射異亮氨酸的劑量基于以前研究確定[26,27]。注射前將鱖用MS222(濃度為200 mg/L)麻醉, 然后稱重。腦室注射(ICV)具體參照Pedro的方法[28]。將微量注射器針頭從鱖的額骨和頂骨的中部連接處插入, 在注射結(jié)束后, 創(chuàng)口處涂抹凡士林, 并將已經(jīng)注射的鱖放入清水中,待其恢復(fù)平衡和正常的游動(dòng)活力后立即轉(zhuǎn)移到之前準(zhǔn)備好的實(shí)驗(yàn)用的圓柱形塑料桶中。在實(shí)驗(yàn)實(shí)施過(guò)程中, 實(shí)驗(yàn)組注射完畢后投喂足量的餌料魚麥鯪(0.59±0.01) g, 分別統(tǒng)計(jì)注射后0.5h、4h、12h和24h各個(gè)時(shí)刻的攝食量。在實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后, 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組相同時(shí)刻開始注射, 注射完畢后, 以實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間段餌料魚攝食量為依據(jù), 分別在注射后0、0.5h、4h和12h投喂與實(shí)驗(yàn)組相同量餌料魚,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn), 對(duì)照組各缸在各個(gè)時(shí)刻均無(wú)餌料魚剩余, 可以保證本次實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組鱖攝食相同量的餌料魚。另外, 為了排除餌料魚對(duì)水體氨氮的影響, 準(zhǔn)備3個(gè)圓柱形塑料桶, 初始水體積為100 L, 并測(cè)定初始水體環(huán)境的氨氮含量, 各缸分別只投放實(shí)驗(yàn)中相同數(shù)量餌料魚, 投放時(shí)間與鱖注射完畢后時(shí)間一致, 測(cè)定24h后水體氨氮濃度。

1.3 樣品收集

在注射后0、0.5h、4h、12h和24h各時(shí)間點(diǎn)每缸取水樣檢測(cè)氨氮濃度, 每缸隨機(jī)取5尾鱖進(jìn)行麻醉, 待麻醉后, 分別尾靜脈取血測(cè)定血液血糖含量,并取鱖肝臟組織用于檢測(cè)蛋白表達(dá)和基因表達(dá)分析、肌肉組織用于檢測(cè)基因表達(dá), 樣品采集完后立即液氮速凍并保存于–80℃超低溫冰箱。

1.4 氨氮含量和血糖含量測(cè)定

氨氮含量的檢測(cè)采用納氏試劑比色法, 在多功能酶標(biāo)儀(BioTek)上測(cè)定, 血糖含量用血糖儀(Accu-Chek Performa, Roche)測(cè)量。

1.5 基因表達(dá)分析

熒光定量引物設(shè)計(jì) 用Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)熒光定量引物并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成, 其中谷氨酸脫氫酶基因(Glutamate dehydrogenase,GDH)、腺苷酸脫氫酶基因(Adenosine monophosphate deaminase,AMPD)、谷草轉(zhuǎn)氨酶基因(Glutamic oxaloacetic transaminase,GOT)及內(nèi)參基因(ribosomal protein L13a,RPL13A)的引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR所用引物序列Tab. 1 Primers used for real-time polymerase chain reaction(Real-Time PCR)

RNA提取提取注射后0、0.5h、4h、12h和24h時(shí)間點(diǎn)肌肉和肝臟RNA, 提取方法主要參照RNAiso Plus(TaKaRa, 日本)說(shuō)明書操作, 提取出來(lái)的總的RNA用多功能酶標(biāo)儀(BioTek)測(cè)定其濃度, 并根據(jù)OD260/OD280比值在1.7—2.1值判斷RNA的質(zhì)量。

RT-qPCR根據(jù)測(cè)得的RNA濃度計(jì)算所需總RNA量, 用PrimeScriptRTreagent Kit (Takara, 日本) 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, 合成cDNA第一鏈。然后用AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix(諾唯贊, 南京)試劑進(jìn)行Real Time PCR擴(kuò)增反應(yīng), 其中反應(yīng)體系為: 10 μL AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix、1 μL cDNA、0.4 μL Forward Primer (10 mmol/L)、0.4 μL Reverse Primer (10 mmol/L)、8.2 μL ddH2O。反應(yīng)液的配制在冰上進(jìn)行, 反應(yīng)程序?yàn)?95℃, 30s; 95℃, 5s; 40×cycles; 58℃, 30s; 溶解曲線:65— 95℃, 每上升0.5℃ 停留 5s。

