孫 瑩,方偉佳,江連洲
(1.哈爾濱商業(yè)大學旅游與烹飪學院,黑龍江哈爾濱 150000;2.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030)
牛肉以它特有的風味和豐富的營養(yǎng)受到大眾喜愛,已躍居為銷量僅次于豬肉的第二大肉類產(chǎn)品。然而牛肉富含的蛋白質(zhì)和氨基酸,在為菜肴提升風味的同時,高溫處理也產(chǎn)生了雜環(huán)胺類有害物質(zhì),甚至誘發(fā)癌癥。流行病學研究表明,癌癥是國際公認的除心血管疾病后,人類的第二大死因,牛肉菜肴食品安全問題引發(fā)高度關注。Sugimurat等[1]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過高溫處理的魚制品和牛肉制品表面所含化合物有致突變性,可誘發(fā)癌癥,經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)這成分復雜的化合物中,雜環(huán)胺類化合物起主要作用。雜環(huán)胺是富含蛋白質(zhì)的食品在高溫下熱降解中生成的一類胺類化合物,屬于多環(huán)芳烴類,依據(jù)化學結構的不同,雜環(huán)胺分為氨基咪唑氮雜芳烴類(IQ型)和氨基咔啉類(非IQ型),如圖1和表1所示,兩大類是一種前致突變物,要經(jīng)過代謝活化才會表現(xiàn)出致癌、致突變性[2]。國際癌癥組織將雜環(huán)胺中MeIQx、PhIP、AαC、MeAαC和Trp-P-2列為2B級可能誘發(fā)人類癌癥的物質(zhì),將IQ列為2A級可能引起癌癥發(fā)生的物質(zhì)[3-4]。因此對牛肉菜肴中雜環(huán)胺的形成機理和抑制方法的研究,也逐漸成為熱點,引起公眾重視。目前的綜述中大多是在闡述肉制品中雜環(huán)胺的形成機理檢測方法和抑制措施,而對牛肉菜肴這類烹飪菜肴的闡述卻不夠完備,本文就牛肉菜肴中雜環(huán)胺的檢測方法和抑制措施進行詳細的闡述,再就常見檢測方法加以說明,最后對雜環(huán)胺的未來研究進展加以展望。
圖1 雜環(huán)胺的化學結構(A)IQ型和(B)非IQ型
表1 兩類雜環(huán)胺的化學名稱、簡寫和性質(zhì)
牛肉含有豐富的蛋白質(zhì)與氨基酸,還有一定量的肌酸或肌酐、糖類,這些是雜環(huán)胺形成的必要前提物質(zhì)[5]。牛肉菜肴在300 ℃以下烹制溫度時一般會生成氨基咪唑氮雜芳烴類雜環(huán)胺[6-9]。雜環(huán)胺的形成分為兩部分,如圖2所示:第一部分當溫度達到100 ℃時肌酸(肌酐)、氨基酸、己糖環(huán)化,脫水形成IQ型雜環(huán)胺共有的氨基咪唑結構,此部分也是IQ型雜環(huán)胺起致突變作用的結構。二是其余部分由美拉德反應生成的Strecker降解產(chǎn)物醛或相應席夫堿,丁間醇醛縮合將這兩部分連接[10];圖2為IQ型雜環(huán)胺和IQx型雜環(huán)胺形成機制,形成路徑的推測在MeIQx和7,8-DiMeIQx的鑒定中得到了證實。牛肉菜肴在300 ℃以上溫度時一般會生成氨基咔啉類雜環(huán)胺[11],高溫時主要發(fā)生的是蛋白質(zhì)和氨基酸的熱解,并生成許多反應碎片,這些碎片會凝結成新的雜環(huán)結構,并且自由基反應可能生成熱解誘變劑,從而生成氨基咔啉類雜環(huán)胺。非IQ型中的Norharman形成過程[12]如圖3所示,色氨酸經(jīng)Amadori重排后得到的五環(huán)糖形式的重排產(chǎn)物(ARP)經(jīng)脫水反應后,環(huán)氧孤對電子會促進脫水產(chǎn)物形成氧鎓離子。這種離子可經(jīng)歷兩種不同類型的反應形成β-咔啉:一種是脫水和形成共軛體系來保持自身穩(wěn)定,另一種是C-C斷裂后進行分子內(nèi)親核取代。這種非IQ型雜環(huán)胺可以在沒有肌酸(肌酐)存在下生成,并且對其他類型的雜環(huán)胺致突變性有一定增強作用,所以針對這種廣泛存在牛肉菜肴中的這一類雜環(huán)胺,還需進一步對其形成機理進行研究。
