HPLC-MS/MS法測(cè)定2017-2018年淮安地區(qū)小龍蝦中硝基呋喃類代謝物殘留量

吳 旭，卜媛 媛

（淮安市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇 淮安 223300）

硝基呋喃類抗生素因具有抑菌性和殺菌性，曾廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中傳染病的預(yù)防和治療[1]。主要包括呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因四種，而其對(duì)應(yīng)的代謝產(chǎn)物3-氨基-2-噁唑烷基酮(AOZ)、5-甲基嗎啉-3-氨基-2-噁唑烷基酮(AMOZ)、氨基脲(SEM)、l-氨基-2-內(nèi)酰脲(AHD)都能與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定的殘留物，殘留時(shí)間達(dá)數(shù)周以上，甚至在蒸煮、微波加熱等情況下仍然無(wú)法降解。研究表明硝基呋喃類抗生素及其代謝產(chǎn)物對(duì)人體有潛在毒理性危害。歐盟將其列為A類禁用藥物[2],且在2005年時(shí)又禁止在人類和動(dòng)物中使用；美國(guó)在2002年將其禁用于食源性動(dòng)物；日本也規(guī)定牛肉、豬肉、禽肉、蝦肉都不得檢出抗生素；我國(guó)農(nóng)業(yè)部在2002年頒布禁令禁止將硝基呋喃類藥物用在食源性動(dòng)物身上。

江蘇省淮安市盱眙縣有著”中國(guó)龍蝦之都”的美譽(yù),自2001年至今,已舉辦了18界龍蝦節(jié)。盱眙境內(nèi)年產(chǎn)龍蝦10萬(wàn)噸，年交易量15萬(wàn)噸，交易額突破60億元。如今，盱眙80萬(wàn)人中有10萬(wàn)余人在龍蝦產(chǎn)業(yè)鏈上淘金，龍蝦已經(jīng)成為盱眙縣的支柱產(chǎn)業(yè)。

但是一些養(yǎng)殖場(chǎng)高密度飼養(yǎng)、養(yǎng)殖污水不處理等，導(dǎo)致疫病的爆發(fā)，為了預(yù)防和治療病害，養(yǎng)殖戶違法使用了硝基呋喃類抗生素。本研究通過(guò)對(duì)淮安地區(qū)小龍蝦產(chǎn)品中，硝基呋喃類代謝產(chǎn)物的殘留量檢測(cè)，為該地區(qū)小龍蝦中違禁藥物使用情況進(jìn)行調(diào)查，以促進(jìn)小龍蝦產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，保障人民的食品安全。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

AOZ、SEM、AMOZ、AHD，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測(cè)；D5-AMOZ，13C15N-SEM，13C3-AHD，D4-AOZ，北京曼哈格生物科技有限公司；2-硝基苯甲醛，純度99%以上，Sigma公司；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二甲亞砜等均為色譜純，鹽酸、K2HP04、NaOH等均為分析純；水為Milli-Q制備的超純水；pH精密試紙(4.5-10.0)。

API4000+超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（沃特世公司），C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm，沃特世公司），XS205DU電子天平（METTLER TOLEDO公司）。

1.2 色譜條件

流速：0.2 mL/min；柱溫：30℃，進(jìn)樣體積2 μL。流動(dòng)相：A相0.1%甲酸水溶液；B乙腈,采用梯度洗脫，洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫條件

1.3 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離源（ESI+）；檢測(cè)方式：多選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)；CAD：4V；CUR：30 psi；GS1：50 psi；GS2：50 psi；霧化電壓：5500 V；離子傳輸溫度：500 ℃。的質(zhì)譜條件見(jiàn)表2。

表2 質(zhì)譜條件

2 樣 品

2.1 樣品來(lái)源

淮安地區(qū)各農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和水產(chǎn)養(yǎng)殖廠抽樣的小龍蝦共計(jì)83批,覆蓋淮安所有地區(qū)，采樣時(shí)間為小龍蝦生產(chǎn)季節(jié)（5～8月份），每批抽樣小龍蝦產(chǎn)品隨機(jī)采集5份樣品，每份樣品1000 g。