1.6 Western - Blot

稱取適量肝臟樣品, 冰上勻漿, 使用Ripa裂解液提取肝臟組織蛋白, 提取后的蛋白用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。使用Ripa裂解液稀釋所得蛋白, 并加入5×蛋白上樣緩沖液, 煮沸、離心。配置聚丙烯酰胺凝膠(濃縮膠10%), 濃縮膠中以80 V電壓電泳,分離膠中以200 V電壓電泳。以200 mA恒流電轉(zhuǎn)2h, 電轉(zhuǎn)裝置放于冰水中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用5%脫脂奶粉TBST溶液中封閉, 洗膜。一抗: βactin為1∶15000, P-S6為1∶4000, 4℃共孵育過(guò)夜; 二抗: 羊抗兔為1∶4000, 室溫孵育1h, 洗膜。用雙色紅外激光成像系統(tǒng)(Odyssey Clx, 美國(guó))成像, 成像完畢后得到相應(yīng)的條帶, 用ImageJ軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.7 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示, 用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析, 2個(gè)樣本之間的比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn), 多個(gè)樣本之間的比較使用單因素方差分析 (ANOVA)。若P＜0.05, 則具有顯著差異?；虮磉_(dá)水平以鱖RPL13A為內(nèi)參基因, 應(yīng)用2–ΔΔCt公式確定基因的相對(duì)表達(dá)量[29]。

2 結(jié)果

2.1 腦室注射異亮氨酸對(duì)鱖氨氮排泄的影響

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中, 鱖腦室注射異亮氨酸后水體氨氮的變化如圖1所示。水體氨氮的含量在24h內(nèi)隨著時(shí)間推移逐漸升高, 在注射后0.5h、4h、12h和24h這4個(gè)時(shí)刻, 腦室注射異亮氨酸組水體的氨氮濃度顯著性高于對(duì)照組(P＜0.05)。另外, 在實(shí)驗(yàn)水體中, 麥鯪對(duì)水體氨氮濃度的影響如圖2所示。結(jié)果表明, 餌料魚麥鯪24h內(nèi)氨氮排泄對(duì)水體氨氮濃度沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)。

2.2 腦室注射異亮氨酸對(duì)鱖mTOR信號(hào)通路的影響

在腦室注射異亮氨酸后, 鱖肝臟中mTOR信號(hào)通路的下游分子核糖體S6蛋白磷酸化(P-S6)水平的影響如圖3所示。在注射12h和24h后, 注射異亮氨酸組與對(duì)照組相比, 肝臟P-S6磷酸化水平顯著性升高(P＜0.05)。

2.3 腦室注射異亮氨酸對(duì)AMPD、GDH、GOT基因表達(dá)的影響

鱖腦室注射異亮氨酸后24h內(nèi)的變化如圖4所示。在注射0.5h、4h、12h和24h后, 注射異亮氨酸組肌肉中AMPD基因相對(duì)表達(dá)量顯著性高于對(duì)照組(P＜0.05)。在注射異亮氨酸后, 肝臟中GDH基因相對(duì)表達(dá)量在注射4h和12h后顯著性高于對(duì)照組(P＜0.05), 并且在注射4h后, 相對(duì)表達(dá)顯著性升高,隨后下降, 相反的是, 對(duì)照組肝臟中GDH基因相對(duì)表達(dá)量在注射24h后開始顯著性升高(P＜0.05)。另外, 在注射異亮氨酸后, 肝臟中GOT基因相對(duì)表達(dá)量在0.5h、4h和12h后顯著性高于對(duì)照組(P＜0.05)。

2.4 腦室注射異亮氨酸對(duì)鱖血糖的影響

鱖腦室注射異亮氨酸對(duì)鱖血糖的變化如圖5所示。在注射0.5h后, 注射異亮氨酸后血糖含量顯著性高于對(duì)照組(P＜0.05), 但是在注射4h后, 血糖含量顯著性低于對(duì)照組(P＜0.05)。

圖1 腦室注射異亮氨酸對(duì)鱖氨氮排泄的影響Fig. 1 Effect of ICV injection of isoleucine on ammonia-N excretion of Chinese perch

圖2 麥鯪氨氮排泄對(duì)水體氨氮濃度的影響Fig. 2 Effect of Cirrhinus mrigala on ammonia-N excretion on water (n=3)

圖3 腦室注射異亮氨酸對(duì)鱖肝臟P-S6蛋白表達(dá)分析Fig. 3 The expression of liver ribosomal protein S6 of Chinese perch after ICV injection of isoleucine

圖4 腦室注射異亮氨酸對(duì)鱖AMPD、GDH和GOT基因表達(dá)的影響Fig. 4 The expression levels of AMPD, GDH and GOT of Chinese perch after ICV injection of isoleucine

圖5 腦室注射異亮氨酸對(duì)鱖血糖的影響Fig. 5 Effect of ICV injection of isoleucine on glucose level of Chinese perch