圖2 IQ型雜環(huán)胺形成途徑
圖3 通過色氨酸的Amadori重排產(chǎn)物形成Norharman的反應途徑
牛肉菜肴中雜環(huán)胺形成的機理由于雜環(huán)胺種類的增多而變得復雜,所以也有很多影響因素。影響牛肉菜肴中雜環(huán)胺含量的主要因素有牛肉種類、烹飪方式、熱量、質(zhì)量傳遞、pH、水活性、碳水化合物、游離氨基酸、肌酸、脂質(zhì)、脂質(zhì)氧化物和抗氧化劑[13]。
前體物的種類和含量的差異,會對雜環(huán)胺生成含量有影響。前體物包括蛋白質(zhì)、碳水化合物、游離氨基酸、肌酸、脂質(zhì)、脂質(zhì)氧化物和抗氧化劑。Pan[14]等實驗發(fā)現(xiàn)中國東北和西北牛肉同比其他地區(qū)牛肉雜環(huán)胺含量相對較高。Liao等[15]研究發(fā)現(xiàn)由于牛肉相對于雞鴨等肉屬于紅肉,在脂肪和游離氨基酸含量不同的情況下,對同樣烹飪加工方式下所得雜環(huán)胺含量也會產(chǎn)生影響。相同加工條件下,Szterk等[16]將牛的不同食用部位烤制,檢測雜環(huán)胺含量,得出結論牛肉不同部位所含產(chǎn)生雜環(huán)胺前體物(蛋白質(zhì)、氨基酸、核苷、葡萄糖)含量不同,烹飪后雜環(huán)胺含量也不相同,且與前體物含量相關性為0.78~0.99。Bordas[17]研究發(fā)現(xiàn),將牛肉肉汁中添加肌酸和氨基酸的含量就能顯著提高雜環(huán)胺的生成量。Lee[18]將不同氨基酸、單糖和肌酸加入到肉汁中,結果表明均對雜環(huán)胺含量提高有效果,且效果由強到弱分別為氨酰胺、酪氨酸、甘氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、核糖、葡萄糖、肌酐、果糖。由于不同地區(qū)喂養(yǎng)以及喂養(yǎng)方式差異,牛肉本身營養(yǎng)差異就千差萬別,而在前體物質(zhì)中,影響最大的為蛋白質(zhì)、肌酸、肌酐這三類,在相同烹飪加工條件下,牛肉原材料中這三類含量相對較高,則形成的雜環(huán)胺含量也相對較高。
不同的烹飪加工方式和加工條件對雜環(huán)胺形成會產(chǎn)生影響。張秀鳳[19]等分析油煎、烘烤和碳烤三種牛排加工方式,得出結論由于油煎直接與金屬表面接觸而產(chǎn)生較多雜環(huán)胺,且2-氨基-3,4,8-三甲基咪唑和[4,5-f]喹喔啉只在油煎加工方式中檢出;高溫烘烤使蛋白質(zhì)熱解產(chǎn)生較多雜環(huán)胺;碳烤直接與明火接觸,產(chǎn)生的雜環(huán)胺更多。Balogh等[20]通過研究得出結論,烹飪時間越長,溫度越高,雜環(huán)胺含量越多,其中以2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑[4,5-b]吡啶對烹飪溫度和時間的變化最為敏感。Dong等[21]在研究烹飪溫度和烹飪時間對牛肉餅兩類雜環(huán)胺含量影響得出結論,烹飪時間的延長,烹飪溫度的升高,都會造成牛肉餅雜環(huán)胺含量增加。總的來說,烹飪中溫度越高雜環(huán)胺含量也會隨之上升,當溫度從200 ℃升至300 ℃時,雜環(huán)胺的生成量可增加5倍,且烹飪時間在前5 min內(nèi)雜環(huán)胺含量上升最明顯,時間超過十分鐘雜環(huán)胺含量變化不再明顯,也就是說烹飪的時間越長,溫度越高,生成的雜環(huán)胺含量也會越高,并且致突變性增強。
