地稔總黃酮的純化工藝研究

楊 菁，朱 丹，杜雨涵，謝 娟，蔣樂巧

(貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

地稔為野牡丹科植物地稔Melastoma dodecandrum Lour. 的干燥全草，又名土茄子、山辣茄、地腳稔、地枇杷等[1]。關(guān)于地稔的最早記載見于《嶺南采藥錄》中，是畬族、瑤族、苗族等一些少數(shù)民族的常用藥材[2]，主要分布在廣西、廣東、貴州、湖南、浙江、福建等地區(qū)[3]。地稔歸心、肝、脾、肺經(jīng)，性涼，味甘、澀，主要功效為活血止血、祛風(fēng)利濕、消腫祛瘀、清熱解毒。地稔全株供藥用，其果實可以食用，還可以用來釀酒，臨床主治發(fā)熱、水腫、疼痛、痢疾、癰瘡、黃疸、崩漏等病癥[4]。地稔的藥材資源豐富，使用范圍廣泛，臨床療效顯著，具有廣闊的開發(fā)利用前景。

地稔具有多種化學(xué)成分，其主要有效成分之一為黃酮類化合物。目前對地稔的研究主要集中在化學(xué)成分、藥理作用、營養(yǎng)保健等方面，且對其中的黃酮類化合物僅有部分化學(xué)成分及藥理作用的報道，其綜合開發(fā)利用還處于空白階段。因此，本文以地稔的總黃酮作為提取物，研究其純化工藝，可為中藥制劑、保健食品和化工產(chǎn)品的原料開發(fā)提供參考依據(jù)，也為該藥材進(jìn)入國際國內(nèi)市場奠定堅實的基礎(chǔ)。

1 試藥與儀器

1.1 試藥

藥材產(chǎn)于貴州省龍里縣羊場鎮(zhèn)，經(jīng)鑒定為地稔Melastoma dodecandrum Lour. 的干燥全草；聚酰胺(浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠)、D101型、AB-8 型、X-5 型、CAD-40 型、AP-20 型大孔吸附樹脂(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；蘆丁對照品(貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司，批號：GZDD-0001，>98%)；其它試劑均為分析純。

1.2 儀器

紫外-可見分光光度計(上海元析儀器有限公司，UV-5900型)；分析天平(奧豪斯儀器有限公司，EX2250ZH型)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠，RE-52AA型)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州朗越儀器制造有限公司，SYG-2型)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司，101-1AB型)。

2 方法與結(jié)果

2.1 地稔總黃酮的含量測定[5]

稱取于105 ℃干燥至恒重的蘆丁對照品適量，加入60%乙醇溶解并定容，配制得濃度為0.5000 mg/mL的對照品溶液。

分別精密移取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL對照品溶液，置于25 mL容量瓶中，依次加入6% NaNO2溶液0.6 mL、8% Al(NO3)3 溶液1.0 mL、2% NaOH溶液4.0 mL，加水定容顯色15 min，于500 nm波長處測定吸光度。以濃度(C)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得標(biāo)準(zhǔn)方程為A=11.614C+0.0266，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998。表明蘆丁對照品的濃度(C)在0.01～0.07 mg/mL范圍內(nèi)，與吸光度(A)呈良好的線性關(guān)系。

2.2 上樣液的制備

稱取地稔粉末5 g，置圓底燒瓶中，加60% 乙醇500mL，加熱回流1 h，抽濾，回收乙醇，濃縮至體積為20 mL，即得總黃酮質(zhì)量濃度約為9 mg/mL 的樣品溶液。

2.3 樹脂型號的確定

2.3.1 靜態(tài)吸附試驗

分別稱取預(yù)處理好的各型號樹脂10 g，置100 mL錐形瓶中，加入質(zhì)量濃度為1.60 mg/mL的地稔總黃酮濃縮液50 mL，密塞，于室溫條件下靜置吸附24 h，過濾，測定濾液中的總黃酮質(zhì)量濃度(mg/mL)，計算各型號樹脂的吸附量(mg/g)及吸附率(%)，結(jié)果見表1。

2.3.2 靜態(tài)解吸試驗

分別將2.3.1試驗中吸附飽和的各型號大孔吸附樹脂加入95% 乙醇50 mL，密塞，于室溫條件下靜置解吸24 h，過濾，測定濾液中的總黃酮質(zhì)量濃度(mg/mL)，計算各型號樹脂的解吸率(%)，結(jié)果見表1。

表1 各型號樹脂的吸附及解吸情況

由表1可知：各型號大孔吸附樹脂對地稔總黃酮均有一定的吸附性，其中以D101型大孔吸附樹脂的吸附量及吸附率最佳。此外，D101型大孔吸附樹脂的解吸率也明顯優(yōu)于其他5 種型號。因此，選取D101型大孔吸附樹脂作為研究地稔總黃酮純化工藝的樹脂。

2.4 地稔總黃酮的純化工藝考察

2.4.1 上樣液pH值的考察

以上樣液的pH值為基準(zhǔn)，分別用1 mol/L的HCl溶液或1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)上樣液pH值，使其分別為1.75、3.71(原液)、5.51、7.49、9.74。用不同pH值的溶液分別上樣，收集經(jīng)樹脂吸附后的溶液，計算吸附率(%)，結(jié)果見圖1。

