史旭洋 錢 程 劉 艷 劉心同 尚 鑫 劉 碩劉禹廷 于藴波 張 軍 任曉冬*

1(吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 長(zhǎng)春130012) 2(吉林省公安廳物證鑒定中心， 長(zhǎng)春 130000)

1 引 言

木質(zhì)纖維素是自然界上最豐富的自然資源，利用木質(zhì)纖維素可以生產(chǎn)多種生物化工產(chǎn)品。目前，農(nóng)業(yè)廢棄物秸稈、麥稈等的處理成為影響環(huán)境和生態(tài)的重大問(wèn)題。通過(guò)生物煉制的手段將秸稈、麥稈等木質(zhì)纖維素制成生物化工產(chǎn)品，是秸稈高效轉(zhuǎn)化的重要途徑[1]。利用木質(zhì)纖維素進(jìn)行生物煉制，首先需要對(duì)木質(zhì)纖維素進(jìn)行糖化，將木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖等單糖后，再通過(guò)發(fā)酵將葡萄糖轉(zhuǎn)化成生物化工產(chǎn)品[2]。木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素3種成分組成，其中半纖維素和木質(zhì)素相互纏繞，將纖維素包裹起來(lái)形成一種相互纏繞的結(jié)構(gòu)，這種復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)使木質(zhì)纖維素可以有效抵抗外部環(huán)境。在進(jìn)行生物煉制時(shí)，這種特性使得纖維素酶降解纖維素的效率降低[3]。因此，在利用木質(zhì)纖維素時(shí)，需要對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理，打開(kāi)纖維素、半纖維素和木質(zhì)素相互纏繞的結(jié)構(gòu)，以提高纖維素酶的水解效率。目前，工業(yè)上使用的預(yù)處理方法主要有H2SO4、NaOH、CaO和H2O2處理等方法[4]。其中H2SO4等稀酸溶液在預(yù)處理過(guò)程中主要是破壞秸稈中的半纖維素成分，通過(guò)溶解部分半纖維素，從而打開(kāi)秸稈本身纖維素、半纖維素和木質(zhì)素相互纏繞的結(jié)構(gòu)；NaOH、CaO和H2O2等堿性溶液主要是破壞秸稈中木質(zhì)素成分，從而破壞秸稈原有的結(jié)構(gòu)。

本研究采用不同方法對(duì)玉米秸稈進(jìn)行預(yù)處理，分別用掃描電鏡、傅里葉變換紅外光譜和X-射線衍射對(duì)預(yù)處理的秸稈進(jìn)行分析，探討了不同的預(yù)處理方式對(duì)秸稈結(jié)構(gòu)的影響。對(duì)不同方式預(yù)處理的秸稈進(jìn)行了纖維素酶酶解效率評(píng)價(jià)，為利用玉米秸稈生產(chǎn)生物化工產(chǎn)品提供了理論依據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

1200 Series高效液相色譜儀(德國(guó)安捷倫公司); FEI Quanta200掃描電鏡(荷蘭FEI公司)；Shimadzu IRPrestige-21 傅里葉變換紅外光譜儀(日本島津公司)；Bruker D8 晶體衍射儀(XRD，德國(guó)布魯克公司)；HZ-8802S 水浴恒溫振蕩器(上海智誠(chéng)公司)；722E型可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海光譜公司)；標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)于自Sigma-Aldrich公司；H2SO4、NaOH、CaO和H2O2等試劑均為優(yōu)級(jí)純；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。玉米秸稈為吉林省種植的玉米的秸稈。

2.2 秸稈的預(yù)處理

秸稈的預(yù)處理參照文獻(xiàn)[4]的方法。向500 mL搖瓶中加入30 g玉米秸稈，分別加入60 mL 10% (m/V) H2SO4、60 mL 10% (m/V)NaOH或12 g CaO，加水至總體積為300 mL，使H2SO4、NaOH或CaO的終濃度分別為2%、2%和4%。用封口膜封口，121℃ 反應(yīng)1 h；另向500 mL搖瓶中加入30 g秸稈，之后加入20 mL 30% H2O2，加水至總體積為300 mL，即H2O2的終濃度為2%，用5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)至pH 11.5，然后在65℃水浴搖床中搖振3 h。在500 mL搖瓶中加入30 g秸稈，加水至總體積為300 mL，煮沸1 h。

待上述各反應(yīng)體系溫度降至室溫后，用八層紗布過(guò)濾預(yù)處理液，用去離子水沖洗處理后的秸稈，室溫晾干后，——20℃保存，備用。

2.3 成分分析

玉米秸稈中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的含量按美國(guó)能源部可再生能源實(shí)驗(yàn)室(NREL)的方法測(cè)定[5]。