脂肪與水分的含量一定程度上影響著雜環(huán)胺的形成。牛肉菜肴烹制過程中,脂肪起著導熱作用,脂肪含量越高,導熱效果越好,生成的雜環(huán)胺含量也越高。廖國周[22]指出脂肪除了導熱功能以外,也參與美拉德反應從而促進雜環(huán)胺生成。徐勇[23]研究發(fā)現(xiàn),相同烹飪條件下,脂肪含量為8%的瘦牛肉相比于15%的牛肉產(chǎn)生雜環(huán)胺含量相對較少,但是如果脂肪含量高于15%時,生成雜環(huán)胺的含量會相對減少。Hwang等[24]認為,當過量脂肪存在可以降低化學反應的活化能,同時稀釋了前體物濃度,所以超過一定含量的脂肪最終會相對減少雜環(huán)胺生成。牛肉菜肴中雜環(huán)胺產(chǎn)生的前體物質(zhì)都是水溶性的,當烹飪溫度升高時,水分蒸發(fā),牛肉菜肴中的前體物質(zhì)會隨著水分轉移到食物表面,與烹飪器具接觸的食物表面受到高溫的作用,會生成更多的雜環(huán)胺。Kikugava[25]研究發(fā)現(xiàn),菜肴中水分含量與雜環(huán)胺生成量成反比,水分含量越少,雜環(huán)胺生成量越高。也就是說,相對于炸、煎、烤、炒來說,煮制牛肉產(chǎn)生雜環(huán)胺最少。脂肪的存在一定程度上促進雜環(huán)胺的生成,達到一定量的脂肪由于稀釋前體物的作用大于導熱作用而使雜環(huán)胺反應減緩;水的存在會抑制雜環(huán)胺的生成,當水分蒸發(fā),前體物暴露在食物表面,在高溫作用下就會生成大量的雜環(huán)胺。
牛肉菜肴樣品前處理是指對菜肴樣品進行分解、提取、凈化、濃縮,將原本不利于檢測的形式轉變?yōu)榭蓽y定形式,用于接下來的定性與定量分析。由于牛肉菜肴成分復雜且雜環(huán)胺含量相對較低,因此選擇適當?shù)臉悠非疤幚磙k法可提高實驗結果的準確性。目前牛肉菜肴樣品前處理方法用的較多的為液液萃取、固相萃取、固相微萃取[26]。大多數(shù)實驗在提取第一步上通常選擇液液萃取作為粗提取,溶劑分為有機溶劑和無機溶劑兩大類,根據(jù)分析物性質(zhì)選擇溶劑類型后,若選擇有機溶劑,則萃取劑選擇鹽酸;若選擇無機溶劑,則萃取劑選擇有機溶劑,也可與吸附劑萃取相結合[26]。液液萃取作為初步處理后,還可進一步對牛肉菜肴樣品純化。Gross[27]提出的固相萃取法,在牛肉菜肴預處理上得到廣泛的應用。Mardones等[28]使用PRS萃取柱和C18萃取柱串聯(lián)對炸牛排進行固相萃取,得到的炸牛排預處理樣品為雜環(huán)胺的定性定量檢測做準備。Dong[29]等采用固相層析純化對油炸牛肉餅進行樣品預處理,提高實驗結果可靠性。相比于固相萃取,固相微萃取實驗操作時間短,方便快捷,重現(xiàn)性好。Lourdes Cárdenes[30]等將四種纖維涂層對比分析得出結論,在純化雜環(huán)胺效果上,由弱到強順序分別為PA(85 μm)、PDMS-DVB(60 μm)、CW-DVB(65 μm)和CW-TPR(50 μm),對牛肉菜肴前處理有一定的借鑒意義。
在牛肉菜肴中,雜環(huán)胺為痕量水平,加之牛肉菜肴成分復雜,烹飪過程影響因素較多,單一的光或電分析結果往往不夠準確,因此牛肉菜肴中雜環(huán)胺的檢測應用較靈敏的儀器且根據(jù)需要可進行串聯(lián)使用。常用的檢測方法有氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS)、高效液相色譜-紫外檢測法(HPLC-UV)、高效液相色譜-熒光檢測法(HPLC-FD)、毛細管電泳等[31]。