2.2 取樣方式

采樣組織為蝦頭、蝦殼和蝦肉、清洗整蝦和未清洗整蝦。因小龍蝦個(gè)體較小，每次用20只小龍蝦組織，混合制樣。

2.3 樣品制備

提?。悍Q取均勻試樣（2g）于50 mL棕色具塞離心管中，加入10mL甲醇-水混合液（2+1），均質(zhì)1 min，再用5 mL甲醇-水洗滌均質(zhì)器刀頭，二者合并4000 r/min離心5 min，吸取上清液棄掉。向每個(gè)樣品管中加入混合內(nèi)標(biāo)溶液，使最終測(cè)定濃度均為2.0 ng/mL。

水解和衍生：向上述每個(gè)離心管中加入10 mL0.2 mol/L鹽酸溶液均質(zhì)1min，用10mL 0.2mol/L鹽酸溶液洗滌均質(zhì)器刀頭，二者合并后加入0.3 mL0.0 5mol/L2-硝基苯甲醛溶液，用液體混勻器混勻，置恒溫水浴振蕩器中37℃避光振蕩16 h。

凈化:取出離心管冷卻至室溫，加人5mL0.1mol/L磷酸氫二鉀溶液，用1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.4，4000 r/min離心10min，上清液倒入下接Oasis HLB柱的貯液器中，使樣液以＜2 mL/min的流速通過(guò)Oasis HLB柱，待樣液全部通過(guò)Oasis HLB柱后用10 mL水洗滌Oasis HLB柱，棄去流出液。用真空泵在65 kPa負(fù)壓下抽干Oasis HLB柱15 min。用5 mL乙酸乙酯洗脫被測(cè)物于25 mL棕色離心管中，用氮吹儀在40℃水浴中吹干，用樣品定容溶液溶解并定容至1.0 mL，過(guò)0.2 μm濾膜用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。同時(shí)做空白試驗(yàn)。

3 結(jié)果與討論

3.1 結(jié)果比較

2017年淮安地區(qū)小龍蝦產(chǎn)品40批，2018年43批，共計(jì)83批，結(jié)果見(jiàn)表3。在這兩年中呋喃西林仍然存在違規(guī)用藥情況，2017年檢出率62%，2018年檢出率63%，而呋喃唑酮、呋喃它酮和呋喃妥因均未有檢出。

表3 2017～2018年淮安地區(qū)小龍蝦產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量檢測(cè)結(jié)果

本方法中AOZ、AMOZ、SEM、AHD的檢出限均為0.50μg/kg，四種代謝物加標(biāo)回收率70%～106%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD≤10%，符合國(guó)內(nèi)外相關(guān)規(guī)定要求。

3.2 SEM問(wèn)題

在檢測(cè)中，很多樣品都檢測(cè)出了陽(yáng)性的SEM，空白時(shí)SEM的檢出率在10%以下，濃度在0.21μg/kg左右。

將小龍蝦的蝦頭、蝦殼和蝦肉分別檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在蝦殼中SEM的含量最高，蝦肉中SEM含量只是整蝦的1/10，見(jiàn)圖1?？梢?jiàn)SEM檢測(cè)結(jié)果和取樣的組織部位有很大關(guān)系。

圖1 小龍蝦各部分中SEM含量

將同一批蝦清洗和未清洗分別檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)未清洗的SEM含量是清洗過(guò)后的1.1倍，可見(jiàn)在養(yǎng)殖的水體[3]和池塘的底泥[4]中可能也含有呋喃西林，見(jiàn)表2。

表2 清洗與為清洗的小龍蝦全蝦中SEM的含量

4 結(jié) 論

本文采用HPLC-MS/MS法測(cè)定2017-2018年淮安地區(qū)小龍蝦中硝基呋喃類代謝物的殘留量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了SEM外，其他代謝物都沒(méi)有檢出，說(shuō)明四種硝基呋喃類藥物中，之前在水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的呋喃唑酮已得到有效控制，但是呋喃西林的使用有增無(wú)減。而樣品的取樣部位對(duì)SEM的結(jié)果影響很大，處理樣品時(shí)務(wù)必混合均勻，同步做好空白實(shí)驗(yàn)進(jìn)行比較。同時(shí)也要注意SEM的假陽(yáng)性問(wèn)題，對(duì)于SEM是不是由小龍蝦蝦殼中自身產(chǎn)生，還有待進(jìn)一步研究，所以SEM的定性也是檢測(cè)的一大難點(diǎn)。簡(jiǎn)單的從SEM的測(cè)定結(jié)果上就判斷使用了呋喃西林違禁藥品，也有失公允。