圖1 各pH值上樣液對吸附率的影響

由圖可知，隨著上樣液pH 值的增加，吸附率總體呈先增大后減小的趨勢。當(dāng)上樣液的pH 值為3.71時，吸附率最大為57.31 %。而后隨著上樣液 pH值的增大，吸附率明顯降低。因此，選取 3.71為最佳上樣液 pH值，即用原溶液上樣。

2.4.2 上樣液質(zhì)量濃度的考察

取6份質(zhì)量濃度為9.15 mg/mL的上樣液各20 mL，除第1份外，其余分別用蒸餾水稀釋至40、60、80、100、120 mL。使6份上樣液中總黃酮的質(zhì)量濃度分別為9.15、4.58、3.05、2.29、1.83、1.53 mg/mL，分別上樣，收集吸附后的溶液，計算吸附率(%)，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，隨著上樣液質(zhì)量濃度的增加，吸附率總體呈先增大后減小的趨勢。當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度為3.05 mg/mL時，吸附率最大為75.89%，而后吸附率大幅降低。因此，選取3.05 mg/mL為最佳上樣液質(zhì)量濃度。

圖2 各濃度上樣液對吸附率的影響

2.4.3 樹脂床徑高比

取預(yù)處理好的D101型大孔吸附樹脂，裝柱，使徑高比分別為1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8，備用。分別取5份已確定最佳質(zhì)量濃度的上樣液上樣，收集吸附后的溶液，計算吸附率(%)，結(jié)果見圖3。

圖3 各樹脂床徑高比對吸附率的影響

由圖3可知，隨著樹脂床徑高比的增大，吸附率總體呈先增大后減小的趨勢。當(dāng)樹脂床徑高比為1∶6時，吸附率最大為75.79%。因此，選取1∶6為樹脂床徑高比。

2.4.4 上樣液體積的考察

取預(yù)處理好的D101型大孔吸附樹脂，按最佳樹脂床徑高比裝柱，備用。取上樣液上樣，收集吸附后的溶液，每10 mL接取1管。測定每管收集液中的總黃酮質(zhì)量濃度(mg/mL)，繪制上樣吸附泄露曲線，結(jié)果見圖2。

圖4 大孔吸附樹脂上樣吸附泄漏曲線

由圖4可知，最初由于大孔吸附樹脂吸附不完全，吸附后溶液中的總黃酮質(zhì)量濃度偏高；隨后當(dāng)上樣量處于60～120 mL范圍內(nèi)時，吸附后溶液中的總黃酮質(zhì)量濃度趨于穩(wěn)定。當(dāng)上樣量超過120 mL時，流出液中的總黃酮質(zhì)量濃度開始上升，此時D101型大孔吸附樹脂對總黃酮的吸附能力已達(dá)最大值。而后大孔吸附樹脂吸附能力下降，上樣液中的總黃酮開始泄漏。為保證樹脂吸附能力及純化效果，故選取120 mL為最佳上樣量。

2.4.5 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)的考察

分別取5份上樣液各120 mL上樣，待其吸附完全，用蒸餾水洗脫至流出液呈無色，再分別用體積分?jǐn)?shù)為30%、45%、60%、75%、95% 的乙醇各100 mL洗脫，收集解吸后溶液，計算解吸率(%)。再分別取各溶液10 mL于干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，置105 ℃烘箱中干燥3 h，測定浸膏重量(g)，計算總黃酮的純度(%)，結(jié)果如下。

表2 各體積分?jǐn)?shù)洗脫劑的解吸率及總黃酮純度

由表2可知，隨著洗脫劑體積分?jǐn)?shù)的增加，解吸率及解吸后溶液中的總黃酮純度逐漸增大。洗脫劑體積分?jǐn)?shù)過小時，只有少部分總黃酮被解吸出來，且解吸后溶液中的總黃酮純度較低。當(dāng)洗脫劑體積分?jǐn)?shù)為95%時，解吸率及解吸后溶液中的總黃酮純度最大。因此，選取95% 為最佳洗脫劑體積分?jǐn)?shù)。

2.4.6 洗脫劑體積的考察

取上樣液120 mL，上樣，待其吸附完全，用蒸餾水洗脫至流出液呈無色，再用體積分?jǐn)?shù)為95% 的乙醇洗脫，收集解吸后溶液，每10 mL接取1管。測定每管溶液中的總黃酮質(zhì)量濃度(mg/mL)，繪制洗脫曲線，考察洗脫劑體積，結(jié)果見圖5。

圖5 不同洗脫劑體積的考察

由圖5可知，不同體積洗脫劑的洗脫曲線峰型集中，在第2管，即加入20 mL洗脫劑后，洗脫出的總黃酮的量達(dá)到最高值；在加入100 mL洗脫劑后，總黃酮基本洗脫完全。因此，選取100 mL為洗脫劑的體積。

2.5 最佳純化工藝驗證

按照優(yōu)選的地稔總黃酮最佳純化工藝，對該工藝進(jìn)行驗證試驗，試驗結(jié)果見表3。

表3 最佳純化工藝驗證

由表3可知，在最佳工藝條件下，純化得到地稔總黃酮平均純度達(dá)50% 以上，且該工藝穩(wěn)定。

3 討論

在研究地稔總黃酮的純化工藝之前，課題組運用單因素試驗法和正交試驗法，優(yōu)選出了地稔中總黃酮成分的最佳提取工藝，并初步建立了穩(wěn)定可靠的含量測定方法，為地稔總黃酮的大孔吸附樹脂純化工藝研究奠定基礎(chǔ)。