2.2.1 氣相色譜-質(zhì)譜法 氣質(zhì)聯(lián)用技術即將氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的分析技術。質(zhì)譜法可以對成分單一的化合物進行定性分析,但是對復雜化合物就束手無策,而氣相色譜法可對復雜化合物進行有效分離,彌補質(zhì)譜法的缺陷,將二者聯(lián)用便可達到對復雜化合物的高效、準確定性。呂慧超[32]等使DB-WAX毛細管柱的氣相色譜對三種不同模擬反應體系中燒烤的雜環(huán)胺含量檢測,得出結論三種模擬體系均可產(chǎn)生風味物質(zhì)。由于雜環(huán)胺大多為極性且不具揮發(fā)性,使用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測時,需要對樣品做衍生化處理,而這樣使得實驗繁瑣復雜,因此氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜并未得到廣泛的使用[33]。
2.2.2 高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術 相比氣相色譜,高效液相色譜有更廣泛的應用,由于電化學氧化性和紫外吸收性是雜環(huán)胺兩大特性,因此常將高效液相色譜法與光分析和電分析聯(lián)用[34]。高效液相色譜法不但可以成功地分離高極性、非揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定性的化合物,并且不需要衍生化程序。Jiyeong等[35]利用高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的方法研究特級初榨橄欖油對烤牛排中雜環(huán)胺形成的影響,表明2 g和4 g的特級初榨橄欖油對炸牛排雜環(huán)胺形成有抑制作用,但是超過這個量的橄欖油就會對雜環(huán)胺的形成起促進作用。Kyunghee等[36]研究低聚果糖和大蒜在炸牛肉餅中雜環(huán)胺含量的影響,使用Zorbox RX-C色譜柱的液相色譜技術與質(zhì)譜聯(lián)用技術,表明添加5 g或15 g的大蒜可使炸牛肉餅雜環(huán)胺含量下降14%~100%。姚瑤等[37]在研究不同種香辛料的抗氧化性對醬牛肉雜環(huán)胺含量影響時,利用高效液相色譜與紫外檢測和熒光檢測聯(lián)用技術,將空白組、對照組、香葉組三組對熒光和紫外光的吸收峰比較,得出結論香辛料的抗氧化性可降低醬牛肉中雜環(huán)胺的產(chǎn)生。高效液相色譜不僅具有準確性,而且可用到的檢測器也有很多,如紫外可見光譜儀熒光檢測器等。液相色譜與質(zhì)譜的結合就是結合了色譜的高分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度和高選擇性,若與高效液相色譜串聯(lián)為二級質(zhì)譜,分析效果更佳
美拉德反應過程中產(chǎn)生的吡啶和吡嗪等自由基可以促進雜環(huán)胺的產(chǎn)生,因此可利用抗氧化劑或者含有抗氧化成分的外源物質(zhì)清除自由基達到降低牛肉菜肴中雜環(huán)胺含量的作用。已有研究表明外源物主要如表2示,Ahyoung[38]研究韓國樹莓和洋蔥對煎牛肉餅雜環(huán)胺含量的影響,得出結論韓國樹莓中黃酮類化合物,單寧和酚酸的抗氧化成分可清除自由基對雜環(huán)胺反應的發(fā)生有一定的抑制作用,洋蔥的添加量在4 g時對雜環(huán)胺反應有一定的抑制作用,但當洋蔥添加量超過8 g時對雜環(huán)胺的產(chǎn)生卻有促進作用,因為過多的洋蔥中的糖類會進入雜環(huán)胺反應體系,促進雜環(huán)胺含量增加。