3 討論

魚體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝后產(chǎn)生最終的代謝廢物氨氮, 主要通過(guò)鰓和尿液排出, 占淡水硬骨魚類排泄總量的80%— 90%[30]。白小麗[31]從溫度和攝食方面解析了鱖和草魚氨氮排泄與蛋白質(zhì)代謝之間的關(guān)系, 發(fā)現(xiàn)氨氮排泄隨著蛋白質(zhì)分解增加而增加。因此, 對(duì)魚類氨氮排泄的研究可以更進(jìn)一步理解魚類蛋白質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)機(jī)制。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)餌料魚麥鯪在24h內(nèi)氨氮的排泄對(duì)水體氨氮濃度變化幾乎沒(méi)有影響(圖2), 因此, 餌料魚排泄的氨氮對(duì)水體氨氮沒(méi)有影響。在本實(shí)驗(yàn)中, 水體氨氮的濃度可以在一定程度上反映鱖氨氮的排泄量。腦室注射異亮氨酸, 在24h內(nèi)鱖氨氮排泄量顯著性提高, 研究證明在魚體中氨氮的排泄變化可以間接反映出氨基酸代謝變化[2,3], 因此, 異亮氨酸能夠促進(jìn)鱖氨氮排泄。該結(jié)果和涂永峰在鯽魚的研究一致, 其結(jié)果表明異亮氨酸主要是通過(guò)影響魚體蛋白質(zhì)分解與合成的代謝水平從而促進(jìn)鯽魚氨氮的排泄[32]。

已有研究表明生物體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯和核糖體合成等生物過(guò)程都與mTOR信號(hào)通路密切相關(guān)[33]。在機(jī)體細(xì)胞中, mTOR信號(hào)通路能夠響應(yīng)細(xì)胞外營(yíng)養(yǎng)素、生長(zhǎng)因子等信號(hào), 調(diào)節(jié)細(xì)胞的合成代謝和分解代謝[34]。大多數(shù)研究證明氨基酸作為重要的信號(hào), 能夠激活mTOR信號(hào)通路, 從而介導(dǎo)相應(yīng)的生命活動(dòng)[18,19]。在本研究中, 在注射異亮氨酸12h和24h后, 鱖肝臟mTOR信號(hào)通路下游PS6表達(dá)水平顯著性升高, 表明異亮氨酸激活了鱖肝臟mTOR信號(hào)通路, 該結(jié)果與先前研究一致, 異亮氨酸能夠激活mTOR信號(hào)通路[35,36]。mTOR信號(hào)通路下游分子通過(guò)調(diào)控機(jī)體中蛋白合成、脂類代謝和能量代謝的蛋白的合成來(lái)調(diào)節(jié)相應(yīng)的生命活動(dòng)。因此, 異亮氨酸激活鱖肝臟mTOR信號(hào)通路,促使其下游核糖體蛋白S6磷酸化, 調(diào)控機(jī)體相應(yīng)的蛋白的合成, 從而影響了氨基酸代謝。