2.4 電鏡觀察

取少量預(yù)處理后的樣品，分別烘干、粉碎、過(guò)篩，用導(dǎo)電雙面膠帶固定在樣品臺(tái)上，在真空環(huán)境下進(jìn)行鍍金處理，物料表面形成一層導(dǎo)電膜后，用掃描電子顯微鏡(SEM)進(jìn)行觀察。

2.5 傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)分析

取預(yù)處理后的樣品，以 1∶100 比例同KBr混勻后，在瑪瑙研缽中研磨至200～300目粉末，于紅外壓片機(jī)上制成透明薄片，利用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行測(cè)試，波數(shù)掃描范圍為4000～400 cm——1，分辨率為4 cm——1，單一樣品共進(jìn)行32 次累加。

2.6 X-射線衍射分析

取預(yù)處理后的樣品，用Bruker D8 晶體衍射儀進(jìn)行纖維素的結(jié)晶度分析。其中，掃描范圍 10°～50°(2θ)，掃描速度 2°/min，掃描電壓30 kV，掃描電流30 mA。樣品的結(jié)晶度(CrI)采用公式(1)計(jì)算：

CrI(%) =[(I002-Iam)/I002]×100

(1)

式中，I002為 002 晶格衍射角的峰值，即結(jié)晶區(qū)的衍射強(qiáng)度；Iam為無(wú)定形區(qū)域衍射強(qiáng)度峰值。

2.7 纖維素酶酶解反應(yīng)

取含1.2 g纖維素的上述預(yù)處理秸稈，加入pH 5.0的50 mmol/L檸檬酸緩沖液和15 FPU/(g 纖維素)的纖維素酶，補(bǔ)加水至40 mL。置于水浴搖床上，50℃以130 r/min酶解72 h，每12 h 取樣一次，離心，取上清液。利用高效液相色譜儀，采用伯樂(lè)Aminex HPX-87H柱測(cè)定葡萄糖濃度。高效液相色譜條件為： 柱溫65℃，用0.005 mol/L H2SO4以0.6 mL/min的流速洗脫。

3 結(jié)果與討論

3.1 不同預(yù)處理方式對(duì)秸稈成分的影響

秸稈中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素三者之間復(fù)雜的結(jié)構(gòu)關(guān)系，嚴(yán)重阻礙了纖維素酶對(duì)纖維素的可及性，從而降低了纖維素酶水解產(chǎn)率。因此,需要采用化學(xué)和物理方法對(duì)秸稈進(jìn)行預(yù)處理，盡可能除去秸稈中的木質(zhì)素和半纖維素，打破秸稈原有的結(jié)構(gòu)，從而提升酶解效率[6]。采用不同方式預(yù)處理的秸稈成分如表1所示。經(jīng)過(guò)不同方式預(yù)處理后，秸稈的纖維素含量均上升，而木質(zhì)素含量均下降。H2SO4預(yù)處理后秸稈的纖維素含量最高，達(dá)59.8%，木質(zhì)素含量為16.8%。NaOH預(yù)處理后，纖維素含量為52.1%， 木質(zhì)素含量?jī)H為8.3%。CaO和堿性H2O2處理后，纖維素含量分別為41.5%和49.9%，木質(zhì)素含量分別為14.7%和13.0%。相比于其它預(yù)處理方法，H2SO4預(yù)處理后， 半纖維素含量下降最大(22.6%)，表明H2SO4預(yù)處理可有效去除半纖維素。熱水預(yù)處理后，秸稈成分變化不明顯。在所有預(yù)處理方式中，NaOH去除木質(zhì)素效果最好。在利用纖維素酶水解秸稈時(shí)，木質(zhì)素會(huì)吸附纖維素酶，從而降低纖維素酶對(duì)纖維素的有效降解。通過(guò)預(yù)處理去除木質(zhì)素，有利于提高纖維素酶對(duì)纖維素的降解效率。

表1 采用不同方式預(yù)處理后秸稈的成分分析

Table 1 Composition of corn stover pretreated with different methods

預(yù)處理方法Pretreatmentmethod纖維素Cellulose(%)半纖維素Hemicellulose(%)木質(zhì)素Lignin(%)H2SO4 59.822.616.8NaOH 52.130.28.3CaO 41.532.614.7H2O2 49.929.113.0熱水 Hot water38.730.818.8未處理Untreated35.835.319.1