楊瀟[39]研究煙熏液及五種多酚化合物對鹵煮牛肉雜環(huán)胺的抑制作用,實驗結果表明煙熏液及五種發(fā)多酚化合物對雜環(huán)胺均有抑制作用,且煙熏液及五種發(fā)多酚化合物含量越高,抑制效果越明顯,煙熏液與麥芽酚具有相同的抗氧化能力,但由于煙熏液本身含有一定量的雜環(huán)胺,所以抑制效果受到一定影響。Lee等[40]研究初級橄欖油對6種雜環(huán)胺有抑制作用;Puangsombat等[41]發(fā)現(xiàn)質(zhì)量分數(shù)為2%姜黃使雜環(huán)胺含量整體下降;Shin等[42]研究發(fā)現(xiàn),二烯丙基硫醚、烯丙基甲基硫醚、烯丙基硫醇的存在可顯著降低烹飪牛肉餅的雜環(huán)胺含量,由于含硫氨基酸有效抑制熱解氨基葡萄糖體系下的非酶促褐變反應,并且美拉德反應通過在含硫氨基酸中吸收硫醇的作用來抑制自由基產(chǎn)生,達到降低牛肉餅雜環(huán)胺含量作用[43]。聶文等[44]研究香蘭素和維生素C對鹵煮牛肉中雜環(huán)胺含量的影響,得出結論香蘭素和維生素C對鹵煮牛肉中的雜環(huán)胺都有一定抑制作用,并且維生素C的抑制作用高于香蘭素,因為維生素C清除自由基的能力高于香蘭素。秦川[45]研究八種黃酮類化合物對烤牛肉中雜環(huán)胺Ph IP的抑制作用,得出結論木犀草素抑制效果最差,根皮苷抑制效果最佳,且除了木犀草素以外其他七種黃酮類化合物均對烤牛肉中雜環(huán)胺Ph IP的形成有一定抑制作用。Britt等[46]研究發(fā)現(xiàn)在牛肉中添加櫻桃組織烹飪可降低雜環(huán)胺的產(chǎn)生,原因是櫻桃組織的酚類物質(zhì)清除美拉德反應生成的自由基。Quelhas[47]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)綠茶研制的牛肉烹制后,雜環(huán)胺含量降低。Rounds[48]也有類似研究,發(fā)現(xiàn)經(jīng)綠茶腌制的牛肉餡經(jīng)烹制后三種雜環(huán)胺含量明顯下降,都是由于綠茶的抗氧化性所致。在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)木槿、葡萄籽、石榴籽、綠茶[49-53]均對雜環(huán)胺有一定抑制作用。目前在對外源物的抑制作用的研究中,停留在香辛料、煙熏液,植物類提取物這三大類上,而這些研究還未證實自由基與雜環(huán)胺的產(chǎn)生直接的聯(lián)系,只是從實驗數(shù)據(jù)上證明添加外源抗氧化成分可以有效抑制自由基的產(chǎn)生并且降低雜環(huán)胺的含量,抑制原理還需進一步實驗證明。
表2 不同外源物添加對牛肉菜肴中雜環(huán)胺的抑制作用
牛肉菜肴烹飪中以300 ℃為界限,會生成兩類不同雜環(huán)胺;烹飪的時間和熱量的傳遞方式以及烹飪方式的選擇不同,雜環(huán)胺的產(chǎn)生會有所不同??傮w來說,雜環(huán)胺的含量會隨著烹飪溫度升高,烹飪時間延長而增加。Ahyoung[54]等研究烹飪時間和溫度對牛肉餅中兩類雜環(huán)胺含量影響,研究表明在230 ℃下煎制16 min牛肉餅,雜環(huán)胺含量會驟然上升。孟曉霞[55]等研究表明牛排中的雜環(huán)胺在油炸溫度低于150 ℃或者是烹飪時間少于2 min生成量較少。呂美[56]研究烘烤、微波和煎烤這三種烹飪方式下對于牛肉餅雜環(huán)胺含量的影響,由于雜環(huán)胺是在牛肉餅表面硬殼中形成,而微波加熱是從食物內(nèi)部加熱,表面并不會有很高的溫度,因此微波方式產(chǎn)生雜環(huán)胺含量較少。一般而言烹飪時間越長,烹飪溫度越高越易產(chǎn)生雜環(huán)胺,在所有烹飪方式中,長時間燒烤最容易產(chǎn)生雜環(huán)胺。