肝臟是魚體代謝活動(dòng)的主要器官, 在氨基酸代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用。谷氨酸脫氫酶(GDH)主要存在于肝臟中, 是氨基酸分解代謝關(guān)鍵酶, 在氨基酸分解代謝以及維持體內(nèi)氨氮水平方面起著關(guān)鍵作用[37]。在哺乳動(dòng)物和硬骨魚類的肌肉中,AMPD活性較高, 主要參與調(diào)控嘌呤核苷酸循環(huán)和能量代謝[38,39]。天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(GOT)是碳水化合物和蛋白質(zhì)代謝的紐帶[40], 參與聯(lián)合脫氨作用產(chǎn)生氨[41]。機(jī)體內(nèi)氨基酸代謝過(guò)程中的轉(zhuǎn)氨基和脫氨基作用起到主要作用的是谷氨酸脫氫酶和腺苷酸脫氨酶,另外輔助轉(zhuǎn)氨基的主要關(guān)鍵酶有天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶。在腦室注射異亮氨酸0.5h后,GOT和AMPD基因的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組顯著性升高, 而GDH基因變化不大, 表明肌肉中AMPD基因調(diào)控了嘌呤核苷酸循環(huán)[41], 氧化分解生氨活躍, 另外,GOT基因調(diào)控了谷氨酸與草酰乙酸反應(yīng)生成天冬氨酸, 天冬氨酸參與聯(lián)合脫氨基作用產(chǎn)生氨[41], 因此, 兩者共同作用促進(jìn)機(jī)體氨氮生成。在注射異亮氨酸4h和12h后,GDH、GOT和AMPD基因相對(duì)表達(dá)量顯著性高于對(duì)照組, 三者共同促進(jìn)氨基酸代謝, 從而促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生氨。此外, 在注射異亮氨酸24h后, 肌肉中AMPD基因相對(duì)表達(dá)量顯著性高于對(duì)照組, 而肝臟中GDH和GOT基因相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組沒(méi)有顯著性變化, 表明肌肉中嘌呤核苷酸循環(huán), 氧化分解仍然活躍, 促進(jìn)肌肉產(chǎn)生氨。通過(guò)注射異亮氨酸后比較鱖肝臟中GDH和GOT基因相對(duì)表達(dá)量隨時(shí)間變化發(fā)現(xiàn),GOT基因相對(duì)表達(dá)量隨時(shí)間變化無(wú)明顯差異, 而GDH基因相對(duì)表達(dá)量在4h顯著性升高, 隨后開始下降, 在24h降到最低, 相反的是對(duì)照組GDH基因相對(duì)表達(dá)量在24h顯著性升高。因此, 肝臟中氨基酸分解代謝活動(dòng)隨時(shí)間變緩, 是由于在異亮氨酸的作用下, mTOR信號(hào)通路激活, 促使下游信號(hào)通路分子核糖體S6蛋白磷酸化, 蛋白合成增加, 影響到肝臟中氨基酸代謝, 氨基酸分解代謝減弱。先前類似研究發(fā)現(xiàn), 支鏈氨基酸可以調(diào)節(jié)機(jī)體各種功能,很容易穿過(guò)血腦屏障, 在能量代謝和氮代謝中起到很重要的作用[42,43]。異亮氨酸作為支鏈氨基酸, 在大鼠的研究發(fā)現(xiàn), 異亮氨酸可以調(diào)節(jié)GDH從而影響代謝活動(dòng)[44]。在細(xì)胞上的研究也發(fā)現(xiàn), 氨基酸作為信號(hào), 促使mTOR信號(hào)通路下游信號(hào)分子磷酸化,進(jìn)而通過(guò)氧化脫羧和激活GDH活性調(diào)節(jié)線粒體代謝, 從而精準(zhǔn)的調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)[45,46]。氨基酸不僅是細(xì)胞信號(hào)分子, 而且是基因表達(dá)和蛋白磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子[47], 可通過(guò)mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)其下游分子的磷酸化, 進(jìn)而從翻譯水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)[48]。在本實(shí)驗(yàn)中, 異亮氨酸作為信號(hào)分子, 促使肝臟mTOR信號(hào)通路下游核糖體蛋白S6磷酸化,調(diào)節(jié)了鱖氮排泄基因的表達(dá), 從而影響了鱖氨氮排泄。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn), 氨基酸參與血糖的代謝調(diào)控,通過(guò)檢測(cè)血液葡萄糖含量發(fā)現(xiàn), 在腦室注射異亮氨酸后, 鱖血糖含量在0.5h顯著性降低, 表明異亮氨酸有降低血糖含量作用。在對(duì)小鼠進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn), 小鼠口服異亮氨酸, 在0.5h和1h后, 血糖含量顯著性降低, 異亮氨酸主要是通過(guò)刺激肌糖原的合成和促進(jìn)機(jī)體對(duì)葡萄糖的氧化, 從而降低血糖的水平[49], 并且這種作用機(jī)制主要是通過(guò)位于mTOR上游的PI3K(磷脂酰肌醇-3-激酶)信號(hào)傳導(dǎo)通路介導(dǎo)完成的[50]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn), 激素和生長(zhǎng)因子可活化PI3K(磷脂酰肌醇3激酶), 通過(guò)相應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制, 從而促使mTOR通路相關(guān)蛋白磷酸化[51]。此外, 在注射異亮氨酸4h后, 鱖血糖含量開始升高并且顯著性高于對(duì)照組, 可能異亮氨酸降低血糖作用具有時(shí)效性, 在短期內(nèi)異亮氨酸有降低血糖的作用。隨著時(shí)間推移, 機(jī)體其他代謝作用加強(qiáng)從而血糖含量升高,具體作用途徑有待進(jìn)一步探究。

綜上所述, 在本研究中, 腦室注射異亮氨酸后,激活鱖肝臟mTOR信號(hào)通路, 介導(dǎo)氨基酸代謝, 氮排泄基因轉(zhuǎn)錄水平升高, 鱖肝臟和肌肉中代謝活躍,促使鱖氨氮排泄。此外, 異亮氨酸能夠短時(shí)間內(nèi)降低血糖, 可能與PI3K(磷脂酰肌醇-3-激酶)信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān), 異亮氨酸在mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路與PI3K信號(hào)傳導(dǎo)通路之間的聯(lián)系仍需進(jìn)一步的研究。