3.2 電鏡分析

利用掃描電鏡觀察到預(yù)處理后秸稈表面結(jié)構(gòu)和形貌的變化，如圖1F所示，未處理的秸稈表面被蠟質(zhì)成分緊密包裹，十分光滑。稀H2SO4處理后(圖1A)，秸稈整齊、緊密的長(zhǎng)管結(jié)構(gòu)被打亂和切斷，這是由于秸稈中的大部分半纖維素被稀酸水解[7]，秸稈的部分結(jié)構(gòu)被破壞所致。NaOH 處理后的秸稈如圖1B所示，由于NaOH溶解后，很多木質(zhì)素被去除[8]，秸稈表面變得粗糙不平，而且表面結(jié)構(gòu)有大片明顯塌陷，部分纖維素被剝離，呈片狀結(jié)構(gòu)。圖1C為堿性H2O2預(yù)處理后的秸稈，可以看出，由于部分木質(zhì)素的去除，出現(xiàn)很多的“碎片”。 圖1D為CaO預(yù)處理后的秸稈，相比NaOH處理和堿性H2O2處理，CaO處理對(duì)木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)的改變不明顯，因?yàn)槟举|(zhì)素脫除效果不佳，秸稈表面結(jié)構(gòu)未出現(xiàn)明顯的坍塌情況。圖1E為熱水處理后的秸稈結(jié)構(gòu)圖，秸稈表面出現(xiàn)凹形小孔，而秸稈的長(zhǎng)管結(jié)構(gòu)未被切斷，表面也沒(méi)有出現(xiàn)大片的明顯塌陷。

圖1 不同方法預(yù)處理后秸稈的電鏡圖： (A) H2SO4預(yù)處理后的秸稈； (B)NaOH預(yù)處理； (C)堿性H2O2預(yù)處理后； (D)CaO預(yù)處理后的秸稈； (E)熱水處理； (F)未處理的秸稈Fig.1 Scanning electron microscopy (SEM) images of corn stove pretreated with (A) H2SO4; (B) NaOH; (C) H2O2; (D) CaO; (E) hot water; (F) SEM image of untreated corn stover

3.3 傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

利用傅里葉變換紅外光譜對(duì)不同預(yù)處理的秸稈進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示。預(yù)處理和未處理秸稈紅外吸收峰的主要差異在于某些特征峰的增強(qiáng)、減弱或者消失，這表明采用不同預(yù)處理方法后，秸稈各成分的分子結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)或排列發(fā)生了變化。

圖2 不同預(yù)處理方式秸稈的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.2 Fourier transform-infrared (FT-IR) spectra of corn stover pretreated with different methods

3.4 X-射線衍射分析結(jié)果

纖維素中存在結(jié)晶區(qū)和無(wú)定形兩種區(qū)域， 結(jié)晶區(qū)占纖維素整體的百分率稱為纖維素的結(jié)晶度。纖維素的結(jié)晶度是衡量纖維素性能的重要指標(biāo)，反映纖維素聚集時(shí)形成結(jié)晶的程度[11]。利用XRD技術(shù)分析預(yù)處理后的秸稈，比較預(yù)處理前后秸稈結(jié)晶度變化，考察各種預(yù)處理方法的效果。經(jīng)過(guò)不同的預(yù)處理后，由于秸稈中一些成分去除，秸稈結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，結(jié)晶度也發(fā)生改變。如表2所示，NaOH、堿性H2O2和CaO這3種堿性方式預(yù)處理秸稈后， 秸稈的結(jié)晶度分別為40.5%、35.4%和14.2%。其中， NaOH處理的秸稈結(jié)晶度上升幅度最大。NaOH處理秸稈后，由于半纖維素和木質(zhì)素這兩種無(wú)定形區(qū)組分的溶出，使得纖維素含量增加，從而使整體結(jié)晶度大大提高[12]。而堿性H2O2和CaO的堿性比NaOH低，因此預(yù)處理后秸稈結(jié)晶度提升不大。H2SO4預(yù)處理秸稈后會(huì)引起纖維素基質(zhì)的部分重結(jié)晶， 因此秸稈的結(jié)晶度得到明顯提升[13]。由表2可見(jiàn)，H2SO4預(yù)處理后秸稈的結(jié)晶度最高(43.4%)，結(jié)晶度的增加可能是由于H2SO4去除了部分木質(zhì)素和較多的半纖維素成分(表1)，使秸稈纖維結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，有序度增加，形成比較完整的結(jié)晶晶格，因此結(jié)晶度提高。熱水預(yù)處理后秸稈的結(jié)晶度變化不明顯(25.4%)，表明熱水預(yù)處理對(duì)秸稈的結(jié)構(gòu)改變很小，其結(jié)晶度未發(fā)生明顯改變。