牛肉菜肴烹制過程中,脂肪起著導熱作用,脂肪含量越高,導熱效果越好,生成的雜環(huán)胺含量也越高,但當脂肪過量存在時可以降低化學反應的活化能,同時稀釋了前體物濃度,所以超過一定含量的脂肪最終會相對減少雜環(huán)胺生成;雜環(huán)胺產(chǎn)生的前體物質(zhì)都是水溶性的[57],當烹飪溫度升高時,水分蒸發(fā),牛肉菜肴中的前體物質(zhì)會隨著水分轉移到食物表面,與烹飪器具接觸的食物表面受到高溫的作用,會生成更多的雜環(huán)胺。Wang[58]研究發(fā)現(xiàn)添加大豆蛋白到牛肉餡餅中可以減少雜環(huán)胺的形成,原因是大豆蛋白增加了牛肉餡餅的持水量,水分的存在抑制了雜環(huán)胺的生成。Person等[59]研究發(fā)現(xiàn)向牛肉漢堡中添加一定量的NaCl或者三聚磷酸鹽,牛肉漢堡中部分雜環(huán)胺含量會下降,原因是鹽類的持水能力阻礙水向牛肉表面移動的作用,從而抑制雜環(huán)胺反應的發(fā)生。Johansson等[60]研究不同的6種脂肪對牛肉漢堡雜環(huán)胺形成的影響,結果發(fā)現(xiàn)其中人造黃油和葵花籽油兩種脂肪對雜環(huán)胺的形成有一定的抑制作用,因為多不飽和脂肪酸有一定的抗氧化能力,在美拉德反應中清除自由基,這種能力大于脂肪的導熱能力,因此最終結果還是減少了雜環(huán)胺的形成。
牛雜環(huán)胺普遍存在于牛肉菜肴中,而雜環(huán)胺的致癌性和致突變性嚴重威脅著人類的健康,牛肉菜肴的烹制過程中,若想完全不產(chǎn)生雜環(huán)胺是不現(xiàn)實的,但是可以最大可能的向著危害最低化發(fā)展,因此對雜環(huán)胺形成機理的探究,檢測方法的精進,抑制方法的成熟的進程不會停步。
形成機理:牛肉菜肴的烹制過程復雜,發(fā)生的反應繁多,在機理研究上應考慮交互作用。由于非IQ型雜環(huán)胺在沒有肌酸和肌酐的條件下依然可以進行,且反應溫度為家庭烹飪溫度,因此此類雜環(huán)胺更加普遍存在于牛肉菜肴中,并且要對非IQ型雜環(huán)胺形成機理進行更有深度的研究。目前的實驗大多研究直接加熱時雜環(huán)胺的形成機理,而忽略了間接熱對流如烘、烤等烹飪方式,且烹飪方法上多側重炸制和煎制,而在鹵制和煮制這樣的烹飪方法上,缺少對雜環(huán)胺形成機理的研究。
檢測方法:精準的儀器價格昂貴,因此檢測受到一定限制,往往產(chǎn)生結果不精準。利用高效液相色譜法檢測時,可通過改變流動相和固定相得到幾次純化來增加雜環(huán)胺的分離選擇性,分離的完全會提高檢測數(shù)據(jù)的準確可靠性。未來的檢測儀器還是會向著更精準的方向進行,所以在同時,由于雜環(huán)胺是微量物質(zhì),在前處理的方法上也要同步跟進。
抑制方法:目前的大多數(shù)實驗,都是停留在數(shù)據(jù)表面,如利用抗氧化物的外源物質(zhì)的添加來抑制自由基,而數(shù)據(jù)的下降只能說明抗氧化物對雜環(huán)胺形成有一定抑制作用,但是自由基是不是促進雜環(huán)胺形成的直接原因還是沒有確切說明。在抑制方法上,雜環(huán)胺種類很多,有些抑制方法會在降低一種雜環(huán)胺的同時升高另一種雜環(huán)胺的含量,不能只做單一檢測,要考慮交互影響及總體雜環(huán)胺的含量。
希望在未來,雜環(huán)胺的研究可以走向我國傳統(tǒng)牛肉菜肴的精準化、危害最小化、利益最大化。