表2 不同預(yù)處理后秸稈的結(jié)晶度

Table 2 Crystalline of corn stover pretreated with different methods

預(yù)處理方法Pretreatment method結(jié)晶度Crystalline (%)1H2SO4 43.42NaOH 40.53CaO 14.24H2O2 35.45熱水 Hot water25.46未處理 Untreated22.3

圖3 不同方法預(yù)處理后的秸稈的纖維素酶降解結(jié)果Fig.3 Enzymatic hydrolysis of pretreated corn stovers hydrolyzed with cellulase

3.5 纖維素酶酶解分析

在利用秸稈進(jìn)行生物化工產(chǎn)品生產(chǎn)的過(guò)程中，需將秸稈進(jìn)行酶解，這是秸稈利用的基礎(chǔ)；為了提高秸稈的酶解效率，需要采用不同的預(yù)處理方法對(duì)秸稈進(jìn)行處理，從而打開(kāi)秸稈本身的結(jié)構(gòu)。本研究以不同方式預(yù)處理的秸稈為底物，用纖維素酶進(jìn)行酶解，評(píng)價(jià)預(yù)處理效果。酶解結(jié)果如圖3所示，不同方式預(yù)處理的秸稈酶解效果差異較大。以未處理的秸稈為底物酶解，葡萄糖產(chǎn)量在60 h達(dá)到最高，濃度達(dá)到11.95 g/L，而預(yù)處理秸稈酶解后葡萄糖產(chǎn)量都比未預(yù)處理秸稈高。其中NaOH預(yù)處理秸稈所產(chǎn)生的葡萄糖在60 h時(shí)達(dá)到最大濃度(33.32 g/L)，明顯高于其它預(yù)處理方式。NaOH預(yù)處理后秸稈表面結(jié)構(gòu)有明顯坍塌(圖1)，能夠增加酶與底物接觸面積。紅外光譜分析表明，NaOH預(yù)處理后，木質(zhì)素得到有效消除，有利于纖維素酶吸附到纖維素上，使得NaOH預(yù)處理后秸稈的酶解產(chǎn)糖量達(dá)到最大。H2O2預(yù)處理的秸稈酶解60 h時(shí)，產(chǎn)糖量最高(24.49 g/L)。CaO處理的秸稈酶解后在60 h時(shí)，產(chǎn)糖量最高達(dá)15.88 g/L。電鏡和紅外光譜分析結(jié)果表明，堿性H2O2和CaO預(yù)處理與NaOH預(yù)處理結(jié)果相似，都是通過(guò)不同程度地溶解木質(zhì)素，增加纖維素和纖維素酶的可及度，從而增加酶解產(chǎn)糖量。由于堿性H2O2和CaO堿性較弱，對(duì)木質(zhì)素的溶解作用不強(qiáng)，因此酶解效果比NaOH預(yù)處理差。H2SO4預(yù)處理秸稈后，酶解產(chǎn)葡萄糖量在60 h時(shí)達(dá)到最大值(21.21 g/L)，與未處理秸稈相比，糖化效果明顯提升。電鏡分析表明，H2SO4處理后的秸稈表面出現(xiàn)明顯塌陷，有利于纖維素酶附著。紅外光譜分析表明，半纖維素和木質(zhì)素等成分被去除，有利于纖維素酶作用于纖維素。熱水預(yù)處理秸稈酶解后產(chǎn)糖量在60 h時(shí)達(dá)到最大值(13.13 g/L)，相比于未處理秸稈，產(chǎn)糖量略有提升。從圖1可見(jiàn)，熱水預(yù)處理秸稈結(jié)構(gòu)基本未發(fā)生變化；秸稈的紅外光譜分析結(jié)果同樣表明，熱水預(yù)處理后，木質(zhì)素和半纖維素等特征峰的強(qiáng)度均沒(méi)有明顯的改變，即秸稈的結(jié)構(gòu)未明顯改變，糖化產(chǎn)糖效率較低。

4 結(jié) 論

采用不同方式預(yù)處理秸稈，利用掃描電鏡、紅外光譜和X-射線衍射對(duì)不同方式預(yù)處理后的秸稈微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，考察了不同的預(yù)處理方式對(duì)秸稈結(jié)構(gòu)的影響。通過(guò)纖維素酶酶解預(yù)處理后的秸稈，對(duì)預(yù)處理秸稈效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。本研究通過(guò)分析比較不同的方式預(yù)處理的秸稈，評(píng)價(jià)酶解效果，為利用秸稈高效生產(chǎn)生物化工產(chǎn)品提供了依據(jù)。